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RFX复合物;
AD
主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)是一个高度多态性的基因群。
MHC基因产物根据结构和功能的不同分为两种类型:
MHCI类和MHCII类分子。
MHCII类分子是呈现在免疫系统特定细胞表面的由α链和β链非共价键相连组成的一组高度多态性的跨膜糖蛋白[1]。
这些分子提呈经过加工的外来抗原给辅助性T细胞的抗原受体(TCR),导致辅助性T细胞激活和分化,从而在诱发免疫应答中起重要的作用。
在一些病毒感染的疾病中,病毒的某些蛋白就是通过干扰MHCII的功能,影响了正常的免疫识别[2]。
在健康的机体当中,MHCII类分子存在两种表达模式:
组成型表达和诱导型表达。
组成型表达一般只限定于免疫系统的一部分细胞中,主要包括源于骨髓的抗原呈递细胞(antigenpresentingcells,APCs)即:
树突细胞、B细胞、单核/巨噬细胞系细胞、胸腺上皮细胞和人类激活的T细胞。
大多数非源于骨髓的细胞类型一般不表达MHCII类分子。
然而一些诱导因子,其中最突出和最有效的是IFN-γ,有可能诱导这类细胞表达MHCII类分子。
IFN一对MHCII类分子的诱导表达可进一步被其它因素调节。
例如:
转化生长因子β(TGF-β)、干扰素α(IFN-α)、白介素1(IL-1)能抑制IFN-γ对MHCII类分子的诱导表达。
MHCII类分子的表达主要在转录水平上调控。
MHCII类基因表达的调控因子,主要是通过裸淋巴细胞综合征(BLS)中MHCII类分子表达缺陷的分子机制的阐明而得以解决。
BLS中有缺陷的基因的分离导致两个关键的调控因子:
CIITA和RFX复合物的识别。
1.MHCⅡ类分子表达调控
1.1MHCII类基因与蛋白结构
MHCII类基因的一个显著特点是:
结构基因和启动子元件都是高度保守的。
其转录调控区域位于转录起始位点上游的150bp片段内。
这个启动子近端调控区域含有四个顺式作用元件:
s(亦称W或Z)、Xl、X2和Y盒。
MHCII类分子是由两条非共价键相连的多肽链构成。
两条链长度都为230个氨基酸左右,结构也非常相似。
MHCII类蛋白分子可分为四个区:
肽结合区、免疫球蛋白样区、跨膜区和胞质区。
1.2MHCII类基因的表达调控
正常机体内,MHCII类分子的表达受到严密调控。
对兔的妊娠期间MHCII类分子表达的研究表明:
在妊娠维持过程中,MHCII类抗原表达受到抑制,即使IFN-γ也不能诱导其表达,分娩时滋养层细胞突然大量表达MHCII类抗原,从而激活母体的免疫系统,在其它机制的协同作用下,将胎儿娩出体外[3]。
MHCII类分子的表达水平可依细胞发育阶段不同而改变。
如:
未成熟B细胞不表达MHCII类分子,发育到成熟阶段开始表达MHCII类分子,而成熟B细胞受到抗原刺激进一步分化为浆细胞时,MHCII类分子又停止表达。
为了详细了解调控MHCII类基因转录的分子机制,许多实验室都致力于对与MHCII类基因启动子相互作用的转录因子的研究。
体外结合实验表明:
20多种不同的核因子都具有结合S、Xl、X2和Y盒的能力。
从这些功能不相关的基因中分离出MHCII类分子的转录调控基因是一项艰巨的任务。
对BLS的研究在很大程度上推动了这个问题的解决。
1.2.1BLS
BLS是由于MHCII类基因转录缺陷导致的一种主要的免疫缺陷疾病。
被世界卫生组织命名为“II类主要组织相容性复合体缺陷”,其通常被称为裸淋巴细胞综合征(barelymphocytesyndrome,BLS)。
BLS的症状在患者5周岁之前出现,主要表现为长期腹泻、吸收不良、不能茁壮成长。
患者更倾向于复发的感染,胃、肠、肺、上呼吸道和泌尿道的功能异常。
此病患者很少能活到成年,大多在6个月到5岁这个阶段死亡。
BLS患者细胞表面缺乏MHCII类分子的表达,这是相关基因不转录的结果。
然而,实验表明这种疾病的缺陷不在MHCII类基因组上,所有编码MHCII类分子的结构基因,包括它们的启动子区域都是完整的。
由此推断:
BLS是由于MHCII类基因转录中所要求的反式作用调节因子基因的缺陷所致。
为此提供的直接证据是[4]:
(1)家系研究表明与这个疾病相关的突变基因并不与MHCII类基因共分离;
(2)融合到正常MHCII启动子上的报告基因,转染入BLS病人的细胞中,仍然不能表达;
(3)在BLS病人细胞中内源性的MHCII类基因可通过细胞融合,重新激活表达。
BLS最初被认为是一种简单的表型实体。
然而,实验表明这种疾病是异质性的。
用一系列源于不同病人的体细胞融合实验发现,有些融合物能彼此互补,重新激活MHCII类基因的表达,说明病人在不同的反式调节基因上有缺陷。
根据MHCII调节基因突变体的不同,将BLS分为四个不同的互补群(A、B、C和D群),其突变基因分别为CIITA、RFXANK、RFX5和RFXAP。
1.2.2DNA结合的调控因子
1.Y盒结合因子(NF-Y):
Y盒是一个标准的CCAAT盒,与其结合的因子称为NF-Y。
NF-Y从酵母到人类都是保守的[5],由A、B、C三个亚基构成。
B、C亚基含有相似于真核组蛋白H2A和H2B的折叠位点。
2.X2盒结合因子(X2BP):
染色质免疫沉淀实验表明X2BP与MHCII启动子结合。
它与CIITA和RFX相互作用,在这个大的转录复合体上最终形成一个锚[6]。
3.RFX复合物:
早期DNA结合实验表明,BLS中B、C、D三个互补群的病人细胞中都不能正常结合一种称为调控因子X(RFX)的因子。
RFX复合物首先是从MHCII类分子阳性的B细胞的核提取物中被识别的。
在目前所有被检测的细胞中,都有RFX的表达,甚至在不表达MHCII类分子的细胞中也有RFX的表达。
RFX的纯化表明其由三个亚基组成,分子量分别为75、36和33kD。
编码这三个亚基的基因分别被命名为RFXANK(或RFXB)、RFX5和RFX辅助蛋白(RFXAP),这三个亚基之间无相关性,也没有序列同源性。
RFXANK的最小必要功能区域包括位于C端的一段由锚蛋白重复序列构成的介导蛋白之间相互作用的区域(第84-269个氨基酸)[4]。
RFXAP的最小必要功能区是一段富含Glu的C端区域[7]。
这两个区域对于RFX复合物的聚集、结合,以及MHCII启动子的激活都是必须的。
所有在B群BLS患者中发现的RFX-ANK的突变和D群BLS患者中发现的RFXAP的突变,都是由于丢失了最小必要功能区或最小必要功能区的完整性受到了破坏。
RFX5的最小必要功能区是位于其内部的DNA结合区域(DBD)和一段富含Pro的区域(第19~515个氨基酸)[8]。
其促进RFX复合物的聚集、结合及与NF-Y和CIITA的相互作用。
所有在C群BLS患者中发现的RFXANK突变都是DBD区域和这段富含Pro的区域的删除所致。
与RFX5同属一个RFX家族的RFX1的RFX区域结构已了解清楚[9],共属于螺旋一转角一螺旋(helixturn.helix,HTH)蛋白中的翼状螺旋亚家族。
有趣的是,RFX1DBD结合DNA的方式不同于目前所有已知的其它HTH蛋白,它是通过b-发夹结构来识别结合位点,而不是通过螺旋结构来识别。
RFX1DBD特异性结合位点中的氨基酸序列与RFX5高度保守,推测后者也可能是以同样的方式与Xl盒结合。
所有的RFX的三个亚基都能够交叉结合到DNA的Xl盒顺式作用元件上[10]。
RFX复合物除特异性的结合到Xl元件上,也能结合到Z/W/S元件上。
RFX主要有三个作用[11]:
(1)促进其它转录因子与MHCII启动子的结合。
实验表明X2BP、NF-Y与其作用位点的结合是依赖于RFX与X盒的结合;
(2)增强启动子结合的特异性。
确保X1、X2、Y盒分别与RFX、X2BP、NF-Y结合,而不是与其它体外实验表明有较低亲和力的蛋白结合;
(3)其与X2BP、NF-Y共同作用构成一个供CIITA结合的平台,保证CIITA能正常发挥作用。
1.2.3不直接与DNA结合的调控因子CIITA
与MHCII启动子的DNA结合因子的泛在表达模式相比,编码CIITA的基因MHC2TA的表达是被严密调控的。
大多数情况下,CIITA的表达决定了MHCII是否表达及在何种水平上表达。
这一点由有力的证据证明:
在人类T细胞中,MHCII类分子表达的激活及诱导是由MHC2TA表达上调介导的。
相反,激活的小鼠T细胞并不表达MHC2TA,因此保持MHCII类分子阴性;
CIITA对MHCII类分子的表达进行量化控制。
大量人类和小鼠细胞系及组织的分析表明:
MHCII和MHC2TA的表达水平之间存在严密的相关性;
核糖核酸酶P能剪切CIITA,从而高效诱导抗原特异性耐受[12]。
CIITA在IFN-γ诱导的MHCII类分子表达中有类似“主导开关”的作用。
Kadota等[13]的实验结果表明:
在胸腺瘤的胸腺上皮细胞中,由于IFN-γ对CIITA诱导的不充分导致HLA-DR表达上调很微弱。
Kwak等[14]研究表明:
在人类主要的上皮细胞中,simvastatin通过CIITA的作用选择性地减少IFN-γ诱导的MHCII类分子的表达。
在早期的肿瘤细胞中发现:
MHCII类分子表达很低或不表达。
这是由于CIITA的启动子被甲基化,不能被IFN-γ激活。
一旦CIITA的启动子去甲基化后,CIITA表达正常,相应的MHCII类分子的表达亦恢复正常[15]。
CIITA有四个主要特征:
(1)富含酸性氨基酸的N端区域;
(2)与酸性区域相邻的富含Pro、Ser、Thr的区域(PST);
(3)中央有一个GTP结合区域,由三个位点构成:
参与与核酸结合的WalkerA位点,与Mg2+结合位点相似的一段区域,和有可能赋予GTP特异结合的一段序列;
(4)C端附近有一段富含Leu的重复序列(LRR)。
CIITA这四个特征在人类和小鼠是保守的,也是其激活MHCII启动子所必要的。
也有实验证明,CIITA的N端酸性区域和PST区域是转录激活区域。
然而,CIITA的激活区域如何启动转录,仍是一个有待探讨的问题。
目前至少已有三种机制提出:
(1)CIITA能与通用的转录因子TA-TA结合蛋白(TBP)、人类的TBP辅助蛋白hTAFII32和hTAFII70相互作用,表明它能通过一般的转录机制激活转录起始;
(2)CIITA通过与转录因子TFIIH或转录延伸因子P~TEFb相互作用[16],促进RNA聚合酶II离开启动子,起始转录或转录延伸;
(3)CIITA通过聚集具有组蛋白乙酰转移酶的辅助激活子CREB结合蛋白(CBP),可以促进染色质的变化[17]。
这个机制可能解释了在一定的细胞类型中,CIITA可以促进DNA结合蛋白与MHCII启动子的结合。
这三个机制并不互相排斥,CIITA能作为几个在不同水平上激活转录的因子结合的支架。
CIITA并不直接与MHCII的启动子结合来激活转录,它通过C端直接与结合到MHCII启动子上S、X1、X2、Y的因子相互作用,N端的转录激活区发挥激活MHCII类基因转录的作用。
1.2.4MHCII类基因的转录激活
上述的因子激活转录是一个互相协作的过程。
第一步是转录因子结合到DNA上。
RFX与X2BP首先结合,形成RFX-X2BP-DNA复合物,NF-Y的加入更加稳定了这种作用。
第二步是RFX-X2BP-NF-Y-DNA复合物与CIITA瞬时或稳固的结合。
一旦结合,CIITA通过它的酸性激活区域激活转录。
1.2.5IFN-γ对MHCII类分子的诱导机制
IFN-γ诱导MHCII类分子表达的整个信号转导过程已被初步阐明。
在许多种细胞系和主要的细胞类型中,包括单核白细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞和上皮细胞。
IFN-γ主要激活MHC2TA基因的PIV启动子。
IFN-γ诱导PIV的激活依赖于三个顺式序列(一个GAS元件,一个IRF结合位点和一个E盒)。
IFN-γ与其受体相互作用激活Jakl和Jak2激酶,引起STAT1的磷酸化,形成二聚体并转位进细胞核内。
STAT1与USF-1协同作用结合到MHC2TA基因PIV启动子的GAS/E盒上[18]。
STAT1也能激活IRF-1的表达,STAT1和IRF-1这两个转录因子都可以介导其它系统中IFN-γ诱导的基因表达[19]。
IRF-1随即结合到PIV启动子的相应位点上。
被STAT1、USF-1和IRF-1激活的PIV启动子导致CIITA的表达,进而激活MHCII类基因的表达。
2.MHCⅡ类分子与自身免疫性疾病
2.1MHCII类分子与几种常见的自身免疫性疾病
2.1.1胰岛素依赖型糖尿病(insulindependentdiabetesmellitus,IDDM)
IDDM是由于胰岛内淋巴细胞浸润导致分泌胰岛素的β细胞的破坏所致。
自1980年以来,很多实验都显示,在白人中,95%的IDDM患者都带有DR3和DR4,而对照组中却只有45%~54%。
近年来,应用分子生物学技术研究发现,与HLA-DR呈紧密连锁不平衡的HLA-DQ比HLA-DR与IDDM有更强烈的关联。
Todd等[20]证实,导致与IDDM有强烈关联的HLA-DQ的等位基因为DQB1,其在发病中起重要作用的是编码的β肽链上第57位的天冬氨酸(Asp-57),如果第57位上不是Asp,那么白人中IDDM的发病率将明显升高,而如果第57位上是Asp,那么其发病率将明显下降。
因此,他们提出:
在IDDM中,β链上第57位的氨基酸(是否为Asp)决定着DQ分子的功能。
1990年,他们在日本人群中进行研究再次证明Asp-57作为一种抗性固子在1DDM发病中的重要作用[21]。
日本人IDDM的主要易感单体型都带有DR4和DR9,DNA序列分析表明这两种单体型都含有编码Asp-57的DQBl等位基因。
通过寡核苷酸斑点杂交分析显示;
除了一个病人外,全部的实验组和对照组至少都带有一个编码Asp-57的DQB1等位基因,除此之外,实验组有40%对照组有30%带有纯合的编码Asp-57的DQBl等位基因,其编码Asp-57的DQBl等位基因频率如此之高,正好说明了日本人IDDM发病率低的缘故。
不过,Asp-57(-)的单体型并不总是表现为IDDM易感性,相反,有些Asp-57(+)的单体型似乎也与IDDM相关。
HIA-DR3和-DR7的单体型两者通常都带有能编码Asp-57的DQB1*0201等位基因,结果DR3-DQBI*0201单体型与IDDM呈正相关,而DR7-DQB1*0201则否。
为了解释这种现象,Khalil等[22]在进一步证实Asp-57(-)的DQβ链的重要性的基础上,又提出在第52位带有精氨酸(Arg-52)的DQα链可能也对IDDM易感,并认为DQβAsp-57和DQαArg-52两种氨基酸残基组成的DQαβ异二聚体对疾病易感性的调节可能起决定性的作用。
研究IDDM的最好的动物模型是非肥胖性糖尿病(non-obsediabets,NOD)鼠,这种鼠的MHCII类基因有两个特点:
1-E分子缺乏和I-A分子独特(I-ANOD)。
在I-A分子中,β链上第57位的氨基酸不是Asp而是丝氨酸(Ser)。
为了证实Asp-57(-)是否与NOD鼠自发糖尿病有关,Miyazaki等[23]利用转基因鼠进行研究,他们发现所转的I-A的表达能有效防止这种NOD转基因鼠胰腺受损。
这种保护作用不仅见于当I-A口链上的第57位为Asp时,而且当57位为Ser时亦如此这个结果表明I-Aβ链上第57位单个氨基酸的替换(Ser替换Asp)还不足以用来解释这种疾病的发生原因。
2.1.2类风湿性关节炎(rheumatoidarthritls,RA)
RA在遗传学上是与MHCII类特异性等位基因相关联的一种自身免疫性疾病。
1977年,McMichael等[24]首先报道RA与DR4有关,随后的大量研究证实了这种推测,只是DR4与RA关联的程度各人报道有异,其原因可能在于所研究的病人的基因杂合性,当尽可能为纯合子时,免疫遗传的易感性就强。
Nepom等[25]利用寡核昔酿探针杂交技术研究了一组41名白人RA病人,其中26人(63%)带有DR4抗原,而在DR4(+)组中,带有Dw4(DNA分型为DRB1*0401)21人,Dwl4(DRBI*0404)11人,有6人同时带有Dw4和Dwl4,而健康人对照组Dw4或Dwl4的携带率为2l%。
在l5名DR4(-)的病人中,携带DR1等位基因者有9人(占13%)(对照组为22%),和对照组相比,虽然DRI的绝对频率并没有升高,但是,DR4(-)的病人中,携带DRI的比例本来就很低。
2.1.3奎身性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)
SLE的确切病因尚不清楚,已经肯定:
遗传因素在其发病中起了很重要的作用。
Hartung等[26]很早就报道,在白人中,SLE与HLA关联的抗原是B8,DR3和DR2,有些人认为只有DR2有关,另一些人认为只与DR3有关。
Hirose等[27]于1988年报道:
在日本人群中,DR2/DR4杂合子与SLE关联,并证明DR2为日本人群中的易感基因。
Fouad等[28]报道在科威特病人中最常见的表型是A3、DR2,DQ1为保护基因。
Z.Yao等[29]在德国人群中进行研究,发现DPB1*0101的频率显著增高,但最终的结果显示DPB1*0101与HLA-B8、DR3单体型关联,并提出HLA-B8、DR3比DPB1*0101对SLE的易感有更重要的作用。
对MHC分子在SLE发病中的作用的研究还仅仅只限于动物模型。
最广泛用于研究SLE的动物模型为(NZB×
NZW)F1代小鼠,这种小鼠能自发地产生与人类SLE非常相似的自身免疫性疾病。
Adelman等[30]利用抗MHCII类分子的McAb治疗这种F1代小鼠,能够延缓其IgG抗体的出现,即使发病后,也能降低IgG的滴度,这说明,亲代来源的MHCII类分子在发病中可能起了一定的作用。
2.1.4重症肌无力(myasteniagravis,MG)
MG是少数几种AD中靶抗原已经明确,其结构和生物化学指标都已明了的一种。
它是由于存在对抗骨骼肌内神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体的自身抗体,引起神经肌肉传递功能异常而导致受累骨骼肌易产生疲劳,肌张力与收缩力减退。
最先放报道与MG相关联的HLA抗原为HLA-B8,随后发现HLA-DR3与该病呈正相关,不过,HLA-DR3总是与B3呈连锁不平衡。
Matsuki等[31]通过对日本人群进行研究,发现DR9和DR13频率升高。
Carlsson等[32]利用RFLP方法证明了非胸腺瘤MG患者DR3-Dw24单体型频率增高Spurkland等[33]利用SSO方法显示DQB1*0201等位基因与该疾病呈正相关。
Lepage等[34]提示由DQAl*01(*0101、*0102、*0103)-DQB1*0201和DQAI*0l-DQB1*0301等位基因编码的DQαβ异二聚体可能是MG的易感分子,而且已观察到与DQB1*0201和DQBl*0301等位基因呈连锁不平衡的DQAl*0501也与MG相关联。
2.2MHCII类分子在自身免疫中的作用机理
自身免疫的过程是机体免疫系统对自身抗原发生免疫应答的过程。
在正常情况下,机体对自身抗原产生负应答(即免疫耐受),以保护机体自身组织不受损伤。
而免疫应答的初始过程,是T细胞识别抗原导致T细胞活化的过程。
这种识别要受到MHCII类分子的限制,也就是说,机体免疫细胞在识别异已或自身抗原时,必须同时识别抗原提呈细胞表面的MHCII类分子才能被活化。
MHCII类分子由α、β两条异源性重链组成,其分子量分别为34KDa和29KDa,两链通过非共价键结合,它们都有胞外区、跨膜区和咆内区。
胞外区各有两个功能区,即αl、α2和βl、β2。
αl和βl为可变区,各有4条β折叠及一个α螺旋肽段,共同构成赋链的抗原结合槽(groove),这两条α螺旋构成抗原结合槽的两个侧面,8条β折叠肽段构成抗原结合槽的底面。
MHC基因最显著的特征就是多态性。
在II类分子中,那些易变的氨基酸残基大部分都集中于αl和βl区。
而且,这些多态性的氨基酸残基主要分布于3到4个不连续的高变区内。
Bjorkman等[35]认为正是这些残基才能与肽类抗原和TCR发生接触并相互作用。
因此,等位基因高变区的多态性就能够改变MHC分子、TCR、抗原之间相互作用的特性,并因此控制对外来抗原(可能也对自身抗原)的免疫应答。
由于某些与疾病关联的关键性氨基酸残基位于这个槽内,很明显,在这些部位的任何氨基酸的非保守性变化均能改变抗原结合槽的结构并影响II类分子的功能。
某些自身免疫性疾病,其关联的HLA单体型不只一条,这可能是因为易感的II类等位基因编码的肽链中有特殊的表位的缘故。
MHC分子在自身免疫中的作用可能有以下几点:
①MHC通过提呈错误抗原来启动自身免疫过程。
②可能存在具有抗自我反应性的T细胞,其抗自我反应特性必须通过MHC分子和多态性自身抗原结合能够逃避胸腺的阴性选择才能表现出来;
或者,由于有一种易感的MHC等位基因所编码的某些关键性的氨基酸残基的提呈,使得自我反应性T细胞逃避了胸腺的阳性选择。
③抗特异性器官的自身免疫反应可能与靶自身抗原一MHC分子过多或异常表达有关,也与自身抗原被过多地提呈给自身反应性T细胞有关。
④局部炎症可能因为MHCII类分子的表达增强而致细胞因子分泌。
3.小结
鉴于目前对于MHCII类分子的表达机制的了解,人们试图从以下几方面解决人类所面临的问题。
(1)针对BLS的基因治疗:
同源骨髓移植是目前唯一可治愈BLS的治疗方法。
但与其它免疫遗传疾病相比,骨髓移植的成功率很低。
由于BLS中缺陷的基因已被识别,基因治疗就成为骨髓移植的替代方法。
分别将野生型的MHC2TA、RFXANK、RFX5或RFXAP基因导入A、B、C、D群BLS病人的造血干细胞,将是一个合理的治疗策略;
(2)肿瘤免疫治疗:
肿瘤由于缺乏MHCII类分子,免疫原性降低。
免疫原性和肿瘤的排斥都能通过激活MHCII类分子的表达而得到增强[36]。
因此,有望通过将CIITA导入肿瘤细胞,激活MHCII类分子表达,增强肿瘤的免疫原性,达到治疗肿瘤的目的;
(3)新免疫调节药物的研制:
抑制MHCII类分子表达对器官移植中的受体和自身免疫疾病患者是有利的。
MHCII类分子的表达调节严
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