抗疲劳实验方法Word文档格式.docx
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且差异有显著性(pV0.05),可以判定该实验阳性。
1.5注意事项
1.5.1每一游泳箱一次放入的小鼠不宜太多,否则互相挤靠,影响实验结果。
1.5.2水温对小鼠的游泳时间有明显的影响,因此要求各组水温控制一致,以25C为
宜,如果过低可能引起小鼠痉挛,影响实验结果。
1.5.3铅皮缠绕松紧应适宜。
1.5.4观察者应在整个实验过程中使每只小鼠四肢保持运动。
如果小鼠漂浮在水面四肢不动,可用木棒在其附近搅动。
1.5.5不同批的小鼠因饲养环境、季节等原因的变化体质上会出现差异。
因此受试物组和对照组应采用同一批动物同时进行。
2爬杆试验
2.1原理
运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最有力的宏观表现,爬杆时间的长短可以反应动物静用力时疲劳的程度。
2.2材料
爬杆架。
直径0.8—1cm长约25cm的有机玻璃圆棒(经120目砂纸打磨),上端固定于木板上,下端悬空,距地面约20cm结构见示意图。
(图略)
2.3实验方法
2.3.1实验动物雄性成年小鼠,体重18—22g。
推荐使用BALB/C
2.3.2剂量设置同1.3.2。
2.3.3实验步骤
实验时,将爬杆架置于水温15C、深约10cm的水盆中。
末次给予受试物30min后开始实验,将小鼠放在有机玻璃棒上,使肌肉处于静力紧张状态,记录小鼠由于肌肉疲劳从有机玻璃棒上跌落下来的时间,第三次落水时终止实验,累计三次的时间作为爬杆时间。
2.4数据处理及结果判定
爬杆时间为计量资料,可以用方差分析。
若受试物组爬杆时间明显长于对照组爬杆时间,且差异有显著性(pv0.05),可以判定该实验阳性。
2.5注意事项
2.5.1实验前小鼠经筛选,训练数次仍不肯爬杆者,废弃。
2.5.2杆的质地和光滑程度明显影响小鼠的爬杆时间,要求杆的质地坚硬,光滑程度一致,以免小鼠爪子将杆表面刮损,影响光滑程度。
3血清尿素氮测定二乙酰—肟法
3.1原理
样品中尿素在氯化高铁—磷酸溶液中与二乙酰—肟和硫氨脲共煮,形成一种红色的化合物,其颜色的深浅与尿素含量成正比,与同样处理的尿素标准管比较,可求出其含量。
3.2仪器与试剂
721分光光度计,10mL带塞试管,1mL(或1.5mL)塑料离心管,电炉,锅,灌胃针头。
试剂盒;
若无试剂盒,可自行配制试剂
1g/L二乙酰—肟溶液:
取二乙酰—肟1.0g,氨基硫脲(thiosemicarbazide)0.2g,氯化钠4.5g,溶于蒸馏水并加至1000mL。
33g/L三氯化铁溶液:
取三氯化铁1.0g溶于浓磷酸20mL中,加蒸馏水10mL摇匀。
酸溶液:
取蒸馏水800mL慢慢加入浓硫酸50mL边加边摇;
再加入85%磷酸50mL摇匀。
加入33g/L三氯化铁溶液1.5mL加水至1L。
10mmol/L尿素标准液(尿素氮28.01mg/dL):
精确称取尿素(AR)150.3mg溶于16mmo1/L苯甲酸溶液并加至250mL。
16mmol/L苯甲酸液:
取苯甲酸2.0g溶于蒸馏水1000mL中,加浓硫酸0.8mL。
3.3实验方法
3.3.1实验动物雄性成年小鼠或大鼠,小鼠体重18-22g,大鼠体重160-200g。
推
荐使用BALB/C小、鼠,Wistar或SD大鼠,
3.3.2剂量分组、给样途径及期限大鼠以人体推荐量的5倍为基本剂量。
其余同
1.3.2
3.3.3实验步骤
3.3.3.1
末次给受试物30min后,在温度为30C的水中游泳90min,米血测定。
3.3.3.2
样本准备大鼠米尾血,小鼠拔眼球米血0.5mL。
草酸盐、肝素或EDTA抗凝
的血浆或血清
。
血清中的尿素在室温下可稳定24h,在4—6C可稳定7d以上。
3.3.3.3
操作步骤
3.3.3.3.1
试剂盒按照说明书操作
3.3.3.3.2
自行配制试剂按下表操作
(表略)
充分混匀,置沸水浴准确15min,立即用自来水冷却。
用波长520nm以空白管调零,读取各管吸光度(A值)。
3.3.4尿素氮含量计算
A“■山粉
3.3.社」试別盒方法尿索札Eig/dL)=———X20.0(BB/dL)
A“-A*
3.3.4.2自配试剂尿素(mmo1/L)=AuX10/As
尿素氮(mg/dL)=AuX28.01/As
式中Au—测定管吸光度
As—标准管吸光度
3.4.2结果判定
统计方法可用方差分析。
若受试物组高于对照组,且差异有显著性(pV0.05),可判定为
该受试物有减少疲劳小鼠尿素氮产生的作用。
3.5注意事项
3.5.1为避免色度转移,应在标本加入后30min内读出吸光度值。
3.5.3煮沸时间应准确。
4肝糖原测定蒽酮法
4.1原理
蒽酮可与游离糖或多糖起反应,反应后溶液呈蓝绿色,于620nm处有最大吸收。
测定其
光密度,可以确定糖原的含量。
4.2仪器与试剂
4.2.1仪器
721型分光光度计,离心机,扭力天平,匀浆器,振荡器,沸水浴,灌胃针头,手术器
械,玻璃漏斗,加样器,2mL5mL10mL吸量管,20mL带塞刻度试管,10mL带塞离心管。
4.2.2试剂
5%三氯醋酸(用蒸馏水配)(TCA)
葡萄糖标准液
浓硫酸(AR)
蒽酮试剂:
溶液中含0.05%的蒽酮,1%勺硫脲,用72%勺HSQ配制。
172%2SQ配制:
烧杯中加入280mL蒸馏水,再加入高纯度的浓硫酸720mL比重1.84)
2蒽酮试剂配法:
当"
SQ温度降至80-90C时放入500mg纯的蒽酮,10g高纯度的硫脲,适当摇动烧杯混匀。
冷却后存放于冰箱中,可保存两周。
4.3实验方法
4.3.1实验动物同3.3.1。
4.3.2剂量设置、给样途径及给样期限
大鼠剂量以人体推荐食用量扩大5倍作为基本剂量,其余同1.3.2。
4.3.3实验步骤
433.1样本制备
末次给样后30min,在温度为30C的水箱中游泳90min,立即处死,取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干,精确称取肝脏200mg加入4mLTCA每管匀浆1min,将匀浆液倒入离心管,以3000转/min离心15min,将上清液转移至另一试管内。
在沉淀中再加入4mLTCA匀
浆1min,再次离心15min,取上清液,并与第一次离心的上清液合并,充分混匀。
取1mL上清液放入10mL离心管中(每样品可做两平行管以保证获得可靠结果),每管加入95%勺乙醇4mL充分混匀至两种液体间不留有界面。
用干净塞子塞上,室温下竖立放置过夜(也可选用将试管放在37-40E水浴3h)。
沉淀完全后,将试管于3000转/min离心15min。
小心倒掉上清液并使试管倒立放置10min。
用2mL蒸馏水溶解糖原,加水时将管壁的糖原洗下。
如管底的糖原不立即溶解,振荡管子直到完全溶解。
制作试剂空白和标准管:
试剂空白:
吸2mL蒸馏水到干净离心管
标准管:
吸0.5mL葡萄糖标准液(含100mg/dL葡萄糖)和1.5mL蒸馏水放入同样的管子。
4.3.3.2测定样品糖原含量
此时将10mL蒽酮试剂用力加入各管,液流(蒽酮试剂)直接进入管子中央,保证充分混合好。
从管子中注入蒽酮试剂时起,将管子放在冷水龙头下冲凉。
在所有管子都达到凉水温度后,将其浸于沸水浴(水浴深度略高于管子液面)15min,然后移到冷水浴,冷却到室温。
将管内液体移入比色管,在620nm波长,用试剂空白管调零后测定吸光度。
并根据标准曲线计算出糖原含量,根据所称取的肝脏重量换算成肝糖原含量(以mg/g肝表示),并进行统计学处理。
4.3.3.3糖原含量计算:
每100克肝姐织叩第麻IW丸救•—X0.5xx100x0,9
D6肝爼秋克敢
DU样品管吸光度
DS:
标准管吸光度
0.5:
为0.5mL葡萄糖标准液液中的葡萄糖含量。
0.9:
为将葡萄糖换算成糖原的系数。
4.4数据处理及结果判定
所得数据为计量资料,可用方差分析或t检验。
若受试物组肝糖原含量明显高于对照组,且差异有显著性(PV0.05),可判定该受试物有促进糖原储备或减少糖原消耗的作用。
4.5注意事项
4.5.1测定的实验方法均为定量要求,因此所有取样加试剂均需准确。
4.5.2糖原测定中冷却、加热时间与氧化还原作用有关,因此时间要控制准确。
4.5.3蒽酮显色剂不稳定,以临用时配制为宜,注意避免采用绒布或被污染的糖类进入蒽酮反应。
5乳酸测定
5.1原理
在铜离子催化下,乳酸与浓硫酸在沸水中反应,乳酸转化为乙醛,乙醛与对羟基联苯反应产生紫色化合物,在波长560nm处有强烈的光吸收,故可进行定量测定。
5.2仪器与试剂
5.2.1仪器微量吸管,恒温水浴锅,电热水箱,分光光度计。
5.2.2试剂
4%CuS4O
1%NaF溶液
蛋白沉淀剂:
按体积分别取一份10%的钨酸钠,一份1/3mo1/L硫酸,再与28份蒸馏水
混合即成
沉淀剂—NaF混合液:
按体积分别取3份沉淀剂,1份1%NaF混合即成
1.5%对羟基联苯溶液:
称取1.5g对羟基联苯溶于100mL热的0.5%NaOH中(可保存半年)
乳酸标准储备液(1mg/mL):
称取106.6mg乳酸锂或171mg乳酸钙,以10%勺三氯乙酸定容至100mL(室温下可保存半年)
乳酸标准应用液(0.01mg/mL):
准确吸取1.0mL乳酸标准储备液稀释定容至100mL此液要求现用现配
5.3实验方法
5.3.1实验动物同3.3.1。
5.3.2剂量设置、给样途径与期限大鼠以人体每日每公斤体重推荐量的5倍为基本剂量,其余同1.3.2。
5.3.3实验步骤
5.3.3.1游泳末次给样30min后负重2%体重)在温度25—30C的水中游泳60min后停止,安静15min后米血备用,大鼠米尾血,小鼠拔眼球米血。
5.3.3.2操作步骤
于5mL试管中加入0.48mL1%NaF溶液,准确吸取全血20卩1加入试管底部。
用试管上部清液清洗微量吸管数次,再加入1.5mL蛋白沉淀剂,振荡混匀,于3000r/min离心10min,取上清液,按下表操作。
上述步骤完成后,摇匀,置30°
C水浴30min(每隔10min振摇一次)。
取出后放入沸水浴中加热90S,取出冷却至室温,在波长560nm处用5mn光径比色皿比色,空白管调零。
5.3.3.3血乳酸含量计算
血畀廉生童(af/lOOtL}-xEOO
5.4数据处理及结果判定该实验数据属剂量资料,可用方差分析。
若受试物组血乳酸
含量明显低于对照组,且差异有显著性(Pv0.05),可判定为该项实验阳性。
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