左旋多巴的生产Word格式.docx
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西北工业大学的晓莉用可避免DL
拆旋操作的不对称合成法合成左旋多巴,
但工艺非常复杂。
1913年就有人从蚕豆籽苗种豆荚中提取天然L-DOPA,1949年从野生植物藜豆中提取出L-DOPA。
国于1972年从豆科植物藜豆种子中提取L-DOPA获得成功,1974年商品L-DOPA投放市场。
从猫豆中提取L-DOPA的得率,从1.5%已提高到3.25%。
但是从植物中提取L-DOPA由于受到原料来源的限制,产量小,远不能满足市场需求。
60年代末,国外一些学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。
70年代初,日本学者Yamada等对微生物酶法合成L-DOPA进行了深入的研究,通过菌种选育及发酵条件的优化于1993年在味之素公司投入工业化生产。
目前国外L-DOPA的产率超过100mg/mL.80年代后期,大学的珍荣等在国首先开展了微生物法合成L-DOPA的研究,但至今国尚未有工业化的报道。
虽然现在国有多家制药厂生产L-DOPA及其药剂,但大都是从植物中提取的。
1.4
左旋多巴的应用前景
多巴的衍生物多巴胺是一种重要的神经递质,但多巴胺不能通过血脑屏障而进入脑组织,而L-DOPA可以通过血脑屏障,在脑组织中可脱羧形成多巴胺,可增加多巴胺含量而达到治疗帕金森氏病的功效。
L-DOPA还有其他许多用途,可用来治疗腿多动综合症、肝昏迷、CO中毒、锰中毒和精神病、心力衰竭、溃疡病、脱毛症、调节人的性功能等。
帕金森病是一种因大脑多巴胺匮乏引起的神经系统疾病,
其典型症状为震颤、肌强直、运动减少和姿式异常。
60
年代以来,
多巴胺的前体—左旋多巴一直是治疗帕金森病的主要药物。
随着我国人口老龄化速度的加快,对L-DOPA的需求将迅速增加,据1993年国家对消耗外汇的100种药物的统计,L-DOPA的进口总金额居第17位。
而目前国市场上的L-DOPA来源绝大部分依靠进口,如何能使微生物法合成L-DOPA在国投入工业化生产是一个急待解决的问题。
运用现代生物技术对菌种进行改造,期望获得高效表达酪氨酸酚解酶的菌株对于提高L-DOPA的产率是非常重要的。
另外,固定化细胞法的进一步研究,可提高生产的连续性、稳定性、高效性。
虽然L-DOPA的提取方法有多种多样,但L-DOPA易于氧化,这样给提取带来许多不便。
又由于L-DOPA大都被用作药来治疗帕金森病,因而对此纯度要求很高,这样对下游提取技术提出更高的要求。
L-DOPA作为药物被研究开发成为一个世界性的问题,亟待科研工作者的深入研究。
2
左旋多巴的生物转化途径
左旋多巴由芳香族氨基酸L一酪氨酸苯基的3
位上添加一个羟基而成,
可由一种或几种前体在单一酶催化下转化得到。
因生产或研究中所用催化剂(酶或徽生物)
种类不同,
左旋多巴合成途径也不同,
一般有以下几种:
2.1Tyrosinase转化法
Tyrosinase(E.C.1.14.18.1)即酪氨酸酶,
以铜离子为辅助因子,
兼具单酚醛化作用和二酚氧化还原作用,
在生物体能催化黑色素的合成,
其中L一Tyrosine(L一酪氨酸)—L一DoPa
是黑色素合成过程的中间反应。
1989年,
大学的荣珍等用假单孢属细菌以酪氨酸为前体生产左旋多巴,
日本的Tanaka和大学的王烨等还使用诱变育种的方法提高菌种产酶性能以改善生产。
以上研究结果普遍表现为左旋多巴的生产强度不高或酪氨酸的转化率较低,
可能与菌种产酶性能及前体酪氨酸在水相体系中的低溶解度有关。
2.2TyrosinasephenoLLyase
转化法
TyrosinasephenoLLyase(E.c.4.1.99.2,又称β一Tyrosine)
即酪氨酸酚解酶,
该酶需以磷酸毗多醛(胺)
为辅酶,
以钾离子和氨离子为辅助因子,
能催化一系列β一取代反应和可逆催化α,β一消除反应,
如:
邻笨二酚+L(D)一丝氨酸—
L一多巴+
水
邻苯二酚+
丙酮酸+
氨一
当反应体系中氨离子浓度较高时,
有利于反应朝合成方向进行。
自然界中的许多细菌,
尤其是Escherichia(埃系氏菌属)、proteus变形菌属和Erwinia(欧文氏菌属)具有酪氨酸酚解酶的合成能力,
其中的Erwinia
herbicoLa(草生欧文氏菌属)在研究中使用最多,
日本的Yana
等曾对Erwinia
herbicoLaATCC
21434
合成左旋多巴进行了广泛而深入的研究,并取得了很好的结果。
另外,SymbiobacteriumthermophiLum
等菌也有酪氨酸酚解酶的合成能力。
左旋多巴的前体在较高浓度时对酶活都有抑制作用,
其中邻苯二酚及丙酮酸除了有强抑制作用外,
还会导致酶的不可逆失活,
加人等摩尔硼酸根离子可减轻邻苯二酚对于酶的失活作用,
但邻苯二酚—硼酸复合物的存在会增强对酶的抑制作用。
由上述反应式可知,
以丝氨酸、邻苯二酚为前体(需氨存在)或以丙酮酸、邻苯二酚及氨为前体均可转化生成左旋多巴,
两者的差别在于丝氨酸与丙酮酸。
以丙酮酸为前控制前体浓度和反应液pH
及温度可减少副产物的生成;
以L(D)一丝氨酸为前体时,
对酶活影响较小,但反应时有部分转化为丙酮酸导致其转化率降低,另外,D一丝氨酸的转化率比L一丝氨酸低。
2.3Transaminase
Transaminase(转氨酶)可将L一Asp或L
一GLu
上的氨基转移到3,4
一二羟基苯丙酮酸(DoPP)
上生成L一Dopa。
Nasasaki等在这方面做了较多的工作。
目前,
在研究中多采用1
法和2法,
途径3
少见报道。
尚未有人对1、2
两种方法进行比较。
从现有数据看,
采用TyrosinasephenoLLyase途径时产物浓度和前体利用率均较高,但由于前体具有毒性,
生产过程稍为复杂、操作要求较高;
如能获得高酶活菌株,
采用Tyrosinase
途径或许更有利于实际应用。
3
左旋多巴的生产方法
3.1L-DOPA的化学合成
1911年人们首次利用3,4-碳酰二氧苯甲醛为原料化学合成多巴,后来人们还利用胡椒醛、香草醛、儿茶酚、酪氨酸来合成L-DOPA。
国还有人用的D-麻黄碱拆分N-乙酰-3-(3,4-二甲氧基苯)-DL-丙氨酸来合成L-DOPA,70年代初,国外化学合成多巴的产量已达150吨。
由于L-DOPA会引起毒性反应,因此医学上需控制它的旋光度。
1990年,西北大学的晓莉用不对称催化法合成L-DOPA,但过程复杂难以工业化。
3.2
从植物中提取L-DOPA
植物中的天然DOPA都是L-型的。
从植物中提取L-DOPA由于受到原料来源的限制,产量小,远不能满足市场需求。
3.3
微生物酶转化法生产L-DOPA
人们利用微生物生产L-DOPA,就是利用了代途径中的某些酶,如酪氨酸酶、酪氨酸酚解酶、转移酶将不同的底物转变成L-DOPA。
获得大量的L-DOPA,许多国家对其生产进行了大量的研究,采取了许多不同的合成方法。
3.3.1
徽生物一步发酵法
微生物一步发酵法是在细胞繁殖、酶合成相偶联的微生物生长后期调节发酵液pH值和温度,
然后加入前体,
经酶转化反应来生产左旋多巴的方法.Tanaka
等进行产酪氨酸酶微生物合成多巴的研究后认为,
为提高前体转化率可采用分批加入酪氨酸的方法,为防止生产过程中左旋多巴进一步反应可在反应液中加入适量抗氧化剂如抗坏血酸。
一步发酵法操作简单,
但有明显缺陷:
发酵液成分极其复杂,
为产物的提取带来极大的不便。
3.3.2
微生物两步发酵法(悬浮细胞法)
此法第一步为微为物生长和胞有关酶的诱导合成过程,
以获得高比活(活力单位/单位体积发酵液)培养物为目的,
此过程同1法;
第二步为离心洗涤得到的含酶悬浮细胞将前体转化为左旋多巴的过程,
以提高左旋多巴浓度和前体的转化率为目的。
以产酪氨酸酚解酶微生物合成多巴时,
在生长培养基中添加少量诱导物(如L
一酪氨酸)和辅酶磷酸毗哆醛及辅助因子K可大大提高酶活,在转化反应时加人适量Na+
和EDTA
可增加产物稳定性。
此法跟一步发酵法相比,增加了设备和操作步骤,
但因只有前体参加反应,
反应液杂质少,
有利于简化后提取工艺,
终产品收率高、纯度高;
跟固定化方法相比,
虽然难以重复使用菌体,
但游离细胞的起始酶活高且操作相对简单。
因此,
在研究中常采用二步发酵法。
3.3.3
固定化酶法
首先从含酪氨酸酶或酪氨酸酚解酶菌体细胞(或其它生物体)中提取纯酶,
固定化后作催化剂合成左旋多巴团。
此法可反复利用催化剂并可实现连续生产,
利于提取。
但也存在一些缺点:
酶的提取工艺夏杂,
在提取和固定化过程中均会导致酶活的大量损失,
酶的提取过程中易失去保持活性必需的辅酶,需在反应液中重新添加。
所以,出现固定化细胞技术后,已很少有固定化徽生物来源的酶生产左旋多巴的报道。
近来,有人采用固定化蘑菇酪氨酸酶产左旋多巴,
还有人用固定化酪氨酸酶净化含苯废水。
3.3.4
固定化细胞法
左旋多巴为胞外产物,
其前体都是小分子,
可自由进出微生物细胞,
这是进行固定化细胞生产的前提。
固定化细胞法较固定化酶法有显著优点:
省去酶的提取过程,
制作大为简化,
且保留酶活高;
反应过程中酶受到细胞膜的保护,不易受到外部物理化学因素及杂菌污染影响,
可延长酶活半衰期。
理论上,
固定化细胞法生产左旋多巴兼具二步发酵法和固定化酶法的优点,
事实上,
许多研究者进行了固定化细胞法合成左旋多巴的研究:
Para
等分别利用固定化E.intermediaATCC
21073和E.intermediaATCC
21433细胞合成左旋多巴,
在载体的选择和酶负荷的确定、底物抑制及失活下的酶反应动力学和酶反应器等方面进行了广泛研究;
最近,LanLLoyd
一George等还作了微胶囊化E.intermediaATCC
细胞的研究。
但由于几种底物对酶的抑制及失活作用,固定化细胞可重复或连续使用的优势得不到明显体现。
(见表1)
表L
采用不同碗类、前体和生产方法合成左旋多巴的研究水平比较
酶
菌种
前体
生产方法
反应时间
产品浓度(g/L)
生产强度(g/L*h)
TPL*
E.herbicoLa
丙酮酸氨邻苯二酚
两步法
48h
58.5
1.26
TPL
丝氨酸氨邻苯二酚
51.0
1.03
重组大肠杆菌
30h
29.6
0.99
固定化细胞
连续50h
0.13
0.013
分批20h
7.88
0.39
Tyrosinase
P.meLanogenumATCC17806突变株
L-酪氨酸(转化率<
50%)
一步法
15h
21.0
1.40
假单孢属细菌
L-酪氨酸(转化率>
90%)
7.5
0.50
3.3.5
植物细胞培养技术和基因工程技术的应用
近年来,
国外有人把植物细胞培养技术和基因工程技术引人了合成左旋多巴的研究领域。
Pras
等用固定化产酪氨酸酶植物细胞
MucunapruiensL.合成左旋多巴;
Fovr则以克隆有ErwiniaherbicoLaATCC
21434有关基因的重组大肠杆菌为生产菌,克隆后的大肠杆菌能以乳糖取代酪氨酸为诱导物大量合成酪氨酸酚解酶。
3.3.6利用基因工程菌合成L-DOPA
90年代初人们开始运用基因工程的手段获取TPL的基因片段,然后连接到不同的载体中让其在宿主细胞中高效表达。
90年Kurusu.Y等人构建了pGRY30-TPL1质粒,此质粒含有来自Escherichiaintermedia的酪氨酸酚解酶(I)基因。
91年Kurusu,Y等人分析了Escherichiaintermedia中TPL结构基因的核酸序列,91年Fukushima.M等人构建了pHTDI质粒,比质粒在E.coLi中能高效地表达产生酪氨酸酚解酶。
这个质粒产生的酪氨酸酚解酶的量比其亲株Escherichiaintermedia多15倍。
91年波兰的PoLak.J等人从Cfreundii中提取出TPL基因并构建质粒。
92年Hideyuki.S等人对ErwiniaherbicoLaAJ2982的TPL基因克隆到E.coLi中进行表达,再将培养的细胞转入多巴合成体系中,反应30h后,反应液中多巴含量为105mM(20.7mg/ml)。
94年,有人将编码TPL的基因克隆到质粒载体pGY1000和pGY4000中并将其转入E.coLi中进行表达,用于L-DOPA的生产。
4L-DOPA的提取
为了获得纯净的符合标准的产品,必须有适宜的L-DOPA的提取方法。
利用微生物发酵法生产L-DOPA,其最终发酵产物含有许多不溶和可溶性杂质,必须采用适当的方法除去这些杂质,分离出纯净的L-DOPA。
从发酵液中提取L-DOPA的一般步骤为:
(1)离心去掉菌体等不溶物,
(2)采用适当方法除去一些可溶性杂质,有必要还需脱色,(3)浓缩得到结晶,再采用一定的方法纯化,得到纯净的晶体。
以L-酪氨酸为底物用微生物发酵法生产L-DOPA,最后的发酵产物为棕黑色液体,要从其中提取出纯净的L-DOPA,首先必须进行脱色,活性炭脱色法的人们广为使用脱色方法。
但采用活性炭进行脱色遇到一些问题,活性炭对各种天然氨基酸具有吸附作用,对芳香族氨基酸表现出最强的吸附力,吸附率达20%左右,因此在L-DOPA提取过程中用活性炭脱色损失较大。
近来,有许多研究者研制和寻找新的替代活性炭的脱色剂。
提取L-DOPA的方法有许多,针对不同的生产方法得到的待提取液,人们采取了各有特点的方法来提取L-DOPA。
HitoshiEnei等以活性炭层析法来分离纯化L-DOPA,他们将最终发酵产物的pH用浓盐酸调至1.0,然后酸洗,水洗,最后以氨水洗脱,洗脱液经浓缩后调pH至3.5,得到沉淀以酸碱法重结晶得到纯净L-DOPA,得率为56%。
TomohisaNagsaki等最终发酵产物用10%HCI调pH至2.5;
然后离心去掉菌体等不溶物,上清液经真空浓缩后,用乙酸乙酯洗两次,调pH至4.5,放置过夜得粗结晶,粗结晶用等电点沉淀法纯化两、三次,用热水溶化,重新结晶两次,获得较纯晶体,得率为50%。
Katsujihaneda等采用Dowex50-4X(200-400目)H+-型树脂来分离L-DOPA,Kaiser,A。
等用硼酸复合物来提取L-DOPA,SeaLockR.R和Brenner.M.用铅复合物法来提取L-DOPA,但此方法步骤较多,且产品中可能有对人体有害的铅。
BLocker.P.等用液态离子交换。
Micker.D.等发现,在低于30℃的情况下,从过饱和的溶液中结晶出来的L-DOPA为针形晶体,比高于30℃情况下结晶出来的立方形晶体更纯,针形晶体在加热的情况下可变成立方体形晶体。
日本在L-DOPA的提取方面作了大量的研究,他们向反应液中添加L-DOPA的无水结晶,在25℃以下继续反应,无水结晶不断析出。
反应在25℃以上可析出一水结晶,但向其中加入无水结晶时,析出无水结晶。
5
今后研究的几个方向
国外研究酶法合成左旋多巴已有较长历史,
在培养条件和反应工艺方面的研究已很成熟,
基于国酶法合成左旋多巴的工业化目的的考虑,
我认为以后的研究主要应从以下三个方面进行:
(1)
改善菌种的产酶性能。
除了使用常规诱变育种方法外,
还应在深入了解菌种产酶机理的基础上采用代调控育种和代调控发酵的手段。
(2)
降低前体对酶的抑制和失活作用。
在以酪氨酸酚解酶为催化剂时,
所用前体对酶的抑制和失活作用是提高酶活利用率和生产强度的最主要的限制因素,为解决这个问题,
应从两个方向入手:
寻找现有前体的替代物质或对现有前体进行适当处理,
如邻苯二酚—硼酸复合物的使用:
摸索合适的反应条件和前体的流加方法,
把抑制和失活作用控制在最小。
(3)
充分发掘固定化细胞法的潜力。
固定化细胞法比较适合于由含辅助因子酶催化的左旋多巴合成反应,
但目前的研究结果并不理想为达到工业化目的,
应在固定化方法的选择(如固定化增殖细胞)、反应方式的选择和反应器的设计等方面进行深人研究。
6
总结
通过对资料的查阅,我得知自然界中的许多细菌,如嗜麦芽假单胞菌,Escherichia(埃系氏菌属)、proteus变形菌属和Erwinia(欧文氏菌属)具有酪氨酸酚解酶的合成能力,
herbicoLa(草生欧文氏菌属)经常在研究中使用。
草生欧文氏菌属:
属于杆菌属,是酷似大肠杆菌的一种细菌。
寄生于植物并引起腐败病。
由于它带有果胶多聚半乳糖醛酸酶,因而侵害植物。
但是通过对有关文献的阅读,我发现近年来有关左旋多巴的生产报导还是很少的,国在这个领域的研究与国际水平还相差很多,但是我国医药行业对左旋多巴的需求却是在不断增加,我希望在我的实验中能够通过筛选获得高效表达酪氨酸酚解酶的菌株,用以提高L-DOPA的产率,实现我国L-DOPA的工业化生产。
参考文献
[1]
洪波,坚,静,华钟,伦世仪左旋多巴的酶法合成轻工大学生物工程学院,
214036生物技术8
(2):
一8,1998
[2]
晓莉:
西北工业大学90
届研究生论文
[3]
华钟,静酪氨酸酚解酶高产菌株快速筛选模型的建立与应用轻工大学生物工程学院,
214036可能是,是否拨号?
[4]唐兵,珍荣发酵法生产左旋多巴提取工艺的研究大学生物系
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