生物基因的研究 中英Word格式文档下载.docx
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限制向内切酶和DNA连接酶的多样性,使得我们可以将DNA序列当做模块,一段DNA序列被移动到其他DNA序列中是可行的。
因此,核酸酶学是重组DNA技术的基础。
Asecondfoundationisthebase-pairinglanguagethatallowscomplementarysequencestorecognizeandbindtoeachother.HybridizationwithcomplementaryDNAorRNAprobesisasensitiveandpowerfulmeansofdetectingspecificnucleotidesequences.InrecombinantDNAtechnology,base-pairingisusedtoconstructnewcombinationsofDNAaswellastodetectandamplifyparticularsequences.Thisrevolutionarytechnologyisalsocriticallydependentonourunderstandingofviruses,theultimateparasites.VirusesefficientlydelivertheirownDNA(orRNA)intohosts,subvertingthemeithertoreplicatetheviralgenomeandproduceviralproteinsortoincorporateviralDNAintothehostgenome.Likewise,plasmids,whichareaccessorychromosomesfoundinbacteria,havebeenindispensableinrecombinantDNAtechnology.
第二个基础是碱基互补配对原则,使得互补序列可以相互识别和结合。
与互补的DNA或RNA探针的杂交是一个敏感的和强有力检测特定核苷酸序列的方法。
在重组DNA技术中,碱基配对被用来构建新的DNA的组合,也可以用来检测和放大特定的序列。
这一革命性的技术也严重性的依赖我们对病毒的理解,最终是是寄生虫。
病毒可以将他们的DNA(RNA)高效的转入宿主细胞,颠覆宿主细胞,使其复制病毒的基因组并生产病毒蛋白,或者经自己的基因直接整合到宿主细胞。
同样,在大肠杆菌发现的染色体附件-质粒,在重组DNA技术中也是不可或缺的。
Thesenewmethodshavewide-rangingbenefits.Entiregenomes,includingthehumangenome,arebeingdeciphered.Newinsightsareemerging,forexample,intotheregulationofgeneexpressionincanceranddevelopmentandtheevolutionaryhistoryofproteinsaswellasorganisms.Newproteinscanbecreatedbyalteringgenesinspecificwaystoprovidedetailedviewsintoproteinfunction.Clinicallyusefulproteins,suchashormones,arenowsynthesizedby
recombinantDNAtechniques.Cropsarebeinggeneratedtoresistpestsandharshconditions.ThenewopportunitiesopenedbyrecombinantDNAtechnologypromisetohavebroadeffects.
这种新方法具有广泛的利益。
对于整个基因组,包括人类基因组,都被破译了。
新的见解兴盛,列如,癌症的发展及表达和调节,蛋白质和生物体的演变历史。
通过改变特定基因的方法生产新的蛋白,这样可以为蛋白质的作用机理提供详细的意见。
临床用蛋白质,列如,激素,正在通过重组DNA技术合成。
正在是农作物具有杭虫和抗恶劣条件的性能。
通过重组DNA技术,新的机会定会带来更广泛的用途。
Processessuchasdevelopmentfromacaterpillarintoabutterflyinvolvedramaticchangesinpatternsofgeneexpression.TheexpressionlevelsofthousandsofgenescanbemonitoredthroughtheuseofDNAarrays.Atright,aGeneChiprevealstheexpressionlevelsofmorethan12,000humangenes;
thebrightnessofeachspotindicatestheexpressionlevelofthecorrespondinggene.[(Left)RogerHart/Rainbow.(Right)GeneChipcourtesyofAffymetrix.]
例如从毛毛虫转变成蝴蝶的过程,涉及到基因表达模式的急剧变化。
数以千计的基因表达水平可以通过DNA阵列进行检测。
在右边,基因芯片发现超过12,000人的基因的表达水平,每个点的亮度显示相应的基因的表达水平。
罗杰·
哈特(左)/彩虹。
(右)Affymetrix公司的基因芯片。
6.1.TheBasicToolsofGeneExploration
6.1生物基因研究的基本工具
Therapidprogressinbiotechnologyindeeditsveryexistenceisaresultofarelativelyfewtechniques.
1.Restriction-enzymeanalysis.Restrictionenzymesareprecise,molecularscalpelsthatallowtheinvestigatortomanipulateDNAsegments.
2.Blottingtechniques.TheSouthernandNorthernblotsareusedtoseparateandcharacterizeDNAandRNA,respectively.TheWesternblot,whichusesantibodiestocharacterizeproteins,wasdescribedinSection4.3.4.
3.DNAsequencing.TheprecisenucleotidesequenceofamoleculeofDNAcanbedetermined.Sequencinghasyieldedawealthofinformationconcerninggenearchitecture,thecontrolofgeneexpression,andproteinstructure.
4.Solid-phasesynthesisofnucleicacids.Precisesequencesofnucleicacidscanbesynthesizeddenovoandusedtoidentifyoramplifyothernucleicacids.
5.Thepolymerasechainreaction(PCR).ThepolymerasechainreactionleadstoabillionfoldamplificationofasegmentofDNA.OnemoleculeofDNAcanbeamplifiedtoquantitiesthatpermitcharacterizationandmanipulation.Thispowerfultechniqueisbeingusedtodetectpathogensandgeneticdiseases,todeterminethesourceofahairleftatthesceneofacrime,andtoresurrectgenesfromfossils.
Afinaltool,theuseofwhichwillbehighlightedinthenextchapter,isthecomputer.Withoutthecomputer,itwouldbeimpossibletocatalog,access,andcharacterizetheabundantinformation,especiallyDNAsequenceinformation,thatthetechniquesjustoutlinedarerapidlygenerating.
生物技术的快速进步(的确存在)的结果是一个相对较少的技术。
1限制向内切酶分析限制性内切酶是非常精确的,允许研究者来操作DNA片度的分子手术手术刀。
2印记技术Southern和Northern杂交是分别用来分离和鉴定DNA和RNA。
Western杂交法是利用抗体来建党蛋白质的。
我们在4.4.3已经描述过。
3DNA序列一个DNA分子的核苷酸序列可以被精确的确定。
测序已经获得了丰富的有关于基因结构,积阴德调控表达,以及蛋白质结构的信息。
4固定核苷酸序列的合成精确的核苷酸序列可以从头合成,可被用来鉴定的放大其他的核苷酸序列。
5PCR反应聚合酶链式反应可以使一个DNA片段发达百亿万倍。
一个分子中的DNA可以被放大到允许表征和操纵的数量。
这项强大的技术已经用于检测病原体、基因疾病、鉴定犯罪现场的头发以及从化石中复活的基因。
最后一个工具,电脑,将在下一章中突出的介绍,如果没有计算机,我们将无法对这么丰富的信息进行编目录、存取及特性表征,尤其是DNA序列信息技术的快速生成。
6.1.1.RestrictionEnzymesSplitDNAintoSpecificFragments
6.1.1限制性内切酶可以把DNA切割成特定的基因片段
Restrictionenzymes,alsocalledrestrictionendonucleases,recognizespecificbasesequencesindouble-helicalDNAandcleave,atspecificplaces,bothstrandsofaduplexcontainingtherecognizedsequences.Tobiochemists,theseexquisitelyprecisescalpelsaremarvelousgiftsofnature.Theyareindispensableforanalyzingchromosomestructure,sequencingverylongDNAmolecules,isolatinggenes,andcreatingnewDNAmoleculesthatcanbecloned.WernerArberandHamiltonSmithdiscoveredrestrictionenzymes,andDanielNathanspioneeredtheiruseinthelate1960s.
限制酶,又叫限制性内切酶,可以识别DNA双螺旋结构中的特定碱基序列,并且在包含有识别序列的两条链的在特定位点切割。
对生物化学家来说,这些精确灵巧的手术刀是自然界了不起的馈赠。
他们在分析染色体结构、长的DNA分子测序、分离基因以及创造新的DNA分子并克隆这些方面的作用都是不可替代的。
WernerArberandHamiltonSmith发现了限制性内切酶,而DanielNathans率先在20世纪60年代使用。
Restrictionenzymesarefoundinawidevarietyofprokaryotes.TheirbiologicalroleistocleaveforeignDNAmolecules.Thecell'
sownDNAisnotdegraded,becausethesitesrecognizedbyitsownrestrictionenzymesaremethylated.Manyrestrictionenzymesrecognizespecificsequencesoffourtoeightbasepairsandhydrolyzeaphosphodiesterbondineachstrandinthisregion.Astrikingcharacteristicofthesecleavagesitesisthattheyalmostalwayspossesstwofoldrotationalsymmetry.Inotherwords,therecognizedsequenceispalindromic,oraninvertedrepeat,andthecleavagesitesaresymmetricallypositioned.Forexample,thesequencerecognizedbyarestrictionenzymefromStreptomycesachromogenesis:
限制性内切酶在各种各样的原核生物中发现。
他们的生物学作用是切割外源DNA。
他们自身的的DNA不会被切割,原因是他们自身限制性内切酶的识别的DNA位点被甲基化了。
许多限制性内切酶的特定识别序列有4-8个碱基对,在这一区域,每条链上的磷酸二酯键发生水解。
这些切割位点具有一个非常显著的特点,即他们几乎都具有双重旋转对称。
话句话说,识别序列是回文结构,或者反向重复,切割位点是对称的位置。
列如,不产色链霉菌的限制性酶切位点如下:
回文结构:
一个字,句子或经文,不管是从右边读到左边还是从左边读到右边都是相同的。
Radar
Madam,I'
mAdam
AblewasIereIsawElba
Romatibisubitomotibusibitamor
Ineachstrand,theenzymecleavestheC-Gphosphodiesterbondonthe3sideofthesymmetryaxis.AsweshallseeinChapter9,thissymmetryreflectsthatofstructuresoftherestrictionenzymesthemselves.
在每条链中,酶切割C-G磷酸二酯键上的3侧的对称轴。
正如我们将要在第九章看到一样,这种对称性反映的限制性内切酶本身的结构。
Morethan100restrictionenzymeshavebeenpurifiedandcharacterized.Theirnamesconsistofathree-letterabbreviationforthehostorganism(e.g.,EcoforEscherichiacoli,HinforHaemophilusinfluenzae,HaeforHaemophilusaegyptius)followedbyastraindesignation(ifneeded)andaromannumeral(ifmorethanonerestrictionenzymefromthesamestrainhasbeenidentified).ThespecificitiesofseveraloftheseenzymesareshowninFigure6.1.Notethatthecutsmaybestaggeredoreven.
已经有100多种限制性内切酶被纯化和鉴定。
它们的名字是由三种宿主细胞缩写而成的(列如Eco是大肠杆菌的缩写,Him是流感嗜血杆菌的缩写,Hae则来自埃及嗜血杆菌),紧跟着是指定的应变(如果需要的话)和罗马数字(如果超过一种限制性内切酶被鉴定存在于同一种菌株内)。
图6.1所示的是几种特异性酶,需要注意的是,切割可能会导致交错。
图6.1一些特异性的限制性酶切位点
包含有双重对称轴线的碱基序列被这些酶识别。
这个区域的两条链之间用一个180度旋转的通过一个绿色符号标记对称轴连接着。
酶切位点用红色的箭头标记。
每个限制性酶的简写再合适的序列位置被标记。
RestrictionenzymesareusedtocleaveDNAmoleculesintospecificfragmentsthataremorereadilyanalyzedandmanipulatedthantheentireparentmolecule.Forexample,the5.1-kbcircularduplexDNAofthetumor-producingSV40virusiscleavedat1sitebyEcoRI,4sitesbyHpaI,and11sitesbyHindIII.ApieceofDNAproducedbytheactionofonerestrictionenzymecanbespecificallycleavedintosmallerfragmentsbyanotherrestrictionenzyme.ThepatternofsuchfragmentscanserveasafingerprintofaDNAmolecule,aswillbediscussedshortly.Indeed,complexchromosomescontaininghundredsofmillionsofbasepairscanbemappedbyusingaseriesofrestrictionenzymes.
限制性内切酶被用于将DNA切割成特定的片段,这样便于分析,而且相对于整个DNA分子易操作。
列如,肿瘤产生的1.5kb的环状SV40病毒,被有1个位点的EcoRI、4个位点的HpaI以及11个位点Hind
限制性内切酶切割。
被一种限制性内切酶作用产生的一段DNA还可以被其他限制性内切酶切割成更小的片段。
这些样品可以作为DNA分子的指纹,这是不久就要讨论的。
的确,包括数以百万的碱基对组成的复杂的染色体,通过一系列的限制性内切酶使用,可以被描绘出来。
6.1.2.RestrictionFragmentsCanBeSeparatedbyGelElectrophoresisandVisualized
6.1.2通过凝胶电泳可以使限制性片段分离,并且可视化
SmalldifferencesbetweenrelatedDNAmoleculescanbereadilydetectedbecausetheirrestrictionfragmentscanbeseparatedanddisplayedbygelelectrophoresis.Inmanytypesofgels,theelectrophoreticmobilityofaDNAfragmentisinverselyproportionaltothelogarithmofthenumberofba
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