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3)加入的选择性抑制剂。
培养方法:
分批式富集培养(摇瓶培养):
是将富集培养物转接到新的同一种培养基中,重新建立选择性压力,如此重复转种几次后,再取此富集培养物接种到固体培养基上,以获得单菌落。
恒化富集培养(连续培养):
是通过改变限制性基质的浓度,来控制菌株的比生长速率。
3、高产培养基成分的选择准则:
制备一系列的培养基,其中有各种类型的养分成为生长限制因素(C、N、P、O);
使用一聚合或复合形式的生长限制养分;
避免使用容易同化的碳(葡萄糖)或氮(NH4+),它们可能引起分解代谢物阻遏;
确定含有所需的辅因子(Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+)
加入缓冲溶液以减小pH变化。
4、代谢控制发酵:
用人工诱变的方法,有意识地改变微生物的代谢途径,最大限度地积累产物,这种发酵形象地称为代谢控制发酵,最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
5、菌种的衰退表观现象有哪些?
目的产物的产量下降
营养物质代谢和生长繁殖能力下降
发酵周期延长
抗不良环境的性能减弱
6、菌种的衰退的原因
菌种保藏不当
提供不了当的条件或不利的条件
经诱变得到的新菌株发生回复突变
7、菌种的复壮方法:
纯种分离
通过寄主体进行复壮
淘汰已衰退的个体
8、菌种的保藏的原理
根据菌种的生理生化特点,人工创造条件,使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低,以减少其变异。
一般可通过保持培养基营养成分在最低水平,缺氧状态,干燥和低温,使菌种处于“休眠”状态,抑制其繁殖能力。
9、菌种的保藏方法:
A斜面冰箱保藏法
斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法,用新鲜斜面接种后,置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后,放在4℃冰箱保存。
一般保存期为三个月到六个月。
B沙土管保藏法
将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与121℃间歇灭菌三次的沙土混合(沙与土的比例为l-2∶l),于干燥器中用真空泵抽干,放在冰箱内保存。
一般保存期为1年左右。
适合于产孢子或芽孢的微生物。
是国内常采用的一种方法。
C石蜡油封存法
向培养成熟的菌种斜面上,倒入一层灭过菌的石蜡油,用量要高出斜面一厘米,然后保存在冰箱中。
此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。
保存期约一年左右。
D真空冷冻干燥保藏法
基本原理:
在较低的温度下(-15℃)快速地将细胞冻结,然后在真空中使水分升华。
可保持细胞完整,使微生物的生长和代谢都暂时停止,不易发生变异。
目前常用的较理想的一种方法,对各种微生物都适用,且菌种可以保存很长时间,一般5年左右,国内外都已较普遍地应用。
E液氮超低温保藏法
适用范围最广的微生物保藏法,尤其对不产孢子的菌丝体,用其它保藏方法不理想,可用液氮保藏法,其保存期最长,国外已较普遍采用。
用液氮能长期保存菌种。
这是因为液氮的温度可达-196℃,远远低于其新陈代谢作用停止的温度(-130℃),所以此时菌种的代谢活动已停止,化学作用亦随之消失。
第三章菌种选育
1、常用菌种选育方法
(1)自然选育:
是指在生产过程中,不经过人工处理,利用菌种的自发突变(spontaneousmutation)而进行菌种筛选的过程。
自发突变的频率较低,变异程度不大。
所以该法培育新菌种的过程十分缓慢。
(2)诱变育种:
是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群,促进其突变率大幅度提高,然后采用简便、快速和高效的筛选方法,从中挑选少数符合育种目的的突变株,以供生产实践或科学研究使用。
诱变育种的理论基础是基因突变。
常用诱变剂:
物理诱变剂、化学诱变剂(碱基类似物、与碱基反应的物质、在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基物质)、生物诱变剂
(3)分子育种(DNA重组、基因工程):
用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来,在离体条件下切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后导入某一受体细胞中,让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术。
(4)杂交育种(Hybridization):
常规杂交育种(Hybridization):
一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖或原核微生物的接合、F因子转移、转导和转化等过程,促使两个具有不同遗传性状的菌株发生基因重组,以获得性能优良的生产菌株。
原生质体融合技术:
通过人工方法,使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合,并产生重组子的过程,亦称为“细胞融合”(cellfusion)。
原生质体融合的基本过程:
原生质体形成、原生质体融合、原生质体的再生。
3、诱变育种出发菌株的来源
①自然界直接分离到的野生型菌株
②经历过生产条件考验的菌株这些菌株已有一定的生产性状,对生产环境有较好的适应性,正突变的可能性也很大。
③已经历多次育种处理的菌株
2、理想的工业发酵菌种应符合以下要求:
⑴遗传性状稳定;
⑵生长速度快,不易被噬菌体等污染;
⑶目标产物的产量尽可能接近理论转化率;
⑷目标产物最好能分泌到胞外,以降低产物抑制并利于产物分离;
⑸尽可能减少产物类似物的产量,以提高目标产物的产量并利于产物分离;
⑹培养基成分简单、来源广、价格低廉;
⑺对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感;
⑻对溶氧的要求低,便于培养及降低能耗。
3、工程菌的不稳定性表现
质粒的不稳定(质粒的丢失、重组质粒的DNA片段脱落)、表达产物的不稳定
第三章微生物的代谢调节
1、微生物代谢调节方式
代谢流向的调控分为代谢物的合成和代谢物的降解;
通过快速启动蛋白质的合成和有关的代谢途径,平衡各代谢物流和反应速率来适应外界环境的变化。
代谢速度的调控分为酶量(粗调)(酶合成的诱导和酶合成的阻遏)和酶活(细调)(酶活性的激活、酶活性的抑制)
反馈阻遏是转录水平的调节,产生效应慢;
影响催化一系列反应的多个酶
反馈抑制是酶活性水平调节,产生效应快。
只对是一系列反应中的第一个酶起作用
底物对酶的影响称为前馈。
产物对酶的影响称为反馈。
2、微生物初级代谢调节包括酶活调节、酶合成调节、遗传控制
(1)酶活性的调节(细调):
一定数量的酶,通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。
酶活调节的影响因素包括:
底物和产物的性质和浓度、压力、pH、离子强度、辅助因子以及其他酶的存在等等。
特点是反应快速。
酶活性的调节包括:
酶活性的激活:
指在分解代谢途径中,后面的反应可被较前面的中间产物所促进。
酶活性的抑制(反馈抑制):
某代谢途径的末端产物(即终产物)过量时,这个产物可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性,促使整个反应过程减慢或停止,从而避免了末端产物的过多累积。
(2)酶合成的调节:
通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。
这类调节在基因转录水平上进行,对代谢活动的调节是间接的、缓慢的
(3)酶合成的阻遏:
在某代谢途径中,当末端产物过量时,微生物的调节体系就会阻止代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成,从而彻底地控制代谢,减少末端产物生成,这种现象称为酶合成的阻遏。
末端代谢产物阻遏:
由于某代谢途径末端产物的过量积累而引起酶合成的(反馈)阻遏。
分解代谢物阻遏:
当细胞内同时存在两种可利用底物(碳源或氮源)时,利用快的底物会阻遏与利用慢的底物有关的酶合成。
这种阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的结果,而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引起的,所以称为分解代谢物阻遏(过去被称为葡萄糖效应)。
3、改变细胞膜通透性的方法
A限制培养基中生物素浓度在1~5mg/L,控制细胞膜中脂质的合成;
B加入青霉素,抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联;
C加入表面活性剂如吐温80或阳离子表面活性剂(如聚氧化乙酰硬脂酰胺),将脂类从细胞壁中溶解出来,使细胞壁疏松,通透性增加;
D控制Mn2+、Zn2+的浓度,干扰细胞膜或细胞壁的形成;
E可以通过诱变育种的方法,筛选细胞透性突变株。
5、人工控制微生物代谢的两种手段:
(1)生物合成途径的遗传控制:
生物合成途径的遗传控制是通过诱变来实现的。
这种突变不仅包括结构基因的突变,而且包括调节基因的突变。
包括:
A、代谢缺陷型菌株B、利用抗代谢类似物的突变积累氨基酸C、产物降解酶缺失突变株D、细胞膜组分的缺失突变
(2)发酵条件的控制
6.谷氨酸棒杆菌(生物素缺陷型)生产谷氨酸的调控
第四章微生物次级代谢与调节
1、次级代谢产物:
某些微生物在生命循环的某一个阶段产生的物质,它们一般是在菌生长终止后合成的。
其生物合成至少有一部分是与核内和核外的遗传物质有关,同时也与这类遗传信息产生的酶所控制的代谢途径有关。
微生物产生的次级代谢物有抗生素、毒素、色素和生物碱等。
2、次级代谢产物生物合成的特征
⑴次级代谢产物一般不在菌的生长期产生,而在随后的生产期形成
⑵种类繁多,含有不寻常的化学键
⑶一种菌可以产生结构相近的一族抗生素
⑷一族抗生素中各组分的多少取决于遗传与环境因素
⑸一种微生物的不同菌株可以产生多种在分子结构上完全不同的次级代谢产物
⑹次级代谢产物的合成对环境因素特别敏感
⑺微生物由生长期向生产期过渡时,菌体在形态学上会发生一些变化
3、初级与次级代谢途径相互连接次级代谢物通常是由初级代谢中间体经修饰后形成的
修饰的三种生化过程生物氧化与还原、生物甲基化、生物卤化
4、前体:
指加入到发酵培养基中的某些化合物,它能被微生物直接结合到产物分子中去,而自身的结构无多大变化有些还具有促进产物合成的作用。
中间体是指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质,他们均被进一步代谢,最终获得该途径的终产物。
前体与诱导物的区别能在生长期内促进抗生素生物合成的化合物看作诱导物;
前体往往只在生产期内起作用,甚至蛋白质合成受阻的情况下也行。
诱导物应能被非前体的结构类似物取代,诱导物的诱导系数特别高。
5、次级代谢物生物合成的原理
①一旦前体被合成,在适当条件下它们便流向次级代谢物生物合成的专用途径。
②在某些情况下单体结构单位被聚合,形成聚合物。
这些特有的生物合成中间体产物需做后几步的结构修饰,修饰的程度取决于产生菌的生理条件。
有些复杂抗生素是由几个来自不同生物合成途径组成的。
6、代谢工程(metabolicengineering):
指籍某些特定生化反应的修饰来定向改善细胞的特性或运用重组DNA技术来创造新的化合物。
第五章发酵培养基
1、培养基通常指人工配制的供微生物生长、繁殖、代谢和合成所需产物的营养物质和原料,同时,培养基也为微生物等提供除营养外的其它生长所必需的环境条件
2、发酵培养基的要求
①培养基能够满足产物最经济地合成
②发酵后所形成的副产物尽可能的少
③培养基的原料应因地制宜,价格低廉;
且性能稳定,资源丰富,便于采购运输,适合大规模储藏,能保证生产上的供应。
④所用培养基应能满足总体工艺的要求,如不应影响通气、提取、纯化及废物处理等。
3、工业上常用的碳源:
葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖
工业上常用的氮源:
无机氮源:
氨水,铵盐,硝酸盐等。
有机氮源:
玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、棉籽粉、鱼粉、酵母浸出液等。
生理酸性物质,如硫酸铵。
生理碱性物质,如硝酸钠。
提供生长因子的农副产品原料:
1)玉米浆
2)麸皮水解液
3)糖蜜
4)酵母:
可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。
产物促进剂是指那些非细胞生长所必需的营养物,又非前体,但加入后却能提高产量的添加剂。
4、发酵培养基的设计和优化方法
正交试验设计、均匀设计、响应面分析
正交试验设计:
利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。
它是由试验因素的全部水平组合中,挑选部分有代表性的水平组合进行试验,通过对这部分试验结果的分析,了解全面试验的情况,找出最优的水平组合。
第六章发酵培养基灭菌和空气净化
在发酵工业生产中,为了保证纯种培养,在生产菌种接种培养前,要对培养基、空气系统、消泡剂、流加物料、设备、管道等进行灭菌,还要对生产环境进行消毒,防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。
1.微生物热阻:
微生物在某一特定条件下(主要是温度和加热方式)下的致死时间。
2.对数残留定律中各符号的意义。
3.理论灭菌时间的计算
3.1间歇实罐灭菌时间的计算
3.2连续灭菌的灭菌时间计算:
4.灭菌温度的选择:
随着温度升高,灭菌速率常数增加的倍数大于培养基中营养成分的分解速率常数的增加倍数。
即当灭菌温度升高时,微生物杀灭速度提高,培养基营养成分破坏的速度减慢。
5.影响培养基灭菌的因素:
所污染杂菌的种类、数量、灭菌温度和时间,培养基成分、pH值、培养基中颗粒、泡沫等对培养基灭菌也有影响。
6.无菌空气:
指通过除菌处理使空气中含菌量降低至一个极低的百分数,从而能控制发酵污染至极小机会。
此种空气称为“无菌空气”。
7.介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层,将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中,而达到除菌的目的。
是大多数发酵厂广泛采用的方法。
按除菌机制可分为:
绝对(表面)过滤和深层介质过滤。
介质过滤除菌的机理:
空气流通过这种介质过滤层时,借助惯性碰撞、拦截滞流、静电吸附、扩散等作用,将其尘埃和微生物截留在介质层内,达到过滤除菌目的。
第七章种子的扩大培养
1、种子扩大培养:
指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后,再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子
2、种子扩大培养的目的与要求
(1)种子扩培的目的①接种量的需要②菌种的驯化③缩短发酵时间、保证生产水平
(2)种子的要求①菌种细胞的生长活力强,移种至发酵罐后能迅速生长,延迟期短②生理性状稳定③菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求④无杂菌污染⑤保持稳定的生产能力。
3、种子罐级数:
是指制备种子需逐级扩大培养的次数,取决于菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度、所采用发酵罐的容积。
种子罐级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。
级数大,难控制、易染菌、易变异,管理困难,一般2~4级。
4、种子制备分两个阶段:
实验室种子制备阶段生产车间种子制备阶段
5、种龄:
是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
接种量:
是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
通常接种量:
细菌1-5%,酵母菌5-10%,霉菌7-15%,有时20-25%
青霉素生产的种子制备过程:
安瓿管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵
第八章发酵工艺控制
1、微生物发酵的生产水平取决于生产菌种本身的性能和合适的环境条件。
2、发酵过程的代谢变化
从产物形成来说,代谢变化就是反映发酵中的菌体生长、发酵参数的变化(培养基和培养条件)和产物形成速率这三者之间的关系。
在分批培养过程中根据产物生成是否与菌体生长同步的关系,将微生物产物形成动力学分为①生长关联型和②非生长关联型。
3、发酵方式
(1)补料-分批发酵:
指分批培养过程中,间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。
优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。
低基质浓度的优点:
①可以除去快速利用碳源的阻遏效应,并维持适当的菌体浓度,使不至于加剧供氧的矛盾;
②克服养分的不足,避免发酵过早结束。
(2)半连续发酵:
是指在补料-分批发酵的基础上,间歇地放掉部分发酵液的培养方法。
②克服养分的不足,避免发酵过早结束;
③缓解有害代谢产物的积累。
(3)连续发酵:
指培养基料液连续输入发酵罐,并同时放出含有产品的发酵液的培养方法。
在这样的环境中培养,菌的生长就受到所提供基质的限制,培养液中的菌体浓度能保持一定的稳定状态。
与传统的分批发酵相比,连续培养有以下优点:
①维持低基质浓度:
可以除去快速利用碳源的阻遏效应,并维持适当的菌体浓度,使不至于加剧供氧的矛盾;
②避免培养基积累有毒代谢物;
③可以提高设备利用率和单位时间的产量,节省发酵罐的非生产时间;
④便于自动控制。
4、发酵控制参数
按性质分类:
物理参数、化学参数、生物参数
按检测手段分类:
①直接参数:
⑴在线检测参数⑵离线检测参数②间接参数
5、发酵热
发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。
Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显-Q辐射
生物热(biologicalheat)是菌体生长过程中直接释放到体外的热能,使发酵液温度升高。
搅拌热(agitationheat)是搅拌器引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量。
6、发酵过程pH值的变化
(1)生长阶段:
菌体产生蛋白酶水解培养基中的蛋白质,生成铵离子,使pH上升至碱性;
随着菌体量增多,铵离子的消耗也增多,另外糖利用过程中有机酸的积累使pH值下降。
(2)生产阶段:
这个阶段pH值趋于稳定。
(3)自溶阶段:
随着养分的耗尽,菌体蛋白酶的活跃,培养液中氨基氮增加,致使pH又上升,此时菌体趋于自溶而代谢活动终止。
7、引起发酵液pH值异常波动的因素
pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件
pH下降:
①培养基中碳、氮比例不当。
碳源过多,特别是葡萄糖过量,或者中间补糖过多加上溶氧不足,致使有机酸大量积累而pH下降;
②消泡剂加得过多;
③生理酸性物质的存在,铵被利用,pH下降。
pH上升:
氮源过多,氨基氮释放,使pH上升;
②生理碱性物质存在;
③中间补料氨水或尿素等碱性物质加入过多。
8、临界氧浓度(criticalvalueofdissolvedoxygenconcentration):
指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。
如对产物形成而言便称为产物合成的临界氧浓度。
呼吸强度又称氧比消耗速率,是指单位质量的干菌体在单位时间内所吸取的氧量,以QO2表示,单位为mmolO2/(g干菌体·
h)。
耗氧速率又称摄氧率,是指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量,以r表示,单位为mmolO2/(L·
9、引起溶氧异常下降,可能有下列几种原因:
①污染好气性杂菌,大量的溶氧被消耗掉,可能使溶氧在较短时间内下降到零附近,如果杂菌本身耗氧能力不强,溶氧变化就可能不明显;
②菌体代谢发生异常现象,需氧要求增加,使溶氧下降;
③某些设备或工艺控制发生故障或变化,也可能引起溶氧下降,如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢,影响供氧能力,使溶氧降低。
10、泡沫的形成及其对发酵的影响
在大多数微生物发酵过程中,通气、搅拌以及代谢气体的逸出,再加上培养基中糖、蛋白质、代谢物等表面活性剂的存在,培养液中就形成了泡沫。
形成的泡沫有两种类型:
一种是发酵液液面上的泡沫,气相所占的比例特别大,与液体有较明显的界限,如发酵前期的泡沫;
另一种是发酵液中的泡沫,又称流态泡沫(fluidfoam),分散在发酵液中,比较稳定,与液体之间无明显的界限
大量的泡沫引起的负作用:
发酵罐的装料系数减少、氧传递系统减小;
增加了菌群的非均一性;
造成大量逃液,增加染菌机会;
严重时通气搅拌无法进行,菌体呼吸受到阻碍,导致代谢异常或菌体自溶;
消泡剂的添加将给提取工序带来困难。
泡沫的消除
调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原料)或改变某些物理化学参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制,以减少泡沫形成的机会。
采用菌种选育的方法,筛选不产生流态泡沫的菌种,来消除起泡的内在因素。
采用机械消泡或消泡剂来消除已形成的泡沫。
常用的消泡剂有4大类:
天然油脂类、脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类
11、不同时间染菌对发酵的影响及处理措施
污染时间:
指用无菌检测方法确准的污染时间,不是杂菌窜入培养液的时间。
①种子培养期染菌由于接种量较小,生产菌生长一开始不占优势,而且培养液中几乎没有抗生素(产物)或只有很少抗生素(产物)。
因而它防御杂菌能力低,容易污染杂菌。
如在此阶段染菌,应将培养液全部废弃。
②发酵前期染菌发酵前期最易染菌,且危害最大。
发酵前期菌量不很多,与杂菌没有竞争优势;
且还未合成产物(抗生素)或产生很少,抵御杂菌能力弱。
可以用降低培养温度,调整补料量,用酸碱调pH值,缩短培养周期等措施予以补救。
如果前期染菌,且培养基养料消耗不多,可以重新灭菌,补加一些营养,重新接种再用
③发酵中期染菌此时染菌会严重干扰产生菌的代谢。
杂菌大量产酸,培养液pH下降;
糖、氮消耗快,发酵液发粘,菌丝自溶,产物分泌减少或停止,甚至会使已产生的产物分解。
有时也会使发酵液发臭,产生大量泡沫。
降温培养,减少补料,密切注意代谢变化情况。
如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐,或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染菌罐,抑制杂菌。
④发酵后期染菌发酵后期发酵液内已积累大量的产物,特别是抗生素,对杂菌有一定的抑制或杀灭能力。
因此如果染菌不多,对生产影响不大。
如果染菌严重,又破坏性较大,可以提前放罐。
造成染菌的主要原因设备渗漏空气带菌种子带菌灭菌不彻底技术管理不善
第九章生物反应动力学
1、生物反应动力学:
研究生物反应过程中各过程变量(细胞生长、底物消耗和产物生成等)在活细胞作用下的变化规律,以及各种反应条件对这些变量变化速度的影响,并以数学、工程学的原理进行定量描述。
研究目的:
研究各种物理,化学因素的影响,为调控提供依据,优化反应工艺条件及调控方式,提高反应的效率。
建立反应过程的动力学模型,模拟最适当的工艺流程和工艺
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- 关 键 词:
- 第一 学期 生物 工艺学 知识点