重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体原液生产车间工艺设计.docx
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重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体原液生产车间工艺设计.docx
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重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体原液生产车间工艺设计
重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体原液生产车间工艺设计
重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体原液生产车间工艺设计
摘要
随着单抗药物的日益发展,现如今单抗药物的生产能力远不能满足市场的需求,具有鼠源性的单克隆抗体不适合用于人体,因其用于人体会引起HAMA反应,即人抗鼠抗体反应;且通过杂交瘤技术制备而成的单克隆抗体,是鼠源性的。
解决此难题的方法在于可将鼠源抗体的可变区,与人抗体的恒定区进行拼接,两者拼接而形成嵌合抗体;另外,鼠抗体内可变区的互补决定区,即CDR区与人的抗体内的互补决定区,可以进行互换,两者互换可构成人源化抗体,这也是解决HAMA反应的一种方法。
至今为止,国内外已经上市的抗EGFR单克隆抗体,共有3种,将其与其他的化疗药进行比较,具备许多特点,首先其靶点非常明确,其次其毒副作用也较低,且疗效更为明显。
本次设计的主要内容是设计生产西妥昔单抗的车间,主要分为上游动物细胞发酵培养和下游产物纯化两个部分,本设计选用的宿主细胞,是表达重组抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的CHO细胞,对其进行悬浮培养,以分批流加补料方式培养,下游采用亲和层析、离子交换层析等对产物进行纯化。
按照所有的工艺流程对所用物料进行物料衡算。
原液车间内容包括:
种子复苏、种子扩大培养、发酵罐发酵、蛋白纯化几个步骤。
关键词:
动物细胞培养;纯化;物料衡算;车间设计
ProcessdesignofworkshopforproductionofrecombinanthumanmousechimericmonoclonalantibodyagainstEGFR
Abstract
Today,withthedevelopmentofsingledrugresistantcapacityofthesingledrugresistantfarcannotsatisfythedemandofthemarket,andbecausebyhybridomatechnologypreparationofmonoclonalantibodyisthesourceoftherat,applytothehumanbodyinevitablycauseantimouseantibody(HAMA)response,sowillbethesourceoftheratantibodiesvariableareawithconstantregionjoiningtogethertoformachimericantibodyorwillbedecidedthemouseantibodyvariableareacomplementaryarea(CDR)andantibodyofcomplementarydecisionofthedistrictswaphumanizedantibody,basicallysettledtheproblemofantibodydrugsofdifferentsourcesex.
Atpresent,therearethreekindsofanti-egfrmonoclonalantibodiesonthemarketathomeandabroad.Comparedwithotherchemotherapeuticdrugs,theyhavecleartargets,significantefficacyandlowtoxicandsideeffects,andhaveachievedgoodclinicalefficacy.Theproductwasapprovedfordomesticmarketin2009.Thisdesignmainlyaimsattheworkshopproductionofcetuximabtocarryonthedesign,themainproductisdividedintoanimalcellsfermentationcultureanddownstreampurificationtwoparts,chooseexpressrecombinantEGFRresistanthumanmousechimericmonoclonalantibodyofCHOcellsasahostcell,suspensioncultureandcultivateinpartialflowandfeedingway,downstreamusingaffinitychromatography,ionexchangechromatographyforpurificationofproduct.Theworkshopconsistsofseveralsteps:
seedrecovery,seedexpansionculture,fermentationinfermenttankandproteinpurification.Accordingtotheproductionprocessandtheprincipleofzoning,seeds,fermentation,harvestandpurificationaredividedintoseveralmainproductionareas.
Keywords:
Animalcellculture;Purification,;Materialbalance;Workshopdesign
1前言
到今天为止,市面上常见的以EGFR为靶点的治疗性药物,已经上市的主要有十二种,这其中有四种是单克隆抗体,另外八种则是小分子抑制剂。
其中四种单抗的适应症主要是以非小细胞肺癌、头颈癌、结直肠癌为主的;另外八种小分子抑制剂则是以乳腺癌、非小细胞肺癌作为主要的适应症[1]。
通过查找全球临床试验的数据库,得到的结果是与此次设计主题相关的临床研究截至今日共有三千七百五十七个,其中有二十六个在早期的临床阶段,有七百二十六在临床一期,有一千四百八十二个在临床二期,有五百四十一个在临床三期,其余二百七十一个在临床四期。
单抗药物作为当代全球生物技术产业的热点,许多国家、企业都致力于开发单抗药物。
本设计的设计意义在于解决当前社会单抗药物价格居高不下的难题与缓解病患对单抗药物供不应求的严峻情况。
本次车间设计的生产产品为西妥昔单抗,其主要用于结肠癌的治疗。
车间主要分为发酵和纯化两个部分,将单克隆抗体进行工业生产化的关键因素也在于这两部分。
本次设计主要分为上游动物细胞培养和下游蛋白纯化两个主体内容,动物细胞培养阶段需要注重的要点是对于细胞生长的条件要严格把控与检测,细胞处于生长的最适条件便可最大程度地收获到细胞液,即能收获更多的目的蛋白[2]。
上游细胞培养阶段结束后,收获液需要进行蛋白纯化才能得到高纯度的目的蛋白,简而言之,产品的纯度就取决于纯化阶段工作的效率[3]。
各个层析步骤的填料选择、纯化设备的选择等等都对纯化率起到关键作用,这些都是在后续工作中需要着重注意的点。
在完成上游细胞培养和下游纯化后得到目的蛋白,收获产品之后,需要对整个生产过程中所涉及到的物料的用量、耗热量、蒸汽量等等进行衡算,对整个车间的布置、经济消耗进行规划。
2工艺流程
2.1上游细胞培养
在单克隆抗体的生产工艺中,动物细胞的大规模培养已成为最重要的关键技术之一,哺乳动物细胞表达系统中可发生生物大分子特定的翻译后修饰,且大多数重组蛋白可以分泌到胞外,这一特点对产物的提取,减少许多工作量,因此动物发酵培养成为单克隆抗体生产上游工艺的首选。
上游工作主要分为几个步骤,首先对细胞进行复苏,待细胞复苏后将其置于摇瓶内扩增,摇瓶扩增结束后一次进行5L、30L的细胞反应器进行增殖培养,再将其移至200L反应器内进行流加培养,细胞增殖至一定浓度后转移至2000L反应器中进行流加培养,培养一定时间后得到收获液[5]。
具体流程如下:
细胞株:
本设计选用表达抗EGFR人鼠嵌合单克隆抗体的重组CHO细胞。
(1)细胞培养基
基础培养基的配方:
配方主要内容为CDFortiCHOAGT(ThermoFisher公
司),12.5g/L;Ex-Cell302(Sigma-Aldrich公司),10.8g/L。
配制方法:
取配制体积80%的注射用水于配液容器中,计算配制培养基所需
要用到的原料用量,将Ex-cell302干粉以及CDFortiCHOAGT干粉称取计算所得到的用量,加入到配液容器中,搅拌30分钟。
用5mol/L的氢氧化钠调节其pH,直至PH为6.9-7.0,再将溶液继续搅拌,搅拌10分钟左右。
搅拌结束后将培养基定容至所配制的体积,再进行过滤,将培养基分装。
过滤后先进行无菌验证,验证结束后再检查滤膜是否完整[6]。
将其置于4℃的冰箱里储存。
补料培养基的配方如表一
配制方法:
取配制体积80%的注射用水于配液容器中,计算配制培养基所需
要用到的原料用量,将CellBoost5干粉以及CDEfficientFeedCAGT干粉称取计算所得到的用量,加入到配液容器中,搅拌30分钟;然后调节pH直到PH被调至PH=9.2左右,再依次加入配方中剩下的成分,如谷氨酸等,待其溶解后,继续搅拌20分钟。
搅拌结束后,用6mol/L盐酸调节其PH,直至pH达到6.9-7.0,再将溶液继续搅拌,搅拌10分钟左右[3]。
搅拌结束后将培养基定容至所配制的体积,再进行过滤,将培养基分装。
过滤后先进行无菌验证,验证结束后再检查滤膜是否完整。
将其置于4℃的冰箱里储存。
(2)种子复苏:
将本设计选用的宿主细胞进行37℃水浴,为使之迅速融合需不断
进行搅动。
搅动一段时间后,得到融化的细胞液,将细胞液转移到离心管中,取15ml离心管装细胞液,并在此基础上加入10ml的基础培养液,然后将其进行离心后弃上清,弃去上清后,再加入70ml基础培养液对其进行重悬,重悬后转入125ml摇瓶,并放入37℃、5%CO2的摇床中培养,摇床转速100rpm。
(3)摇瓶扩增:
细胞在125ml摇瓶中生长2-3天后,细胞密度不断增长,密度达
到4×106细胞/ml。
加入基础培养基将其稀释,使得摇瓶内细胞密度达到0.6×106细胞/ml,并以此细胞密度接种到1L摇瓶[3]。
再将其放入37℃、5%CO2培养条件的摇床中进行培养,摇床转速为100rpm。
在摇床中培养3天后,细胞的密度达到了4×106细胞/ml,再以0.6×106细胞/ml的密度将细胞接入到5L生物反应器中培养。
(4)反应器扩增:
5L反应器培养阶段,温度36-37℃,pH6.8-7.2,转速150rpm,
30%的溶氧饱和度条件下培养3天后,当细胞密度达到了4×106细胞/ml,将种子液转入30L反应器中培养[7]。
30L反应器温度36℃,pH7.0,转速120rpm,30%的溶氧饱和度条件下培养,接种密度为0.6×106细胞/ml,每天取样计数,葡萄糖浓度控制在3g/L。
细胞培养至密度达到4×106细胞/ml,活率要求>95%,将其作为接种至200L反应器中生产的种子来源。
(5)200L反应器培养:
将CHO种子细胞培养液从30L反应器转入200L规格的一
次性搅拌式的生物反应器中,首先对从5L反应器中转入至200L反应器内的种子
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