WHO第五版精子形态解读20101041.ppt
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WHO人精液实验室检查及处理手册人精液实验室检查及处理手册(第(第5版)版)精子形态学部分解读精子形态学部分解读浙江省人类精子库浙江省人类精子库姚康寿姚康寿主任医师主任医师背景背景全球精液检测标准化的需求,WHO制定了人类精液实验室操作手册,用于临床实验室和科研。
第一版第一版1980年年第二版第二版1987年年第三版第三版1992年年第四版第四版1999年年第五版第五版2010年年WHO1WHO11980WHO2WHO21987WHO3WHO31992WHO4WHO41999WHO5WHO52010中文翻译本中文翻译本标准方法标准方法可选择试验可选择试验研究性试验研究性试验精子制备精子制备精子冷冻精子冷冻精液分析精液分析精子制备精子制备质量保证质量保证WHO5th主要内容主要内容附录附录正常形态精子:
正常形态精子:
通过观察来自女性生殖道,特别是经性交后宫颈粘液或从卵子透明带表面回收的精子有助于定义具备潜在受精能力的精子。
ll使用这些标准,对所有男性而言,其正常形态精使用这些标准,对所有男性而言,其正常形态精子百分率的范围大致为子百分率的范围大致为0-30%,很少超过,很少超过25%25%。
ll这个低数据自然产生一个低的临界值这个低数据自然产生一个低的临界值(仅为(仅为3-5%3-5%)。
)。
ll经过经过“透明带选择透明带选择”的精子,正常形态率仍然低,的精子,正常形态率仍然低,约约8-25%8-25%。
篇幅染色方法观察方法参考值第一版10页页改良勃利二氏染色巴氏染色显微镜40倍物镜下观察80.519.4%第二版13页页吉姆萨染色改良巴氏染色勃利二氏染色相差显微镜40倍物镜下观察;也可用100倍油镜,明视野观察50第三版13页页湿片法吉姆萨染色改良巴氏染色勃利二氏染色Shorr染色100油镜亮视野观察湿片法30第四版15页页改良巴氏染色Shorr染色DiffQuik法100油镜亮视野及至少10的目镜下观察*15第五版49页页巴氏染色Shorr染色DiffQuik法100油镜亮视野及至少10的目镜下观察4(下限)(下限)WHOWHO不同版本精子形态学内容比较不同版本精子形态学内容比较不同版本精子形态学内容比较不同版本精子形态学内容比较精子形态学分析包括以下步骤精子形态学分析包括以下步骤nn精液涂片的制备精液涂片的制备nn固定和染色固定和染色nn封片封片nn精子形态评估(应制备精子形态评估(应制备双份涂片双份涂片双份涂片双份涂片重复评估,每张涂重复评估,每张涂片应评估至少片应评估至少200200200200个精子)个精子)。
nn双份片评估(百分率)结果比较(差异是否在可接双份片评估(百分率)结果比较(差异是否在可接受范围内,如果不可接受,重新读片)受范围内,如果不可接受,重新读片)。
nn取平均值,报告结果取平均值,报告结果精液涂片的制备nn充分混匀混匀精液样本。
nn快速取样,避免精子从混悬的精液样本中沉降。
nn重复取样前,再次混匀精液样本。
nn根据精液样本具体不同情况,采用不同的涂片方式。
(aa)对于未稀释的精液,采用拉薄技术,将一滴精液(对于未稀释的精液,采用拉薄技术,将一滴精液(SS)沿成角的载玻片背侧边缘展开,沿成角的载玻片背侧边缘展开,向前拖拉向前拖拉制成涂片。
制成涂片。
(bb)对于洗涤的精液,采用滴管法,水平持滴管(对于洗涤的精液,采用滴管法,水平持滴管(PP)推进,)推进,将一滴精子悬液(将一滴精子悬液(SSSS),沿载玻片的表面展开。
),沿载玻片的表面展开。
正常精液标本nn使用拉薄技术拉薄技术,取一滴精液在载玻片的表面上涂片。
nn磨砂载玻片的两面,用不起毛软纸擦干净。
nn用HB或No.2铅笔,在载玻片的磨砂处标记上身份编号、日期。
nn根据精子密度,取5-10l的精液滴在载玻片的一端。
用第二张载玻片作为拉片,沿着载玻片的表面拖拉精液滴。
nn涂片经空气干燥后,立即固定、染色。
一开始,可以用一开始,可以用10l10l的精液,的精液,4545角度,角度,一秒钟一秒钟一秒钟一秒钟的时间涂片。
的时间涂片。
为了减少涂片上精子间的相互重叠,如果需要,可以改变上为了减少涂片上精子间的相互重叠,如果需要,可以改变上述参数(述参数(10l10l,4545,11秒)。
秒)。
精液的粘稠度越低,涂片的拉薄技术发挥得越好,拉薄技术精液的粘稠度越低,涂片的拉薄技术发挥得越好,拉薄技术不适用于高度粘稠的精液。
不适用于高度粘稠的精液。
拉薄技术拉薄技术nn精子密度低的标本假如精子密度低于2106/ml,浓缩标本nn粘稠精液标本精浆高度粘稠时涂片往往是厚而不均,可以按与液化不良精液标本相同的处理方法或者使用洗涤的方法处理。
染色方法染色方法推荐的染色方法有nnPapanicolaou染色法nnShorr染色法nnDiff-Quik染色法。
用上述三种染色方法,在光学显微镜亮视野下观察,精子头部的顶体区染成淡蓝色paleblue,顶体后区染成深蓝色darkblue,中段可能染成红色,尾部染成蓝色或淡红色reddish。
通常位于头部背后或中段周围的胞浆小滴染成粉红色、红色(巴氏染色)或者橘红色(Shorr染色)。
改良巴氏染色步骤11、80%80%乙醇乙醇3030秒秒22、50%50%乙醇乙醇3030秒秒33、纯水、纯水3030秒秒44、HarrisHarris苏木精苏木精44分钟分钟55、纯水、纯水3030秒秒66、酸性乙醇、酸性乙醇4848次次*77、流水洗、流水洗55分钟分钟88、50%50%乙醇乙醇3030秒秒99、80%80%乙醇乙醇3030秒秒1010、95%95%乙醇乙醇至少至少1515分钟分钟1111、橙黄、橙黄G61G61分钟分钟1212、95%95%乙醇乙醇3030秒秒1313、95%95%乙醇乙醇3030秒秒1414、95%95%乙醇乙醇3030秒秒1515、EA-501EA-501分钟分钟1616、95%95%乙醇乙醇3030秒秒1717、95%95%乙醇乙醇3030秒秒1818、100%100%乙醇乙醇1515秒秒1919、100%100%乙醇乙醇1515秒秒主要溶液的作用nn乙醇乙醇固定细胞;并且使细胞脱水固定细胞;并且使细胞脱水nn苏木精苏木精使细胞核染成蓝色使细胞核染成蓝色nn酸性乙醇酸性乙醇去除胞浆中非特定区域的染料去除胞浆中非特定区域的染料(脱色)(脱色)nn自来水自来水去除未与细胞核结合的苏木精去除未与细胞核结合的苏木精nn橙黄橙黄G-6G-6使胞浆染成粉红色使胞浆染成粉红色nnEA-50EA-50使胞浆染成粉红色使胞浆染成粉红色WHOWHO第第第第44版与第版与第版与第版与第55版巴氏染色主要步骤比较版巴氏染色主要步骤比较版巴氏染色主要步骤比较版巴氏染色主要步骤比较内容内容WHOWHO第第44版版WHOWHO第第55版版总步骤:
总步骤:
2323步步1919步步固定液:
固定液:
95%95%乙醇乙醇+95%+95%乙醚乙醚95%95%乙醇乙醇浓度梯度:
浓度梯度:
80%80%、70%70%、50%50%80%80%、50%50%50%50%、70%70%、80%80%、90%90%(1010秒秒秒秒)50%50%、80%80%、95%95%(1515分分分分)苏木精时间:
苏木精时间:
33分分44分分橙黄橙黄G6G6时间:
时间:
22分分11分分EA-50EA-50时间:
时间:
55分分11分分酒精浸入时间:
酒精浸入时间:
各各1010次次各各3030秒秒11、第、第55版共版共1919步步步步,第,第44版共版共2323步步步步,减少了,减少了44个步骤。
个步骤。
22、由于苏木精后没有流水冲洗,导致染液残留较、由于苏木精后没有流水冲洗,导致染液残留较多,多,酸性乙醇酸性乙醇酸性乙醇酸性乙醇的更换频率明显增加。
的更换频率明显增加。
33、第、第55版染色所需时间较版染色所需时间较44版约增加版约增加1010分钟分钟分钟分钟以上。
以上。
44、染色效果、染色效果相似相似相似相似。
WHOWHO第第第第44版与第版与第版与第版与第55版巴氏染色总结版巴氏染色总结版巴氏染色总结版巴氏染色总结WHOWHO第第第第44版与第版与第版与第版与第55版染色效果比较版染色效果比较版染色效果比较版染色效果比较WHOWHO第第第第44版版版版WHOWHO第第第第55版版版版Shorr染色步骤nn11、流水、流水浸浸12-1512-15次次*nn22、苏木精、苏木精1-21-2分钟分钟nn33、流水、流水浸浸12-1512-15次次*nn44、乙醇胺、乙醇胺浸浸1010次次*nn55、流水、流水浸浸12-1512-15次次nn66、50%50%乙醇乙醇55分钟分钟nn77、ShorrShorr溶液溶液3-53-5分钟分钟nn88、50%50%乙醇乙醇55分钟分钟nn99、75%75%乙醇乙醇55分钟分钟nn1010、95%95%乙醇乙醇55分钟分钟Shorr染色可以得到与巴氏染色相近的正常形态精子百分率精子形态的快速染色程序nn1、快速染液110秒nn2、快速染液25秒nn3、流水浸10-15次去除多余染剂一些用快速染色法染的涂片背景很深,染色的质量可能比巴氏染色方法差。
精子封片前的处理有两种液体封片剂:
溶于乙醇的和不溶于乙醇。
nn使用溶于乙醇的封片剂,染色完成后,在涂片未干的情况下立即使用该封片剂进行封片。
nn使用不溶于乙醇的封片剂,将涂片在二甲二甲苯苯中浸1分钟分钟(在通风柜中操作),沥干1-2秒钟后立即封片,封片时应保持涂片的湿润。
精子涂片的封片11、滴、滴2-32-3小滴封片剂在载玻片上。
小滴封片剂在载玻片上。
22、将盖玻片(、将盖玻片(24mm50mm24mm50mm或或24mm60mm24mm60mm最最合适)直接放置在载玻片上。
合适)直接放置在载玻片上。
33、盖玻片先接触封片剂,从载玻片的长边开始放置,、盖玻片先接触封片剂,从载玻片的长边开始放置,以防止产生气泡。
以防止产生气泡。
44、如有需要,轻轻地按压盖玻片的顶端以使气泡移、如有需要,轻轻地按压盖玻片的顶端以使气泡移到载玻片的边缘。
到载玻片的边缘。
55、擦掉载玻片底下多余的二甲苯(如果使用二甲苯)、擦掉载玻片底下多余的二甲苯(如果使用二甲苯)。
66、在通风柜内,把已封片的涂片水平地放在载玻片、在通风柜内,把已封片的涂片水平地放在载玻片烘干架上,或者放在吸水纸上干燥烘干架上,或者放在吸水纸上干燥2424小时。
小时。
精子形态学评估标准nn在评估精子正常形态时应采用严格标准(在评估精子正常形态时应采用严格标准(KrugerKrugeretal.,1986;etal.,1986;MenkveldMenkveldetal.,1990;Coetzeeetal.,etal.,1990;Coetzeeetal.,19981998)。
)。
nn精子包括精子包括头、颈、中段、主段和末端头、颈、中段、主段和末端头、颈、中段、主段和末端头、颈、中段、主段和末端。
由于通过。
由于通过光学显微镜很难观察到精子末端,因此可以认为光学显微镜很难观察到精子末端,因此可以认为细胞是由头(和颈)和尾(中段和主段)组成。
细胞是由头(和颈)和尾(中段和主段)组成。
只有头和尾都正常的精子才认为是正常的。
只有头和尾都正常的精子才认为是正常的。
所有所有所有所有处于临界状态的精子均认为是异常。
处于临界状态的精子均认为是异常。
处于临界状态的精子均认为是异常。
处于临界状态的精子均认为是异常。
精子精子头部头部判断标准判断标准分类分类WHO第第5版版WHO第第4版版正常标准精子头外形上应该光滑、规则,大体上呈椭圆形大体上呈椭圆形;长度95%可信限区间为3.7-4
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- WHO 第五 精子 形态 解读 20101041
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