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1.1.2现代生物工程组成
⏹三门基础学科:
生物学、化学和工程学
⏹为生物工程学提供理论支撑。
生物工程反过来又推动这些基础学科的发展。
⏹传统的生物工程:
发酵工程、酶工程、细胞工程、基因工程。
⏹后来,生物化学工程、蛋白质工程、代谢工程、组织工程等生物工程技术得以迅速发展。
⏹现代生物工程技术发展既相互关系:
1.1.2.1发酵工程(fermentationengineering)
也称微生物工程(microbialengineering),是指采用现代工程技术手段,利用微生物的某些特定功能,生产有用产品,或直接把微生物应用于工业生产过程的一种技术。
⏹最古老的生物工程技术曾经是主体技术
⏹对象:
天然微生物
基因工程菌
1.1.2.2酶工程(enzymeengineering)
是利用酶的催化作用,生产人类所需的产品或达到某一特殊目的的技术。
⏹6大类:
氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂解酶类、连接酶类和异构酶类。
⏹特定地催化某个化学反应,具有效率高、条件温和、污染小、能耗低、反应容易控制等特点。
1.1.2.3蛋白质工程(proteinengineering)
是指在基因工程基础上,结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识通过对基因的人工定向改造等手段,对蛋白质进行修饰、改造和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋白质的技术。
⏹第二代基因工程
⏹研究方向:
①基因水平上的蛋白质改造,创造结构和功能全新的蛋白质
②蛋白质修饰,即蛋白质翻译后的基因修饰。
1.1.2.4基因工程(geneticengineering)
是指对生物的遗传基因进行切割、拼接或重新组合,再转入生物体内生产出人们所期望的产物,或创造出具有新遗传性状的生物类型的一门技术。
1.1.2.5生物化学工程(biochemicalengineering)
简称生化工程,主要研究实验室研究成果转化为生产力过程中带有共性的工程技术问题。
⏹主要包括:
①新型生物反应器系统及生产工艺;
②新型分离技术和设备开发;
③描述生物反应过程的数学模型的建立;
④生产过程在线检测和控制技术。
1.2细胞工程cellengineering
是应用生命科学理论,借助工程学原理与技术,有目的地利用或改造生物遗传性状,以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性科学技术。
•研究对象:
细胞
染色体、细胞核、原生质体、
受精卵、胚胎、组织或器官。
研究对象:
生物类别划分
微生物细胞工程(发酵工程)
植物细胞工程
动物细胞工程
1.2.1细胞工程发展历史
1.2.1.1探索期P7
⏹1902年,德国植物学家哈伯兰德(Haberlandt)提出了细胞全能性学说
⏹温特(Went)、高特里特(Gautheret)和诺比考特(Nobercourt)一起成为植物组织培养的奠基人。
1.2.1.2诞生期P7
⏹腺嘌呤和生长素的比例是控制芽形成的重要因素
⏹激动素
⏹植物激素控制器官形成
生长素与分裂素比例是控制植物细胞分化的关键:
当生长素与分裂素比例高时利于根的生长,比例低时利于芽或茎的分化,比例相当时利于保持分裂但无分化的状态。
1.2.1.3快速发展期P8
⏹20世纪70年代开始,随着细胞生物学、发育生物学、生物化学、分子生物学、遗传学等学科的发展和研究的日益深入,细胞工程进入快速发展阶段。
⏹加籍华裔科学家高国楠发现:
聚乙二醇可以促使植物原生质体融合,植物细胞融合技术初步建立。
⏹1981年,齐默曼利用可变电场诱导原生质体融合,建立了细胞融合物理方法,进一步完善了细胞融合技术。
1.2.2细胞工程与其他生物工程技术的关系
1.2.3细胞工程主要应用
1.2.3.1动植物快速繁殖
⏹优良动植物的快速繁殖以及濒危物种的保护
⏹主要技术:
植物组织培养、人工种子、体外受精动物、克隆动物等
1.2.3.2品种改良与新品种培育
⏹主要是指在细胞、细胞器、染色体、细胞核水平上进行遗传性状改良,培育出生物新品种。
细胞水平上的原生质体诱变、细胞融合技术;
细胞器水平上的细胞重组;
染色体水平上的多倍体、单倍体育种;
以及雌(雄)核发育、胚胎嵌合、植物离体受精等。
1.2.3.3细胞工程生物制品
⏹利用动植物细胞或组织培养、转基因动植物生物反应器生产生物制品是现代细胞工程的一个代表性领域。
⏹蓝藻、绿藻、光合细菌等一些单细胞生物可以在特定条件下产生氢气。
硅藻等微藻富含油脂,因此,微藻细胞高密度培养产生氢、制备生物柴油以及微生物发酵生产乙醇等在能源领域大有可为。
1.2.3.4组织工程
⏹利用体外培养的细胞或者人造组织器官可以实现受损组织或器官的修复与替换,克服目前器官移植的原料不足、免疫排斥等问题。
复习题:
1.生物工程包括哪些技术,各有什么特点?
2.什么是细胞工程?
有什么应用价值?
第2章细胞工程基础
2.4细胞分化与脱分化
2.4.1细胞全能性
▪是指分化细胞保留着全部的核基因组,具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息,具有发育成完整个体的潜能。
▪1958年,史都华德(Steward)等利用胡萝卜根韧皮部组织培养出了完整的新植株,证明高度分化的植物营养组织仍保持着发育成完整植株的能力。
动物细胞核移植实验证明,胚胎细胞及高度分化的体细胞具有全能性。
2.4.2细胞分化
▪持家基因(house-keepinggene):
维持细胞的基本结构和最低限度功能所不可缺少的基因,此类基因在所有类型的细胞中都表达。
▪组织特异性基因(tissue-specificgene):
又称奢侈基因,是在各种组织中进行不同的选择性表达的基因,与各类细胞的特殊性有直接关系。
2.4.3细胞脱分化
▪脱分化:
又称去分化,是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程,即分化的细胞在适当条件下转变为胚性状态而重新获得分裂能力的过程。
▪不同生物的细胞脱分化能力不同,通常采用人工诱导技术诱导体细胞的脱分化。
2.4.4细胞再分化
▪再分化是指在离体条件下,无序生长的脱分化的细胞在适当条件下重新进入有序生长和分化状态的过程。
▪细胞再分化过程事实上是基因选择性表达与修饰的人工调控过程。
▪脱分化是细胞全能性表现的前提,再分化是细胞全能性的最终体现。
1.名词解释:
持家基因、组织特异性基因
下篇动物细胞工程
第11章动物细胞培养与表达制备药用蛋白
11.1动物细胞培养(animalcellculture)
是模拟动物体内的生理环境使细胞分裂增殖的一种技术。
v体外培养原代培养(初代培养)
传代培养(继代培养)
v原代培养(primaryculture)——在首次传代前的培养。
培养的细胞称为原代细胞。
v传代培养(passageculture/subculturing)——是指将原代培养的细胞继续转接培养的过程。
细胞的体外大量增殖是通过传代培养实现的。
v1907年,哈里森(Harrison)采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中,保持存活了几周时间,并观察到细胞突起的生长过程,开创了动物组织培养的先河。
v1923年,法国学者卡勒尔(Carred)设计的卡氏培养瓶成功地用于培养鸡胚的心肌组织。
v1951年,厄尔利(Earle)等人开发了动物细胞体外培养的培养基。
v20世纪70年代,发展起来的淋巴细胞杂交瘤技术使动物细胞培养应用进入了一个新的领域。
11.2动物细胞培养的特点
v动物细胞属于真核细胞,结构和成分更复杂,功能也更全面。
v
连接形式紧密连接
间隙连接相对普遍
桥粒连接
隔壁连接无脊椎动物细胞
中间连接脊椎动物细胞
v贴附
非贴附
动物细胞具有以下特点:
⑴动物细胞比微生物细胞大,无细胞壁。
⑵动物细胞倍增时间长,生长缓慢。
⑶培养过程需氧量少,对机械搅拌或剪切力敏感。
⑷动物细胞间主要以聚集体形式存在。
⑸原代细胞一般繁殖50代左右即退化死亡。
⑹动物细胞对于营养要求更加苛刻,除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外,一般还需要血清。
⑺对于培养环境极其敏感,包括pH、溶解氧、温度、剪切力等。
⑻细菌、真菌、病毒、支原体均可导致动物细胞培养物的污染。
⑼绝大多数哺乳动物细胞只有贴附在固体或半固体的表面才能生长。
11.2.1贴附型细胞
v贴附生长是大多数动物细胞在体内的基本存在方式。
细胞之间相互接触
细胞与细胞外基质结合
形成组织,细胞与周围环境保持联系。
v当细胞布满表面后即停止生长。
从生长表面脱落进入液体的细胞通常不再生长而逐渐退化。
v贴壁培养的细胞可用胰蛋白酶、酸、碱等试剂或机械方法使其脱落下来。
v还有一些细胞,既可贴壁生长,也可悬浮生长。
按照体外培养细胞的形态不同:
(一)成纤维型细胞
v细胞外形:
与体内成纤维细胞形状相似,细胞大致呈梭形或不规则形。
贴壁后呈长梭形,圆形核位于中央,胞质外伸出2~3个长短不同的突起,生长时呈放射状、漩涡状走向。
v多数细胞之间排列疏散,有较大的细胞间隙。
有时也相互平行排列,成群细胞呈现放射状、漩涡状等形式。
v起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为此种形式。
(二)上皮型细胞
泛指那些形状上类似上皮细胞的细胞
v特点是:
扁平状,形态较为规则,细胞贴壁后呈三角形即不规则扁平的多角形,中央有扁圆形核,生长时彼此紧密连接成单层细胞。
v内胚层与外胚层的细胞
(三)游走型细胞
v具有类似巨噬细胞样的特征。
在支持物上分散生长,一般不连接成片、形成群落;
胞质常伸出伪足和突起;
在培养器皿壁上生长位置不固定,呈活跃的游走和变形运动,速度快且方向不规则;
细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒。
v该类细胞不很稳定,外形不规则且不断变化。
当细胞密度增大、连接成片时,形状类似于成纤维样细胞型或上皮细胞型。
v具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞,例如,颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等
(四)多形型细胞
v形态上不规则的细胞
胞体:
略呈多角形
胞突:
细长形,类似丝状伪足
v不常见,神经原和神经胶质细胞
影响细胞形态学特征的主要因素包括:
v血清成分、培养基成分及添加成分、培养基的酸碱度、气相环境、温度等。
v体外培养的细胞并不一定呈现典型的形态形式,而多呈现的是一些过度性形态。
11.2.2非贴附型细胞
v悬浮型细胞
v细胞密度一般都较高,培养的效率也高、操作也容易,因此易于大规模生产,便于过程的控制。
v形态学特点:
胞体始终为球形
v白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞系等
11.3培养工具与条件
11.3.1工具
v多数为玻璃或无毒塑料制成的不同规格、类型的培养瓶、培养皿、培养管等。
v多孔塑料培养板:
6~96孔
v关键仪器:
CO2培养箱,相差显微镜等
v目前,大多采用以微球(微载体)作为支持介质,使附壁细胞的培养具有悬浮培养的优点。
11.3.2培养条件
11.3.2.1温度
v37℃
v实践证明,细胞对低温的耐受性要比对高温的耐受性强些,低温下会使细胞生长代谢速率降低;
一经恢复正常温度时,则细胞会再行生长。
v高温对细胞的威胁甚大,若在40℃左右,则在几小时内细胞便会死亡。
11.3.2.2pH
v最适为:
7.2~7.4
v多数类型的细胞对偏酸性的耐受性较强,而在偏碱性的情况下则会很快死亡。
11.3.2.3气体
vO2
vCO2还有调节pH的作用
v一定浓度CO2便可以将培养环境中的氢离子浓度保持恒定以提供一个比较稳定的pH范围。
11.3.3培养基
v对营养的要求很高
满足细胞进行糖代谢、脂代谢、蛋白质代谢及核酸代谢所需要的各种营养
v很多成分系用血清、胚胎浸出液等提供。
10%胎牛或小牛血清
血清使用前必须经过鉴定,只有无菌、无内毒素、无溶血或低溶血、蛋白质以及营养素达一定标准以上的血清才能使用
11.3.3.1天然培养基
v直接采用取自动物体液或从组织中提取的成分作培养液。
v营养价值高,但是成分复杂,来源有限。
v血清、组织提取液、鸡胚汁等
血清——最有效和最常用的培养成分
含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学性状不可缺少的成分。
牛血清:
胎牛血清——来源少,价格高
小牛血清——刚产下尚未哺乳的小牛
马血清
血清中已知的主要成分:
v蛋白质:
白蛋白、球蛋白
v氨基酸:
有12种是细胞本身不合成的,必须由培养液提供
v葡萄糖:
v激素等:
胰岛素、生长激素和多种生长因子
表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)
水解乳蛋白、胶原是两种较好的天然培养基。
0.5%溶液,微酸性。
胶原是从动物真皮中提取的,具有改善细胞表面特性促使其附着生长作用。
11.3.3.2合成培养基
v为了营造与细胞体内相似的生长环境,便于细胞体外生长,厄尔利于1951年开发了MEM培养基
v成分已知,便于培养条件的控制,对细胞培养技术的发展起了很大推动作用。
v加入一定量的天然培养基:
小牛血清和胎牛血清
v商业化培养基:
MEM、DMEM、RPMI-1640、F12等
11.3.3.3无血清培养基
v血清成分复杂,有些成分至今尚不清楚。
血清对细胞生长很有效,但后期对培养产物的分离、提纯以及检测造成一定困难。
另外高质量的动物血清来源有限,成本高,不宜大量使用。
v无血清培养基就是试图全部采用已知成分,其中包括血清中的细胞生长因子,从而代替血清。
v无血清培养基不加动物血清,在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上,在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子,保证细胞的良好生长。
v补充的生长因子中,胰岛素和转铁蛋白几乎是所用细胞株所必需的。
v激素
v胰岛素、生长激素、胰高血糖素、氢化考的松等是常用的补充因子。
11.3.4常用溶液
11.3.4.1平衡盐水(BSS)
生理盐水+葡萄糖
无机离子:
细胞的组成成分
具有维持细胞渗透压、调控培养液酸、碱度平衡的功能。
少量酚酞指示剂:
pH
Hanks液和Earle液:
常用BSS的基础溶液。
前者缓冲能力较弱,后者较强。
11.3.4.2pH调整液
vpH调整液应单独配制,单独灭菌,待灭菌后的培养基使用前再加入。
v可以保证营养成分的稳定和延长其保存期。
v常用pH调整液:
3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)液等。
11.3.4.3细胞消化液
(一)胰蛋白酶溶液
v分离自牛、猪等动物胰脏的胰蛋白酶呈黄色粉末状,极易潮解,注意冷藏干燥保存。
v能水解细胞间的蛋白质
v0.125%和0.25%,用无Ca2+和Mg2+的溶液配制,调pH6.8~7.2之间。
v消化细胞结束时,加入少量血清或含血清的培养基终止酶作用。
(二)乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液
EDTA为一种化学螯合剂,其溶液又称为Versen液。
v具一定的非酶性解离作用
v因经济方便、毒性小、易配制而成为常用的消化液
v0.02%(个别细胞系要求浓度较高)
vEDTA与胰蛋白酶:
1:
1或2:
1效果更好
v链酶蛋白酶、骨胶原酶、透明质酸酶等也可用于消化细胞。
因价格昂贵、保存困难,只用于特殊种类的细胞消化。
(三)抗生素溶液
v防止微生物污染
青霉素——抑制细菌细胞壁的合成
链霉素、卡那霉素——抑制细菌蛋白质的合成
制霉菌素——能干扰细菌细胞质膜的合成
11.4体外培养细胞生长和增殖过程
v体外培养动物细胞时生存空间和营养都是有限的。
v动物细胞培养一般经过组织获得、组织消化、接种、原代培养、传代培养几个过程。
(一)原代(初代)培养期
v从体内取出组织接种培养到第一次传代培养
v1~4周
v细胞比较活跃,有细胞分裂,但不旺盛。
多呈2n
(二)传代期
v原代培养一经传代后便称为细胞系。
v10~50次后,细胞增殖逐渐缓慢,以至完全停止。
(三)衰退期
v细胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖。
细胞形态轮廓增强,最后开始衰退凋亡。
11.4.1原代培养
11.4.1.1组织块培养
v处死动物,取出组织块放入小烧杯中,用尖嘴眼科剪刀将组织块剪碎成1mm3大小,用吸管吸取Hanks液冲下剪刀上的碎块,补加3~5mLHanks液,吸管轻轻吹打,低速离心,弃上清液,留下组织块。
v用两只手术刀片将组织切碎,这样对细胞损伤较小,但操作时间长,容易污染。
v对某些软组织如肿瘤、胚胎、脑等可将碎组织块放入注射器玻璃管中挤压分离。
v用1mm、10µ
m、20µ
m三种规格的不锈钢或尼龙网筛挤压分离。
v待准备好培养瓶后,用弯头吸管吸出组织块一一放入培养瓶内(间隔0.5cm为宜),使其贴在瓶壁上,贴有组织块的瓶壁朝上,加入培养液。
塞上瓶塞,翻转培养瓶使瓶液慢慢覆盖组织块,置于37℃培养箱中静止培养,成单层后再进行传代培养。
为促进细胞贴壁,也可先在瓶内壁涂一层血清。
11.4.1.2组织消化培养
(一)取材与消化
v用酶解方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。
胰蛋白酶:
适用于细胞间质较少的软组织,如胚胎、羊膜、上皮、肝、肾等。
方法:
将剪碎的组织块放入有玻璃珠的三角烧瓶中,加入30~50倍体积的0.25%浓度胰蛋白酶。
37℃水浴内消化30~60min,每5~10min摇动一次,根据效果可中间更换消化液。
Hanks液漂洗两次,每次2~3min。
800r/min离心5min,弃上清液,加入营养液,如有大块,可用纱网过滤。
如消化传代细胞,可与EDTA混用。
v胶原酶对胶原和细胞间质有较强的消化作用,适用于消化纤维组织、上皮组织、癌组织等。
此酶不受Ca2+和Mg2+的螯合作用,可用BSS和含血清培养基配制成200单位/mL或0.1~0.3mg/mL浓度,作用温和,无需机械震荡。
向培养瓶中放入1~5mm3大小碎组织块,加5mL2000单位/mL的胶原酶液,使终浓度为200单位/mL,pH6.5;
36.5℃水浴4~48h,视情况可适当延长,无需摇动,期间可更换酶液一次;
当组织块已变软,分散于瓶底,轻微震荡即散成细胞团或单细胞,小心吸出培养液,瓶底可能附着一些巨噬细胞,借此可将其分开,单独培养或弃之不用;
800r/min离心5min,弃上清液,重悬于BSS液中,再重复离心一次;
加入培养液制成细胞悬液用于接种。
v链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶等也可用于培养细胞的消化,需根据酶的作用特点及组织成分的不同适当选用。
(二)培养与检查
v每1~2天
v检查内容:
是否污染、生长状况、培养液的pH等,并根据情况及时处理。
v贴壁细胞
⑴检查细胞形态及活力:
倒置显微镜
状态良好的细胞:
轮廓形态不十分清晰,较透明
生长不良的细胞:
轮廓反而变清,细胞间隙增大,胞内有空泡、脂滴、颗粒等出现,细胞形态不规则。
细胞活力=活细胞占计数细胞总数百分比
⑵检查营养液pH及污染:
新鲜培养液呈桃红色,pH在7.2~7.4
5%的CO2的含量
细胞培养危害最大又不易发现是支原体污染:
个体小0.25~1µ
m,能透过漏斗
11.4.2传代培养
当原代培养的细胞分裂增殖扩展成片,即将占满器皿表面时需要进行传代培养。
v80%~90%或刚刚全部汇合的细胞是传代培养的理想时期。
根据细胞特点,掌握适当的细胞消化时间和选择适宜的方法很关键。
⑴吸出培养瓶内旧培养液。
⑵加入胰蛋白酶和EDTA混合液盖满瓶底。
⑶2~5min后检查,如有细胞间隙变大,细胞质回缩现象,加入含血清的新鲜培养基终止消化(血清中含有抗蛋白酶成分)。
⑷吸出消化液,加入Hanks液,轻轻转动以免细胞流失,洗去残留的消化液。
⑸用吸管轻轻吹打瓶壁,使细胞脱落制成悬液,计数后记录其浓度。
⑹重新接种培养。
11.5细胞株与保存
v有限细胞系(finitecellline)
不能连续培养的为~。
v连续细胞系(infinitecellline)——无限系
能连续培养下去的为~。
无限细胞系大多已发生异倍化,具异倍体核型,有的可能已成为恶性细胞,因此本质上已是发生转化的细胞。
11.5.1分类
用于生产的动物细胞株包括原代细胞、二倍体细胞、连续细胞系、融合细胞和重组细胞。
11.5.1.1原代细胞
v1949年,
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