生物化学实验报告蛋白质分子量测定凝胶层析法等Word格式文档下载.docx

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同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd等于1,它们即使分子大小有不同，也没有分离效果。

因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。

3、当0<

Kd<

1时，Ve二Vo+KdV。

表示内体积只有一部分可被组分

利用，扩散渗入，Vo即在Vo与Vo+Vi之间变化。

4、有时Kd>

1时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve>

Vo+V。

例如一些芳香化合物的洗脱体积远超过理论计算的最大值，这些化合物的Kd>

1。

如苯丙氨酸，络氨酸和色氨酸在SephadexG-25中的Kd值分别为1.2,1.4和2.2。

在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。

这是由于一部分水相与凝胶结合牢固，称为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。

此时Vi即不

能以g.WR计算，此为也常有直接用小分子物质D2O,NaCI等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。

另一个解决的办法是不使用Vi与Kd,而用Kav代替Kd,其定义如下：

已知Kd=（Ve-Vo）/Vi,Vt-Vo代替Vi,贝卩：

Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）

Va=Vo+Kav（Vt-Vo）在这里实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒Vt-Vo作为固定相，，而洗脱剂（Ve-Vo）作为流动相。

Kav与Kd对交联的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。

Ve与分子量的关系：

对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。

Ve与分子量的关系可用下式表示：

Ve二KKIogM

Ki和为常数，M为分子量，Ve也可用Ve-Vo,Ve/Vo相对保留体积，Ve/Vt或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同，通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，，称为“选择曲线”。

曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征，在允许的工作范围内，曲线逾陡，则分级逾好，而工作范围逾窄。

凝胶层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物如球蛋白类，右旋糖酐类等都有自己得特殊的选择曲线，可用以测定未知的分子量，测定时以便用曲线的直线部分为宜。

用凝胶层析法测定蛋白质的分子量，方法简单，技术易掌握，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可。

例如在一粗酶制剂中，为了测定某一酶的分子量，只要测定洗脱液中具有该酶最大活性的部分，然后测定其洗脱体积，即可从标准曲线中查出其分子量。

凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在PH6-8的范围内，线性

关系比较好，但在极端PH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。

糖蛋白在含糖量超过5%寸，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。

有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常。

用凝胶层析法所测得分子量的结果，要和其他方法测定相对照，由此可以得到可靠的结论。

凝胶层析技术操作方便，设备简单，周期短，重复性能好，而且

条件温和，一般不引起生物活性的变化，目前得到广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的分离提纯，去除热源动物以及用于测定高分子物质的分子量。

二、实验步骤

1、将实现准备好的凝胶缓慢的注入层析柱中，注意连续加入凝胶不要使凝胶柱出现断层，凝胶柱中不能出现气泡；

2、待层析柱中凝胶注满后，计算每分钟层析柱下滴液体的滴数，调

节液滴下滴速度，再计算液滴滴满2ml时所用的时间，记下该时间；

3、加样。

用胶头滴管吸取0.8ml样品（蓝色葡聚糖酶，牛血清酶，

胃蛋白酶，细胞色素C）缓慢的滴入层析柱内凝胶的表面，上面用洗脱液灌满，同时打开蛋白质核酸层析仪，设定好收集满2ml液滴所用时间。

记下依次加入样品时所收集的洗脱液的体积。

4、测定收集的洗脱液在280nm时的吸光值

5、以洗脱体积为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制选择曲线。

三、实验结果

1、吸光度测定结果

第一次加样

第二次加样

编号

吸光度

1

0.043

7

0.195

2

0.053

8

0.446

3

0.059

9

0.134

4

0.064

10

0.063

5

0.06

11

6

0.065

12

0.055

13

0.051

19

0.07

14

0.114

20

0.049

15

0.121

21

0.041

16

0.067

22

0.039

17

23

0.04

18

0.151

24

0.037

第三次加样

第四次加样

编

吸光

号

度

25

31

0.068

26

32

27

0.099

33

28

0.189

29

0.201

30

0.128

2、绘制洗脱曲线

以洗脱体积为横坐标，0D值为纵坐标绘制洗脱曲线如下

图1

3、绘制标准曲线

Ve

OD

M

IgM

200

2.30103

个

67

1.826075

峰

36

1.556303

值

58

13.7

1.136721

表2

以蛋白质分子量的对数IgM为横坐标，Ve为纵坐标，绘制标准曲线如下

70

00.511+522.5

图2

四、实验结果分析

1、实验过程中加样是很关键的步骤，加样太快容易造成重叠峰。

2、洗脱曲线四个峰值明显，表明四种蛋白质样品被有效的分开。

3、A样和B样，C样和D样之间洗脱体积差异不太大，有可能是后一个样加样时间提早了得缘故，致使两峰值之间的间距较小，会有分离不出，两峰重叠的可能。

4、根据蛋白质摩尔质量的对数和洗脱体积所作的标准曲线不是一条直线，可能是洗脱体积的误差。

如果在实验过程中，收集洗脱液时出现气泡，会严重影响洗脱体积的计算，造成洗脱体积的计算不准确，从而造成误差。

蛋白质分析仪也有可能造成机械误差。

5、从标准曲线看出，蛋白质的分子量所对应的洗脱体积偏小，最有

可能造成的误差就是在洗脱蛋白质时出现气泡。

为解决这一问题，可

以多测量几次洗脱体积，取品均值后再作图案，可以减小误差。

实验二小麦种子储藏蛋白一HMW-GS的分离（SDS-PAGE）

一、实验目的

利用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）研究小麦种子储藏蛋白C咼分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）组成结构。

此外，SDS-PAGE也是测定蛋白质亚基分子质量的常用方法。

通过本实验，掌握SDS-PAGE的基本原理、技术及应用。

二、实验原理

用十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（巯基乙醇或二流苏糖醇）热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键被还原，解离的亚基与SDS发生定量结合后使得蛋白质亚基带上大量负电荷，从而掩盖了蛋白质各种亚基间原有的电荷差异。

亚基的构象均呈长棒状，各种蛋白质亚基-SDS复合物表现出相等的电荷密度，在电场中迁移速度仅与分子量有关。

因此，SDS-PAGE可以用来分离蛋白质亚基并测定其分子质量。

三、实验器材及试剂

1•仪器

电泳仪、垂直板电泳槽、台式高速离心机、脱色摇床、加样枪、烧杯

50ml2个，移液管

2试剂和材料

70%乙醇、50%正丙醇（含2%B-巯基乙醇）250ml、样品提取缓冲液、样品提取液、30%丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺、分离胶缓冲液

（Tris-HCI）pH8.8、浓缩胶缓冲液（Tris-HCI）pH6.8、10%AP溶液、

染色液、漂洗液

四、操作步骤

1样品的提取

（1）取一粒种子研磨粉碎，加入70%乙醇1000ul,10分钟后，12000转离心8分钟；

弃乙醇晾干。

（2）力口50%正丙醇（含2%B-巯基乙醇）250ul混匀后，50C水浴

1.5小时，中途需震荡，12000转离心8分钟。

（3）取上清夜加3倍体积丙酮置于-20C>

3小时。

（4）12000转离心8分钟，倒掉丙酮晾干，加提取液250ul，待溶解完全后，在沸水浴煮沸2.5分钟，之后12000转再离心1分钟，上清液用于点样。

2、SDS-PAGE分析

（1）组装电泳槽：

见电泳槽使用说明书

（2）凝胶的制备：

取两只干净烧杯（500ml）标号，按下表试剂配方惊醒制胶。

在组装好的电泳槽中先制分离胶，待分离胶聚合后，倒掉乙醇溶液，再灌浓缩胶，灌好浓缩胶后迅速插入样品梳静置聚合。

分离胶用量

15ml，浓缩胶用量5ml。

表1凝胶的制备试剂配方

聚丙烯酰胺凝胶组成

分离胶（10%）

浓缩胶（3%）

30%Acr-Bis（ml）

2.5

0.62

H2O

2.95

3.0

pH8.8Tris-HCL（含SDS、2.0

TEMED）（ml）01.3

pH6.8Tris-HCL（含SDS、10075

TEMED）（ml）

10%AP（ul）

（3）加样及电泳

待凝胶聚合完全后，拔掉电泳梳子，然后将电泳槽注满电泳缓冲液，取适量上清液加样，在标准泳道点是上高分子标准蛋白质溶液。

上槽接负极，下槽接正极，恒流200mA电泳。

待溴酚蓝走出分离胶后30分钟停止电泳，取出玻璃板，剥胶染色。

（4）染色

剥下的胶用蒸馏水洗涤后加入染色液，盖上盖子，放入微波炉低温染色4次，每次1分钟，取出震荡，取出。

（5）脱色

将染色液倒回瓶内，加入漂洗液洗，漂洗两次，每次1-2小时，

照相保存。

5.实验结果分析

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得到四条大小不同的条带分离出蛋白质亚基并可知道其亚基的分子量，条带不是很平整可能是梳子没有插好，导致点样不好，也可能是本身做胶就不够好，使得条带不够整齐清晰。

实验三猪血中超氧化物歧化酶（SOD的分离纯化及活力测定

通过本次实验熟悉掌握超氧化物歧化酶（SOD的分离纯化方以

及SOD舌力的测定。

二、实验原理：

超氧化物歧化酶（SOD是一种能专一地清除超氧阴离子自由基（O-）的金属酶，它具有抗衰老，抗辐射、抗炎和抗癌等作用，因而在医药、化妆品、食品工业具有广泛的应用前景。

SOD是一种酸性蛋白，对热、PH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。

按照它含的金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SODMn-SODFe-SOD等三种。

Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；

Mn-SOD呈紫色；

Fe-SOD呈黄褐色。

SOD催化下述反应：

2HT+2Q-—H2Q+Q。

机体内Q-的过量和不足均对机体不利，SOD对过量的Q-的及时清除保证了机体内O-的含量的相对平衡。

机体内Q-的形成可分为生理性和病理性两方面。

在一些正常生理过程中会形成一些O-。

例如：

呼吸链中电子传递结果可产生一些Q-。

在某些疾病过程中会产生大量的Q-。

过量的Q-如不及时清除，会对细胞损伤。

SOD将Q-歧化为H2Q,而过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化过氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。

本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。

酶活力测定可以用一下方法：

邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤

氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸

该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：

每毫升反应溶液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化率达50%勺酶量定义为一个酶活单位。

样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。

考马斯亮蓝

G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈蓝色。

在一定的范围内，溶液在595nm波长下光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，在测定范围1-1000ug。

SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离。

用

“负”显色法，核黄素经光照所产生的活性氧O-（氧自由基）能使

氯化硝基四氮唑蓝（NBT由黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。

由于SOD能够抑制O-的作用，因此，经电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处显色为蓝色，而有SOD处则无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱。

三、操作步骤

1、SOD勺提取

（1）取新鲜猪血20ml（预先按0.5:

1的比例加入ACD抗凝剂），

4000r/m,10min,去上层血浆，取下层红血球粘稠液，并量其体积，

然后加入2倍体积的0.9%NaCI溶液清洗，4000r/m,10min,弃上清液，得洗净的红血球浓稠液。

（2）向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min,

使其充分溶血。

再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%

的乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，均匀呈暗红色，再继续搅拌15min,4000r/m，10min,去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样2ml。

然后将清液在65-70°

C恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却至室温，4000r/m，5min，除沉淀，得浅黄色粗酶液，留样2ml。

（3）向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱中静置4h，4000r/m，10min弃上清液，得沉淀。

将沉淀物用等体积的丙酮溶液洗二次，离心收集沉淀，自然干燥既得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，备用。

2、SOD舌力测定

（1）邻苯三酚自氧化率的测定

取4.5ml50mmol/LPH8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml10mmol/LEDTA-Na溶液，混匀后在25°

C水浴保温20min,取出后立即加入25°

C预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mmol/LHCI作空白，325nm波长下每隔30s测定光密度值一次，整个操作在4min内完成，计算出每分钟A25的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。

要求自氧化速率控制在0.07/mim左

右。

（2）酶活力测定

操作与

（1）基本一致，加入邻苯三酚前，先加入0.1ml的SOD羊液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光密度值，计算加酶后邻苯三酚

自氧化率

（3）酶活性单位的计算

根据酶活单位定义，按下列公式计算酶活性：

单位活性（U/ml）=（（（Ao-Am）/Ao*1OO%）/5O%）*反应液总体积数*（样

液稀释倍数/样液体积）

总活性（U）二单位活性测定*酶原液总体积

（4）蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）

标准曲线的制作：

取6支试管，编号，按下表加试剂：

表1.各试管加样量及对应蛋白质含量

试剂

管

蛋白质标准液（ml）

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

蒸馏水（ml）

考马斯亮蓝G-250（ml）

蛋白质含量（ug）

40

60

80

100

盖上塞子，摇匀。

注意各管振荡程度尽量一致。

在595nm波长下比

色测定光密度，比色应在1h内完成。

以牛血清蛋白含量（ug）为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。

样品中蛋白含量的测定

将待测的SOD溶液并稀释到一定浓度，取1支具塞试管，准确加入0.1ml样品提取液，加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝G-250试剂,其余操作与标准曲线制作相同。

蛋白质含量计算

根据所测样品提取液的光密度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含

量，计算其浓度。

三、实验结果

1.测得邻苯三酚自氧化率：

表3

时间（min）

0.5

1.5

3.5

A

0.018

0.060

0.098

0.167

0.200

0.232

0.261

图3

计算得：

Ao=O.O69/min。

酶活力测定中三个不同量样液的光密度值见下表:

表4

样1（50卩l）

0.208

0.217

0.225

0.242

0.249

0.258

0.264

样2（100l）

0.073

0.079

0.084

0.088

0.093

0.104

0.054

0.057

0.061

0.062

「A。

®

A。

10°

%反应液总体积

50%

样液稀释倍数-样液体积

计算（方法同1）得：

Ai=0.016/min；

A2=0.0103/min；

As=0.004/min。

酶活性单位的计算：

单位活性（U/ml）

表5

样液体积（ml）

酶原液总体积（ml）

Am

总活性（U）

样1

0.05

0.016

314.8936

4408.511

样2

0.1

12.5

0.0103

172.6064

2157.58

样3

0.004

189.3617

946.8085

（1）标准曲线的制作

表4.标准曲线制作各试管加样量及光密度值

光密度值（A595）

0.174

0.341

0.452

0.620

0.729

v=0.00~4x-0.014S

=0.9925

蛋白质含量磚

图2.蛋白质含量标准曲线

（2）样品蛋白质含量

样品光密度测定值及蛋白质含量的计算结果如下表:

表6

样号

A595平均值

蛋白质含量（卩g

蛋白质浓度（g/）l

0.287

36.63186

1.8316

0.171

19.17618

0.1918

0.1185

11.27598

0.1128

（3）数据处理

表7

提纯步骤

酶液总

蛋白质

酶活性

总活性

比活性

回收

纯化倍数

体积ml

mg/ml

U/ml

U

U/mg

率%

除血蛋白上清

4408.51

171.92

热变性后上清12.50.1918172.60642157.58899.9348.945.23

丙酮沉淀后0.0117（g）0.1128189.3617946.811678.7421.489.76

1、蛋白质含量标准曲线不是一条直线，可能是由于分光光度计的读数误差，也有可能是认人为误差。

解决方法，可以多次测量取平均值，再舍去离标准曲线较远的点，使标准曲线两边的点数目尽量一样多，再绘制标准曲线，这样就可以减少偶然误差。

2、样品一的蛋白质含量过高，从后面的电泳图也可以看出样品1混

有杂质，说明分离SOE同工酶时细胞可能有溶血。

里面含有杂质，所以吸光值较大在标准曲线上所对应的蛋白质含量就过高，所以样品1

的蛋白质含量不准确。

3、表3中邻苯三酚的自氧化率没有达到0.07/mim,可能会对后续实验结果造成影响，最大的影响就是