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土壤
StudyontheResidueDetectionandDegradationofAbamectininAgriculturalSoil
ABSTRACT:
AbamectinisthemostcommonlyusedBiologicalpesticidesonpreventionandcureofmainpestsanddiseasesofcrops,suchasriceleafrollerdisease.IthasbeenwidelyusedinChinaandothercountries.Thisstudyestablishedamethodofpre-treatmentandinstrumentalanalysisofabamectinthroughtheexperiments,anddiscusseditsdegradationinsoil.Acetonewasusedtoextracttheresidueofabamectininsoilundertheconditionofoscillation.EstablishedWatersAllianceHPLCasthemethodofinstrumentalanalysis,choosingXBridgeTMC18column(4.6mm&
m)asthecolumn.Usedthewayofconstantcurrentelution,andthemethanol:
waterasthemobilephase.UVdetectorwaschosenfordeterminingthecontentofabamectinatthewavelengthof245nm.Theresultindicatedthatthelowestdetectionlimitofabamectininthesoilsamplewas0.016mg/L,andthemethodhadagoodlinearitywithpeakareawithin0.016mg/L-323.3mg/L.ThelinearregressionequationwasY=35170X+,anditscorrelationcoefficientwas0.9999.TheRecoverieswere88.05%to99.97%whentheconcentrationoftheabamectinstandardrangedfrom0.1to10mg/kg,andthecoefficientsofvariationwere0.52%to6.39%.Thedegradationhalf-lifeofabamectinwas5.7d.Thedatashowedthatthemethodmetthedemandsofpesticideresidueanalysis.
1.4.1阿维菌素在土壤中的降解情况-7-
1.4.2阿维菌素在水溶液中的降解情况-9-
1.5高效液相色谱法简介-11-
第二章课题的研究目的与意义-12-
2.1研究目的-12-
2.2研究意义-12-
第三章高效液相色谱分析方法的建立-13-
3.1阿维菌素标准溶液的配制-13-
3.2色谱条件的确定-13-
3.3标准曲线及其线性范围-14-
3.4方法回收率及检出限-16-
3.4.1方法回收率-16-
3.4.2最低检出限-17-
第四章土壤样品前处理方法的建立-18-
4.1土壤样品的采集-18-
4.2土壤样品的预处理-18-
4.3土壤中阿维菌素的提取方法-18-
4.3.1萃取试剂的选择-18-
4.3.2阿维菌素的提取-19-
第五章阿维菌素的残留与降解研究-20-
5.1阿维菌素的降解研究-20-
5.1.1研究方法的建立-20-
5.1.2研究结果-20-
5.1.3结论-22-
第六章结论-23-
致谢-24-
参考文献-25-
第一章绪论部分
1.1阿维菌素简介
阿维菌素,分子式:
C48H72O14(B1a)&
bull;
C47H70O14(B1b),英文名称Avermectins,是由日本北里大学大村智等和美国Merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物,由链霉菌中灰色链霉菌Streptomycesavermitilis发酵产生。
天然Avermectins中含有8个组分,主要有4种即A1a、A2a、B1a和B2a,其总含量&
ge;
80%;
对应的4个比例较小的同系物是A1b、A2b、B1b和B2b,其总含量&
le;
20%。
我国20世纪80年代末由上海市农药研究所开发的从广东揭阳土壤中分离筛选得到7051菌株,后经鉴定证明该菌株与S.avermitilisMa-8460相似,与avermectin的化学结构相同。
1993年北京农业大学新技术开发总公司立项研究并生产开发此药。
Avermectin是一种新型抗生素类,具有结构新颖、农畜两用的特点。
随着人们生活水平的提高以及对绿色食品的呼唤,生物农药在当前农药市场中倍受青睐。
据报道欧洲生物农药将从1997年1亿美元的销售额上升到2004年1.69亿美元。
Avermectins是当前生物农药市场中最受欢迎和具激烈竞争性的新产品。
目前市售Avermectin农药是以abamectin为主要杀虫成分(AvermectinB1a+B1b,其中B1a不低于90%、B1b不超过5%),以B1a的含量来标定。
自从1991年阿维菌素进入我国农药市场以后,Avermectis农药在我国的害虫防治体系中占有较重要地位。
1.1.2阿维菌素的作用方式及特点
阿维菌素的主要特点为触杀,胃毒,渗透力强。
它是一种大环内酯双糖类化合物,是从土壤微生物中分离的天然产物,对昆虫和螨类具有触杀和胃毒作用并有微弱的熏蒸作用,对叶片有很强的渗透作用,可杀死表皮下的害虫,且残效期长。
其作用机制与一般杀虫剂不同的是它干扰神经生理活动,刺激释放r-氨基丁酸,而r-氨基丁酸对节肢动物的神经传导有抑制作用,螨类成、若螨和昆虫与幼虫与药剂接触后即出现麻痹症状,不活动不取食,2-4天后死亡。
因不引起昆虫迅速脱水,所以它的致死作用较慢。
对捕食性和寄生性天敌虽有直接杀伤作用,但因植物表面残留少,因此对益虫的损伤小。
对根节线虫作用明显。
1.2阿维菌素的分析方法
1.2.1固相萃取-高效液相色谱法
李红英和马鹏飞[2]在2011年测定废水样本中阿维菌素含量的固相萃取-高效液相色谱法,能够快速准确地测定废水中的阿维菌素浓度。
将待测水样经Sep-Pak固相萃取柱分离净化后,以甲醇-水(95+5)为流动相,以10ml的95%乙醇溶液作为洗脱液,在紫外检测器波长为244nm处进行高效液相色谱进行测定。
该方法先采用固相萃取技术对废水中阿维菌素进行分离富集,再用高效液相色谱(HPLC)法进行分析测定,灵敏度较高,适用于废水样品等水溶液样品中阿维菌素含量的测定(因水溶液中阿维菌素浓度较低)。
方法的检出限为19.3&
g/L,平均回收率为92.8%~104.0%,RSD为4.8~5.3%。
该方法操作简便,快速准确,适用于废水中阿维菌素含量的检测。
1.2.2柱前衍生-高效液相色谱法
贾方[2]等在2011年测定牛筋样本中阿维菌素含量的柱前衍生-高效液相色谱法,给研究者提供了测定动物体内阿维菌素浓度的一种较便捷的方法。
先用乙腈对牛筋样本中的阿维菌素进行提取,再用C18固相萃取柱净化,净化液经N-甲基咪唑和三氟乙酸酐的乙腈溶液在室温下进行衍生化,所得阿维菌素和伊维菌素衍生物用高效液相色谱法分析。
选用C18色谱柱(4.6mm&
150mm,5&
m)为固定相,以乙腈-水(97:
3)溶液为流动相进行淋洗,于激发波长365nm和发射波长470nm处进行荧光检测。
1.2.4反相高效液相色谱法
刘魁[2]等在2007年用反相高效液相色谱法测定了绿色环保新剂型农药阿维菌素泡腾片中的阿维菌素浓度。
实验中使用了C18液相色谱柱,以甲醇-乙腈-水(体积比42∶42∶16)为流动相,UV检测波长为245nm。
该方法适用于测定阿维菌素泡腾片的含量,即直接测定农药商品中所含阿维菌素的含量。
具有操作简便、快速、分离效果好、峰型好、线性范围宽、精密度和准确度高、专属性好等特点,是进行产品质量控制较理想的分析方法。
该方法的标准偏差为0.57,变异系数为0.57%,回收率在99.6%~100.1%之间。
1.2.5高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)
荧光检测法使检测的选择性和灵敏度显著提高,检测限较紫外检测法约低1个数量级,可满足阿维菌素类药物残留分析需要,但该方法对样品净化和操作要求严格,同时具有操作简单、灵敏度高、结果可靠等优点。
实验中所用到的常用净化方法有多种,如固相柱萃取法(SPE),氨基柱净化法,C8柱净化法等等。
该方法结合了柱前衍生-高效液相色谱法和液相色谱荧光法两种测定方法,适用于稻谷、秸秆等常见农作物中阿维菌素残留量的测定。
该方法灵敏性较高,经张娟[2]等实施该方法后,发现在稻谷中的最小检测浓度为1.000&
g/kg,在秸秆中的最小检测浓度为0.500&
g/kg。
1.2.6高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)
阿维菌素类药物具有共轭二烯结构,在&
lambda;
=245nm处呈现紫外吸收峰,用HPLC-UV检测可能比较方便,但在此波长区域,皮质激素、维生素、脂类、核酸等这些内源性物质也呈现紫外吸收特征,这些组织内源性物质净化困难,干扰了阿维菌素类药物的紫外光谱检测。
实际上,应用高效液相色谱-紫外检测器检测的也只有血浆样品比较成功(检测限达0.002mg,L),组织样品中药物的检测限都高于0.005mg/kg,且净化程序较为繁琐。
1.3阿维菌素目前在各环境中的残留情况
农药为防治农业病虫草害,保证作物高产发挥着巨大的作用。
但农药是一把双刃剑,在带给人们巨大的经济收益和促进农业发展的同时,也对生态环境和人体健康造成了严重的威胁。
阿维菌素可进入环境土壤和水体,对敏感的环境生物如鱼、节肢动物、软体动物等产生毒性效应,对生态环境产生负面影响,同时,阿维菌素也能通过食物链的传递而影响人体的健康。
故有必要对于各种可能含有阿维菌素的样品进行分析检测,以便于监测环境中阿维菌素的残留污染程度。
1.3.1阿维菌素在水样品中的残留
水体中存在的阿维菌素一部分往往是施药不当或施药过多引起的。
当被施药后的动物群进入水域中活动或饮水时,极有可能将身上未完全吸收的阿维菌素带入水域中。
淡水生物如水蚤和鱼类对阿维菌素类药物高度敏感,但由于药物与土壤紧密结合,不溶于水,迅速光解等特性极大地降低了其在自然环境中对水生生物的毒性。
故残留在水流域中的阿维菌素不会对环境带来较强的危险性。
水体中的另一部分阿维菌素的存在则是来自于水域中水生生物的排泄行为。
由于阿维菌素无论以何种途径给何种动物用药,主要是经粪便和尿排出,其中大部分以原药形式自粪便排出,而经尿液排出量不到2%,故在对鱼体施药后,水体中的阿维菌素浓度开始上升,而在施药后期,水体中的阿维菌素浓度变化则稍小。
水体中的阿维菌素含量会随着鱼体代谢、光照因素(产生了降解行为)浓度降低。
由于阿维菌素在水样品中的残留浓度较低,周海明和姚芳[2]选用了灵敏度较高的高效液相色谱-荧光法(HPLC-FD)来检测水样品中残留的阿维菌素浓度。
在最佳实验条件下,该方法线性范围上限可以达到1.0&
104&
g/l,若将4倍信噪比(S/N=4)作为此方法的检测下限,则阿维菌素标准液的检测下限为1&
g/l,故可推算出该方法在水样品中的最低检测浓度为1&
g/l,符合阿维菌素残留的分析要求。
该方法中采用了3个不同浓度的平行水样品进行检测,相对偏差范围在8.60%&
mdash;
10.82%,有些水样的标准偏差超出了10%,但考虑到添加回收的浓度水平较低,且实验条件不尽相同等方面,该实验方法的精度还是能够满足分析的基本要求。
1.3.3阿维菌素在土壤样品中的残留
阿维菌素在土壤中的分布最为广泛。
阿维菌素在土壤中的吸附率较快,一般几个小时即可达到吸附平衡,故在养殖户进行施药时,小部分的阿维菌素会迅速被土壤吸收而残留在土壤中。
徐浩然[3]等在2011年选用了高效液相色谱法来测定土壤中的阿维菌素残留量,实验时可根据工作条件选择其他仪器来作为搭配,如高效液相色谱法紫外检测器。
测定土壤中的阿维菌素残留浓度时,在提取剂上有甲醇、丙酮、乙腈等几种选择,其中以丙酮的提取效果最佳,甲醇次之,二氯甲烷的提取率较之则不理想。
故综合考虑可用提取剂的沸点、提取率等因素,在实验时可优先选择丙酮溶液作为土壤中阿维菌素的提取剂。
因土壤中含有大量有机物,而丙酮对大多数有机物均有提取作用,所以基体干扰的存在可能会影响检测灵敏度,所以对于作为提取剂的丙酮必须进行净化,以免吸附土壤中其他有机杂质而在紫外光谱上出现大量杂峰,干扰最终结果数据。
在萃取剂的选择上,常见选择有石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷等,其中以二氯甲烷的萃取率最高(可达86.2%),三氯甲烷次之(大约在70.4%左右),石油醚则较低(约为67.8%),在这三种常见的萃取剂中,石油醚与三氯甲烷的毒性都比较高,在考虑环境污染以及提取率的情况下,一般选择二氯甲烷作为萃取剂。
在实验时优化色谱条件,能够使高效液相色谱紫外检测法在阿维菌素浓度为0mg/l&
12.1mg/l的范围内呈良好线性,检出限为0.014mg/kg。
检测样品时同时做空白试验,空白土壤加标样品平行测定的RSD&
6.5%(最低为3.7%),回收率为78.6%&
83.1%,在施药后的一段时期内持续对土壤中的阿维菌素残留浓度进行检测,结果发现阿维菌素浓度呈持续下降状态,这表明了阿维菌素在土壤中的消解速率较快。
1.4.1.1土壤类型对阿维菌素降解产生的影响
以湿润雏形土、湿润富铁土、湿润淋溶土、潮湿雏形土和正常盐成土五种常见土壤类型为例,这五种类型土壤的有机质含量以潮湿雏形土最高,接下来依次为湿润淋溶土、湿润富铁土、正常盐成土、湿润雏形土,经张卫[6]实验发现,阿维菌素在土壤中的降解速率与土壤中的有机质含量有密切关系,有机质含量越高,阿维菌素的降解速率越快,这种情况可能与土壤中所含的微生物数量有关,因为土壤中有机质含量越高,则土壤中微生物数量就越多,由此可见环境中微生物的存在对阿维菌素的降解有着相当大的影响。
1.4.1.2环境温度对阿维菌素降解产生的影响
土壤中的阿维菌素在不同温度下的降解速率存在明显的差异。
在15-35℃这一范围内,环境温度的升高会促使阿维菌素加快降解速率,出现这种情况的愿意可能是升高温后,土壤中的有机物粘度随之降低,挥发性增大,导致了生物可利用性增强。
另一主要原因可能是当环境温度逐渐升高,到达微生物生长的最适合温度时,土壤中的微生物酶活性发生了大幅度提高,导致了阿维菌素的降解速率加快。
而当温度过高,超过了微生物生长的最适合温度时,微生物酶活性则相对减低,微生物活动受到一定抑制,故阿维菌素的降解速率开始变慢,尤其是在45℃时,阿维菌素的半衰期发生了明显的延长。
1.4.1.3阿维菌素浓度对阿维菌素降解产生的影响
在一定范围内,升高阿维菌素浓度,即加大施药量,有利于阿维菌素在土壤中的降解。
发生这一现象的原因可能是微生物在降解过程中以阿维菌素作为底物,在还未达到其毒性耐受极限时,适当的高浓度的阿维菌素会使微生物个体的数量在降解初期发生明显增加,从而导致了阿维菌素降解半衰期的缩短。
当阿维菌素浓度超过微生物的毒性耐受极限时,部分微生物的活动受到明显抑制,并逐渐死亡,这一情况又导致了阿维菌素的降解速率趋于下降状态。
1.4.2.3pH值对阿维菌素降解产生的影响
在相同的光源条件下,水溶液的pH值对于阿维菌素的光解速率稍有影响,这可能是和阿维菌素的光化学反应机理有关,即在碱性、中性水溶液中,存在大量的OH-,有利于阿维菌素进行光降解反应。
总体而言,随着水溶液pH值的增大,阿维菌素光解速率增大,但总体差异并不显著。
1.4.2.4共存污染物对阿维菌素降解产生的影响
1.4.2.4.1硝酸盐对阿维菌素降解产生的影响
NO3-是水溶液中常见的一种阴离子,由于其具有光化学活性,在阳光辐射的条件下可以发生光解,从而生成氮氧自由基(&
NO)和羟基自由基(&
OH)等。
NO3-对于阿维菌素在水溶液中的光解具有一定的光猝灭作用。
产生这一现象的原因可能是阿维菌素的最大紫外吸收波长在245nm,而硝酸盐也具有较强的紫外吸收,所以从某种角度来说,水溶液中硝酸盐的存在对阿维菌素的光解起到了一定的竞争作用,从而导致了阿维菌素的光解受到抑制。
随着水溶液中NO3-浓度的增大,其对阿维菌素的光猝灭作用也增强,但总体差异并不显著。
1.4.2.4.2色素对阿维菌素降解产生的影响
以甲基绿和甲基橙两种色素举例。
这两种色素对于阿维菌素在水溶液中的光解都表现出了一定程度的光猝灭作用,其中甲基绿对阿维菌素光解的光猝灭作用稍强。
水溶液中色素对阿维菌素光解产生的光猝灭作用原因可能是色素阻挡了光源的透过,对水溶液中的阿维菌素产生了光屏蔽作用,致使阿维菌素分子可接收到的光源减少,从而降低了阿维菌素的光解速率。
1.4.2.4.3表面活性剂对阿维菌素降解产生的影响
表面活性剂是一种&
ldquo;
两亲性&
rdquo;
的物质,同时含有亲水基和憎水基。
水溶液中低浓度的表面活性剂会通过影响吸收光谱系对某些农药的光解产生影响。
水溶液中存在的表面活性可导致阿维菌素的光化学行为发生显著改变。
以常见的阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠为例,其对阿维菌素的光解也具有一定的光猝灭作用,这是由于水溶液中表面活性剂的存在对阿维菌素的光吸收产生了竞争作用,导致阿维菌素分子可接受到的光源减少,降低了阿维菌素的光解速率,且水溶液中表面活性剂的浓度越高,其对阿维菌素光解的光猝灭效应越大。
高效液相色谱法的主要特点为:
(1)高压:
液相色谱法以液体为流动相(称为载液),液体流经色谱柱,受到阻力较大,为了迅速地通过色谱柱,必须对载液施加高压。
一般可达150~350&
105Pa。
(2)高速:
流动相在柱内的流速较经典色谱快得多,一般可达1~10ml/min。
高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多,一般少于1h。
(3)高效:
近年来已研究出许多新型固定相,使分离效率大大提高。
(4)高灵敏度:
高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器,进一步提高了分析的灵敏度。
如荧光检测器灵敏度可达10-11g。
另外,用样量小,一般几个微升。
(5)适应范围宽:
气相色谱法虽具有分离能力好,灵敏度高,分析速度快,操作方便等优点,但是受技术条件的限制,沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。
而高效液相色谱法,只要求试样能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大(大于400以上)的有机物(这些物质几乎占有机物总数的75%~80%)原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。
据统计,在已知化合物中,能用气相色谱分析的约占20%,而能用液相色谱分析的约占70~80%
第二章课题的研究目的与意义
2.1研究目的
本课题研究目的如下:
(1)基本了解高效液相色谱仪的原理构造。
(2)掌握高效液相色谱仪的使用,并学习建立高效液相色谱法测定阿维菌素的方法。
(3)利用建立好的测定阿维菌素的高效液相色谱法方法,研究阿维菌素在农田土壤中的残留情况以及降解行为。
2.2研究意义
阿维菌素是当前市面上防治稻纵卷叶螟等农作物主要病虫害的用量最大的一种生物源农药,在国内自2005年以来,年使用量快速增长而阿维菌素过量过度的使用已经开始对人类生存环境产生一定的影响,及时研究及控制阿维菌素在自然环境中的残留及其降解行为,能够为环保事业做出贡献。
实验开始阶段,采用恒流洗脱方式,流动相比例确定为双蒸水:
甲醇=5:
95。
将浓度为0.44mg/L的阿维菌素标准液按照上述操作条件进行检测后,得到的色谱图如图
(1)所示。
图
(1)0.44mg/L阿维菌素标准液色谱图
从图
(1)可以看出阿维菌素的出峰时间在4.5min左右,保留时间适中,色谱峰形尖锐、对称,虽有杂质峰的出现,但并未对实验结果造成较大干扰,可以认为是较好的出峰情况,符合实验要求。
以此色谱条件进行后续实验。
3.3标准曲线及其线性范围
取浓度分别为323.3mg/L、107.8mg/L、35.92mg/L、11.98mg/L、3.99mg/L、1.33mg/L、0.44mg/L、0.148mg/L、0.049mg/L、0.016mg/L的阿维菌素标准液1mL,在上述色谱条件下进行色谱分析,得到该方法下阿维菌素的典型图谱,如图
(2)所示。
阿维菌素的出峰时间为4.5min。
图
(2)不同浓度的阿维菌素标准液色谱图
以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标作标准曲线,如图(3)所示。
得到标准样线性方程和相关系数,Y=35170X+,R2=0.9999。
从图中可以看出此标准曲线在浓度为0.016mg/L-300.00mg/L之间呈现良好的线性关系。
图(3)阿维菌素线性关系图
3.4方法回收率及检出限
3.4.1方法回收率
在空白土壤中分别添加了3种剂量的阿维菌素标准溶液,加标量分别为0.1mg、1.0mg、10.0mg,每个质量浓度水平测定3次,确定其回收率,如表
(1)所示。
加标量回收浓度(mg/L)回收率
0.11.8391.43%
0.11.8893.94%
0.11.7688.05
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