传统方法在临床细菌学鉴定中的作用文档格式.docx

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革兰阳性菌通常对万古霉素敏感、拉丝试验阴性；

革兰阴性菌则相反。

抗酸染色确定抗酸杆菌，改良金泳染色是奴卡菌、红球菌的鉴定试验之一。

鞭毛染色常用于非发酵菌鉴定，应用芽胞、异染颗粒和荚膜染色在相关细菌确认上都是重要特征。

4、动力在各种细菌鉴定中是简便而关键的试验，如李斯特菌、肠球菌、D群链球菌、绿色气球菌，它们都是胆汁七叶苷阳性，而且形态不易区分，但李斯特菌有动力（25℃），很容易区别；

小肠结肠炎耶尔森菌在22~C-25℃有动力，但在35℃无动力。

志贺菌属无动力，沙门菌属有动力；

黄杆菌属无动力，很容易区别有动力的非发酵的杆菌等。

5、氧化酶、触酶试验分别是革兰阴性菌、革兰阳性菌鉴定的关键试验，需要传统方法测试，仪器也要依据上述试验结果，选择相应的鉴定卡。

氧化酶错误可使细菌鉴定错在"

科"

水平，如将气单胞菌误认为肠杆菌科细菌。

触酶错误不可能准确鉴定微球菌科细菌，对触酶阳性发酵的革兰阳性球菌必须先确定血浆凝固酶阳性，仪器才会报告金黄色葡萄球菌。

6、传统的鉴定方法通过优选试验项目，同一科内的不同属、种可以选择不同的鉴定指标，具有灵活性。

大肠埃希菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌、肺炎克雷伯菌、不动杆菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌等常见病原菌都能简便地鉴定出来。

采用稳定、优质的商品生化微量管，将使生化培养基的使用变得方便，且成本低廉。

7、志贺菌属、沙门菌属、致病性大肠埃希菌等仅需几项简单试验即可确定菌属，即使自动化仪器也离不开传统的血清学试验确定型别。

链球菌属已有快速分群凝集试验。

8、传统方法的不足：

传统方法手工操作较繁杂，鉴定细菌至少需要18-24h，而仪器可在几小时内报告结果。

但主要还是下述问题制约着传统方法的进一步发展：

（1）疑难菌、少见菌、苛养菌鉴定是薄弱之处，它们生长较慢、营养要求高，如结核分枝杆菌、巴斯德菌属、嗜血杆菌属、弯曲菌属、螺菌属、军团菌属、棒状杆菌属等在中小实验室分离甚少，这些细菌虽然没有取代传统的病原菌，但有增多趋势，需加强这些细菌鉴定方法的研究和规范化。

同时，还应创造条件普及厌氧菌培养和鉴定，满足因病原菌感染所致疾病的诊断、治疗的要求。

（2）广大中小实验室在提高常见病原菌鉴定水平的基础上，应掌握疑难菌、少见菌、苛养菌的检验技术，不要放弃临床标本中遇到的不熟悉的细菌，按科-属-呻种原则鉴定，也便于发现“新的细菌”，而且对“新菌”的鉴定可以拓展思路，提高细菌鉴定的水平，必要时将可疑菌送到上级实验室或用仪器鉴定。

还应大力加强细菌检验人员的培训，提高业务素质。

（3）加强国产培养基的研制。

优质的培养基是分离、培养病原菌的关键。

苛养菌、血液增菌培养瓶、结核分枝杆菌等商品培养基应大力开发，以适应临床细菌学检验技术的需要。

全自动微生物鉴定专家系统的临床应用与评价

北京医院检验科（胡去建、许宏涛、张秀珍）；

湖南医科大学检验系（肖春海）

　　为了有效控制和治疗传染性疾病，快速和准确获得细菌的药敏结果是非常必要的。

近10多年来随着计算机的发展及广泛应用，先后出现了许多自动与半自动细菌鉴定与药敏系统，VITEK系统即为其中之一。

由于药敏结果的可靠性直接关系到临床的治疗效果，但是对体外药敏试验的结果下解释，需要掌握多方面知识：

如细菌的耐药机理及对应的表型，细菌的天然耐药性，细菌群体中的最低抑菌浓度（MIC）分布，药物的化学结构及作用方式，体液及组织中药物代谢动力学，体外测试结果与治疗效果的关系等，这些都是由少数专家来完成。

于是VITEK系统中设置了专家系统对药敏结果进行审核分析和解释。

一、什么是专家系统

　　专家系统是根据抗生素的种类，细菌的种类与目前美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）及其他出版的数据信息为药敏结果提供推论性的解释说明。

专家系统这一名称也是首次出现在美国微生物学会1999年出版的第7版临床微生物手册中。

专家系统自动监测VITEK药敏结果中的异常表型，并对常见耐药表型机制进行评估和推断，即本身是一个提示，出现专家系统即有提示。

二、专家系统的组成

　　VITEK专家系统共有144条规则，包括3个等级。

　　1．一级专家系统：

是对报告中极不可能或从未出现过的表型的警告。

例如：

药敏结果中出现金黄色葡萄球菌耐万古霉素，则是不可能的表现型。

到目前为止未见有报道金黄色葡萄球菌耐万古霉素，要求重复鉴定或药敏试验给予证实，否则系统不予通过。

　　2．二级专家系统：

是对报告中罕见表型的提示。

如果是洋葱伯克霍德菌对氨基糖苷类抗生素和亚胺培南敏感，则是罕见表型，因为洋葱伯克霍德菌对上述两种抗生素天然耐药，也要求重复鉴定或药敏试验给予证实。

　　3．三级专家系统：

是利用一种耐药表型推断另外一些药物的耐药性或提示药敏结果中的耐药机理。

如是肠杆菌对环丙沙星耐药，则对其他喹诺酮抗生素耐药。

三、专定系统的临床应用

　　我们通过用VITEK对常规培养分离出来816株细菌进行鉴定和药敏试验，了解其药敏结果出现的专家系统情况，并对结果中出现的一、二级专家系统的解释进行手工纸片扩散布法验证和鉴定试验。

　　1．816株细菌经VITEK-IMS60全自动微生物鉴定系统（为生物梅里埃公司产品）的革兰阳性菌鉴定卡（GPI卡）和革兰阴性菌鉴定卡（GNI卡）鉴定结果见表1，这些细菌均为临床上常见的细菌。

　　表1 

VITEK对816株细菌鉴定结果

GNI卡

株数（511）

GPI卡

株数（305）

绿脓假单胞菌

不动杆菌属

沙雷菌属

大肠埃希菌

克雷伯蓖属

枸橼酸杆菌属

阴沟肠杆菌

产气肠杆菌

变形杆菌

其他细菌

83

72

16

95

73

35

51

28

19

39

MSSA

MRSA

MSCNS

MRCNS

肠球菌属

无乳链球菌

42

30

62

43

74

24

合计

816

　　注：

MSSA：

苯唑西林敏感金黄色葡萄球菌；

MRSA：

耐苯唑西林金黄色葡萄球菌；

MSCNS：

苯唑西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌：

MRCNS：

耐苯唑西林凝固酶阴性葡萄球菌

　　2.816株细菌根据细菌的种类不同上相应药敏卡，葡萄球菌药敏卡（GPS-SD卡）、链球菌药敏卡（GPS-TA）、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌药敏卡（GNS-NT）、其他革兰阴性菌药敏卡（GNS-F3和GNS-F5卡），专家系统版本为VTK-R7.01。

出现专家系统的情况（如果1株细菌出现2条或2条以上的专家系统，按最高级的1条计算）见表2，共有489株细菌出现专家系统，约占60%。

327株细菌无专家系统推荐，表示该试卡显示的耐药表型符合该细菌已知耐药机制的表达，或目前对该细菌耐药表型还未获得可推荐的规则。

　　表2 

816株细菌出现专家系统的情况

一级专家系统

二级专家系统

三级专家系统

无专家系统推荐

38

4.7%

（38/816）

4.8%

（39/816）

412

50.5%

（412/816）

327

40.0%

（327/816）

　　3．对一、二级专家系统所提示的内容用纸片扩散法验证药敏试验所用材料为英国OXOID公司产品；

API试纸条为生物梅里埃公司产品，用于重复鉴定，验证结果见表3。

　　表3 

一、二级专家系统经验证后的情况

专家系统

出现的次数

符合专家系统的次数（%）

不符合专家系统的次数（%）

一级

二级

28（74）

32（82）

10（26）

7（18）

77

60（78）

17（22）

　　在一级专家系统中，28次经验证后符合专家系统，出现的原因是多种多样，分布于操作（金黄色葡萄球菌耐万古霉素和无乳链球菌耐青霉素的原因为菌落不纯）、人为的判断（屎肠球菌、鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌的试卡上的生化反应非常接近，只有通过30°

是否有动力和菌落是否有黄色色素才能区分，如果只从概率高低把铅黄肠球菌输入一个对万古霉素敏感的药敏卡，就会获得一级专家系统，为铅黄肠球菌天然耐万古霉素）和仪器因素（大肠埃希菌对一代喹诺酮抗生素萘啶酸敏感，而对二代三喹诺酮抗生素或环丙沙星结果耐药，纸片扩散法验证药敏试验发现在萘啶酸纸片的周围有耐药菌株）等多方面。

10次不符合专家系统的细菌为鲍曼不动杆菌和绿逐假单胞菌对试卡（GNS-F3）中全部抗生素耐药，经验证为全部耐药。

　　在二级专家系统中，经验证后82%都符合专家系统，说明大多数细菌的耐药模式在世界范围是基本相同，出现专家系统的原因基本上与一级专家系统相同。

7次不符合，则说明这7株菌确为罕见表型。

四、专家系统的意义

　　仪器鉴定与药敏受多种因素影响，如菌落不纯，菌悬液浓度不标准，操作时药敏卡暴露于室温过长使部分抗生素受热后效价下降等因素都可使仪器药敏结果不准确。

因而很有必要对其结果的可靠程度进行评估，由于临床微生物室的工作人员不可能记忆如此多的信息，而VITEK系统中的专家系统正是为此而设置的，即通过计算机的帮助证实药敏结果。

在816株细菌的药敏结果中，共有489株细菌出现专家系统，约占60%。

其中一级专家系统和二级专家系统共占77次，经验证后一、二级专家系统中提示正确为仪器药敏错误为78%，这大大提高了药敏结果的准确性。

同时在412次三级专家系统中发现，它对目前全世界关注的特殊菌的耐药性进行监测：

耐苯唑西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐苯唑西林的凝固酶阴性葡萄球菌（MRSCoN）；

耐万古霉素的肠球菌（VRE）和高水平耐氨基糖苷类抗生素的肠球菌（HLAR）；

产超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等等，以及利用一种耐药表型推断另外一些药物的耐药机理。

长期应用，提高了临床微生物室的工作人员对抗生素方面和知识的理论基础。

　　当前细菌的耐药性日趋复杂，新的问题不断出现，而且专家系统中的信息多为普遍现象，不能代表个别菌株，所以也不是每个专家系统提示都符合当地耐药谱。

而且专家系统是在特定时间和地点指定的药敏规则，是动态的、可变的。

例如在一级专家系统中，经验证后10次不符合专家系统为鲍曼不动杆菌和绿脓假单胞菌对试卡（GNS-F3）中全部抗生素耐药。

通过专家系统提示，经验证后这一矛盾确实存在，就意味着一个新的耐药机制的发现。

在多重耐药的鲍曼不动杆菌和绿脓假单胞菌比MRSA和VRE的问题更为严重，因为前二者中有些克隆株已获得卡巴配能水解酶，这类克隆菌株将耐除粘杆菌素以外的目前所有的抗生素。

此类细菌发生爆发流行，结果是相当严重。

　　在21世纪这个信息时代，把世界先进的在临床微生物和抗菌素生素耐药性方面卓有成效之，一流专家的经验，编成一条条规则的软件，对细菌的药敏结果进行自动监测，不但提高了工作效率，而且使药敏结果的含金量大大增加。

这也是临床微生物在检测手段上一个很大的进步。

特别是VITEK2内连接的专家系统比VITEK的专家系统发展得更完善。

因此，笔者深信专家系统软件，将在自动与半自动细菌鉴定和药敏系统以及手工纸片扩散法中得到更广泛和更深一步的应用。

细菌鉴定发展历史及最新进展

细菌鉴定是细菌分类的实验过程。

长期以来，临床微生物实验室一直沿用100多年前由Gram、Pasteur、Koch、Petri等创造的传统的微生物学鉴定方法，这些传统的鉴定方法不仅过程烦琐，费时费力，且在方法学和结果的判定、解释等方面易发生主观片面而引起的错误，难以进行质量控制。

　　20世纪60年代以后，微生物学家和工程技术人员密切合作，对微生物的研究采用了物理的、化学的分析方法，发明了许多自动化仪器，并根据细菌不同的生物学性状和代谢产物的差异，逐步发展了微量快速培养基和微量生化反应系统，使原来缓慢、烦琐的手工操作变得快速、简单，并实现了自动化和机械化。

微生物鉴定自动化方法，包括

（1）临床微生物鉴定系统；

（2）气液色谱分析；

多用于研究；

（4）化学发光技术；

可鉴定一些细菌少数分枝杆菌属和一些真菌。

80到90年代发展迅速，并广泛用于临床。

80年代美国雅培公司MS-2进入中国,Biolog随后跟进，1985年第一台自动化细菌分析化仪器Vitek-AMS进入中国。

1999年底法国生物梅里埃公司推出VITEK2系统，从接种物稀释、密度计比较及卡冲填和封卡等步骤均实现了全自动化。

目前已有多种微生物自动鉴定及药敏测试系统问世，这些自动化系统具有先进和微机系统，广泛的鉴定功能，适用于临床微生物实验室。

卫生防疫和商标标系统，主要功能包括细菌鉴定、细菌药物敏感性试验及最低抑菌浓度（MIC）的测定等。

其准确性和可靠性均已大大提高。

下面将中国市场主要仪器详述如下：

第一节VITEK系统全自动鉴定药敏分析仪

VITEKautomatedID/ASTsystem

一、VITEK2Compact全自动微生物分析系统VITEK2compactadvancedautomatedID/ASTsystem

（一）工作原理

鉴定利用细菌各自的酶系统不同，新陈代谢的产物也就有所不同，这些产物与相应底物反应产生颜色等变化，仪器自动每隔15min测定每孔透光度变化，达到判读阈值时，得出术相结合，自动对数据进行处理分析，得出最后结果及报告可信指数。

药敏实质仍是微型的肉汤稀释试验。

应用光电比浊原理，根据细菌在不同种类和不同浓度的抗生素溶液中生长状况，每隔15min自动测定，即可得到待测菌在各浓度的生长率。

待检菌斜率与阳性对照孔斜率比较分析，经回归分析得到MIC值，并根据NCCLS（美国国家临床实验室标准化委员会）标准获得相应的S、I和R结果。

药敏报告经专家系统审核校正和微生物学工作者最后确定发送，报告包含MIC值、敏感度，以及可能检测到的耐药机制。

（二）基本结构

系统由VITEK2Compact主机（液晶显示器、键盘、真空充填室、封口、孵育、检测箱、废卡接收箱）、计算机、打印机、数字显示电子比浊仪、条码扫描器等组成（图20-1）。

（三）操作要点

手工仅需配置一管标准浊度的菌悬液（一般细菌0.5~0.63MCF,真菌1.8~2.2MCF），按不同卡片要求稀释成药敏检测用菌悬液，利用条码扫描器和键盘输入患者和标本信息，卡片接种、封口、上机、读数及最后的移除都由仪器自动化完成。

数据自动传输到分析电脑，操作员根据仪器给出结果及提示做最后确认。

（四）功能与特点

极少的手工操作，从接种到试卡移除的全自动最佳工作流程，符合实验室生物安全及提高工作效率的需要。

内置条码阅读器，及时确认用户输入的资料，便于数据及报告的追踪。

仪器每15min阅读卡片，缩短检测时间。

软件使用WindowsXP操作系统，更直观和便于掌握。

新多波长彩色鉴定卡进一步提高鉴定准确率和一次性选择率，国外文献评估其准确率可达97%~99%。

药敏卡较VITEK一代可容纳更多种抗生素，并可根据NCCLS规则和耐药性推导未在卡内试验的多种抗生素的敏感性，为临床提供更多选择。

二、VITEK全自动鉴定药敏分析仪VITEKautomatedID/ASTsystem

菌液接种到鉴定板后进行培养，由于细菌各自的酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又具有不同的生化特性，因此各生化反应的颜色变化各不相同。

仪器每隔15min自动测定每一个生化反应孔的透光度（OD值），当生长对照孔的透光度达到判读阈值时，指示已完成反应。

由光电检测技术、电脑分析技术应用与微生物数值编码鉴定技术、动态检测技术相结合自动对数据进行处理、传输结果、发送报告及资料备份。

药敏测试板实质是微型化的肉汤稀释实验。

应用光电比浊原理，根据不同的药物对不同的菌最低抑菌浓度不同，每一种药物一般选用多种不同药物浓度，开始孵育后，每隔一定时间自动测定小孔中细菌生长状况，即可得到待测菌在各浓度的生长率。

药敏报告经专家系统审核校正和微生物学工作者最后确认发送，报告包含MIC值、敏感度，以及可能检测的耐药机制。

由充填机/封口机、读取器/孵育器、电脑主机及打印机组成（图20-2）。

充填机/封口机3min内把样本注入试验卡中及封口；

读取器/恒温箱自动恒定培养温度并同时读取卡内生化反映变化（系统依据不同型号，容纳60至480张卡不等），电脑主机负责分析资料的储存、系统的操作及分析。

参照操作手册的规范操作流程进行实验。

手工仅需配置一管标准菌悬液并按要求稀释为药敏测试菌悬液，填充、读数及数据分析都由仪器自动完成。

1.操作简便 

全部操作自动化，只需操作基本步骤，简单而方便。

2.快速 

数小时内可获得试验结果，如肠杆菌只需4~6h,有时快速生长菌可在2h内报告结果。

3.使用灵活 

可随时放入试验卡进行测试。

4.结果准确可靠 

临床常见的细菌均可准确鉴定，可获得多种抗生素药敏结果，具备审核鉴定和药敏功能的专家系统，并可检测多种耐药机制如MRSA、ESBLs、VREA、HLAR、PRP等，结果符合NCCLS标准。

5.资料处理全面 

bioLIAISON软件集中管理实验室资料，设计报告形式、产品数据、鉴定结果及其他实验结果的处理，且已经同时配置了完善的中文报告系统，可进行灵活全面的统计查询。

获得AOAC国际认证。

第二节Phoenix–100全自动细菌鉴定药敏检测系统

Phoenix–100automatedmicrobiologysystem

Phoenix–100全自动细菌鉴定药敏检测系统是由美国BD公司生产的最新的全自动系统（图20-3）。

1．细菌鉴定原理　利用比色与荧光相结合的检测方法。

45个鉴定反应孔中包被了传统生化反应底物（色原底物）及荧光底物，以红、绿、蓝光对反应孔的颜色变化，以荧光对反应孔的荧光强度进行实时、连续监测，将得到的数据利用内置的运算法则进行运算并分析，从而得出鉴定结果。

2．药敏试验原理 

根据CLSI推荐的微量肉汤稀释方法。

在药敏检测孔中包被了不同抗生素，每种抗生素均有3~7个对倍稀释的浓度，在这些药敏检测孔中加入特定浓度的菌悬液，通过光电比浊法和BD专利的氧化还原指示技术检测细菌在各反应孔中的生长情况，以最低药物浓度仍能抑制细菌的反应孔为该抗生素对此菌的MIC值，并根据国际标准得出敏感（S）、中度敏感（I）耐药（R）的结果。

１．Phoenix主机（读数器与孵育箱）　可承载100块板条，为直立旋转式设计，避免了传统的机械故障。

通过对每块板的条形码扫描来进行板条的识别。

自动孵育，连续读数，自动计算分析并报告结果。

２．计算机及数据管理系统　具备双向连接功能，可联网医院的LIS系统，传输检测数据。

具备强大的专家系统，监测鉴定及药敏结果，保证结果的可靠性。

中文报告系统可根据医院需要打印中文报告，并具备完善的查询统计功能。

３．CrystalSpec比浊仪　用于制备特定浓度的菌液，从而保证结果的可靠性。

４．Phoenix接种加样盘　独特而新颖的重力加样方式，“一倒而就”使加样变得简单快捷并且加样均匀，防止污染。

５．鉴定药敏板条　在中国提供２种板条，革兰阳性鉴定药敏复合板，革兰阴性鉴定药敏复合板，共计可鉴定300余种细菌，包括90％以上的临床常见和少见菌种。

板条分类简单，无需附加试剂和附加试验。

（1）用比浊仪配置0.5麦氏单位的菌悬液。

（2）以重力加样方式将菌液加到板条中。

（3）在电脑中输入板条信息。

（4）将板条置入主机中。

（5）仪器自动检测并报告结果。

（1）鉴定采用荧光与显色相结合的检测方法，在鉴定准确的基础上大大提高了检测速度，平均鉴定时间3h。

（2）鉴定过程无需附加试剂，无需氧化酶、触酶等定向试验，使工作流程更加简便。

（3）在非发酵菌、肠球菌及革兰阳性杆菌的鉴定方面具有明显优势。

（4）药敏采用比浊及BD专利的氧化还原指示技术，快速报告MIC值，平均药敏检测时间5h。

（5）每种抗生素有3~7个连续对倍稀释的浓度，为真正的MIC值。

（6）专家系统应用国际规则监测鉴定药敏结果，保证结果的可靠性。

（7）板条室温保存，运输储存方便。

第三节MicroScan自动微生物鉴定及药敏测试系统

MicroScanautomaticofmicroorganism-identificationandantimicrobialsusceptibilitytestingsystem

MicroScan自动化微生物鉴定及药敏测试系统是由美国DadeBehring公司所生产的药敏试验的配套仪器，完全符合中国抗菌药物使用管理规