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三、病理学的研究方法
病理学的研究方法多种多样,研究材料主要来自自患病人体(人体病理材料)和实验动物以及其他实验材料如组织培养、细胞培养等(实验病理材料)。
(一)尸体剖检
对死亡者的遗体进行病理剖检(尸检)是病理学的基本研究方法之一。
尸体剖检(autopsy)不仅可以直接观察疾病的病理改变,从而明确对疾病的诊断,查明死亡原因,帮助临床探讨、验证诊断和治疗是否正确、恰当,以总结经验,提高临床工作的质量,而且还能及时发现和确诊某些传染病、地方病、流行病、为防治措施提供依据,同时还可通过大量尸检积累常见病、多发病、以及其他疾病的人体病理材料,为研究这些疾病的病理和防治措施,为发展病理学作贡献。
显然,尸检是研究疾病的极其重要的方法和手段,人体病理材料则是研究疾病的最为宝贵的材料。
一个国家尸检率的高低往往可以反映其文明进步的程度,世界上不少文明先进国家的尸检率达到90%以上,有的国家在法律中对尸检作了明文规定。
我国的尸检率还很低,十分不利于我国病理学和医学科学的发展,亟待提高。
(二)活体组织检查
用局部切除、钳取、穿刺针吸以及搔刮、摘除等手术方法,由患者活体采取病变组织进行病理检查,以确定诊断,称为活体组织检查(biopsy),简称活检。
这是被广泛采用的检查诊断方法。
这种方法的优点在于组织新鲜,能基本保持病变的真像,有利于进行组织学、组织化学、细胞化学及超微结构和组织培养等研究。
对临床工作而言,这种检查方法有助于及时准确地对疾病作出诊断和进行疗效判断。
特别是对于诸如性质不明的肿瘤等疾患,准确而及时的诊断,对治疗和预后都具有十分重要的意义。
(三)动物实验
运用动物实验的方法,可以在适宜动物身上复制某些人类疾病的模型,以便研究者可以根据需要,对之进行任何方式的观察研究,例如可以分阶段地进行连续取材检查,以了解该疾病或某一病理过程的发生发展经过等。
此外,还可利用动物实验研究某些疾病的病因、发病机制以及药物或其他因素对疾病的疗效和影响等。
这种方法的优点是可以弥补人体观察之受限和不足,但动物与人体之间毕竟存在种种差异,不能将动物实验的结果直接套用于人体,这是必须注意的。
(四)组织培养与细胞培养
将某种组织或单细胞用适宜的培养基在体外加以培养,以观察细胞、组织病变的发生发展、如肿瘤的生长、细胞的癌变、病毒的复制、染色体的变异等等。
此外,也可以对其施加诸如射线、药物等外来因子,以观察其对细胞、组织的影响等。
这种方法的优点是,可以较方便地在体外观察研究各种疾病或病变过程,研究加以影响的方法,而且周期短、见效快,可以节省研究时间,是很好的研究方法之一。
但缺点是孤立的体外环境毕竟与各部分间互相联系、互相影响的体内的整体环境不同,故不能将研究结果与体内过程等同看待。
(五)病理学的观察方法
近年来,随着学科的发展,病理学的研究手段已远远超越了传统的经典的形态观察,而采用了许多新方法、新技术,从而使研究工作得到了进一步的深化,但形态学方法(包括改进了的形态学方法)仍不失为基本的研究方法。
兹将常用的方法简述如下:
大体观察 主要运用肉眼或辅之以放大镜、量尺、各种衡器等辅助工具,对检材及其病变性状(大小、形态、色泽、重量、表面及切面状态、病灶特征及坚度等)进行细致的观察和检测。
这种方法简便易行,有经验的病理及临床工作者往往能借大体观察而确定或大致确定诊断或病变性质(如肿瘤的良恶性等)。
组织学观察 将病变组织制成厚约数微米的切片,经不同方法染色后用显微镜观察其细微病变,从而千百倍地提高了肉眼观察的分辨能力,加深了对疾病和病变的认识,是最常用的观察、研究疾病的手段之一。
同时,由于各种疾病和病变往往本身具有一定程度的组织形态特征,故常可借助组织学观察来诊断疾病,如上述的活检。
细胞学观察 运用采集器采集病变部位脱落的细胞,或用空针穿刺吸取病变部位的组织、细胞,或由体腔积液中分离所含病变细胞,制成细胞学涂片,作显微镜检查,了解其病变特征。
此法常用于某些肿瘤(如肺癌、子宫颈癌、乳腺癌等)和其他疾病的早期诊断。
但限于取材的局限性和准确性,有时使诊断难免受到一定的限制。
既提高了穿刺的安全性,也提高了诊断的准确性。
超微结构观察 运用透射及扫描电子显微镜对组织、细胞及一些病原因子的内部和表面超微结构进行更细微的观察(电子显微镜较光学显微镜的分辨能力高千倍以上),即从亚细胞(细胞器)或大分子水平上认识和了解细胞的病变。
这是迄今最细致的形态学观察方法。
在超微结构水平上,还常能将形态结构的改变与机能代谢的变化联系起来,大大有利于加深对疾病和病变的认识。
组织化学和细胞化学观察 通过运用具有某种特异性的、能反映组织和细胞成分化学特性的组织化学和细胞化学方法,可以了解组织、细胞内各种蛋白质、酶类、核酸、糖原等等化学成分的状况,从而加深对形态结构改变的认识。
这种方法不仅可以揭示普通形态学方法所不能观察到的组织、细胞的化学成分的变化,而且往往在尚未出现形态结构改变之前,就能查出其化学成分的变化。
此外,随着免疫学技术的进步,还可运用免疫组织化学和免疫细胞化学的方法,了解组织、细胞的免疫学性状,对于病理学研究和诊断都有很大帮助。
除上述常用方法外,近数十年来陆续建立的还有放射自显影技术、显微分光技术、形态测量(图像分析)技术、分析电镜技术、流式细胞仪(FCM)技术、多聚酶链反应(PCR)技术以及分子原位杂交技术等一系列分子生物学技术,从而使常规的病理形态学观察,发展到将形态结构改变与组织、细胞的的化学变化结合志来进行研究,而且将历来的定性的研究发展到对病理改变进行形态的和化学成分的定量研究,从而获得了大量的更多更新的新信息,大大加深了疾病研究的深度。
这是以往的研究所难以实现的。
四、病理学的发展
病理学是在人类探索和认识自身疾病的过程中应运而生的。
它的发展自必受到人类认识自然能力的制约。
从古希腊的Hippocrates开始,经过2千多年的发展,直到18世纪中叶,由于自然科学的兴起,促进了医学的进步,意大利医学家Morgagni(1682-1771)根据积累的尸检材料创立了器官病理学(organpathology),标志着病理形态的开端。
约一个世纪以后的19世纪中叶,德国病理学家Virchow(1821~1902)在显微镜的帮助下,首创了细胞病理学(celluarpathology),不仅对病理学而且对整个医学的发展作出了具有历史意义的、划时代的贡献。
直到今天,他的学说还继续影响着现代医学的理论和实践。
我国秦汉时期的《黄帝内经》、隋唐时代巢元方的《诸病源候论》、南宋时期宋慈的《洗冤集录》等世界名著,对病理学的发展作出了很大的贡献。
半个多世纪以来,我国现代病理学先驱徐育明、胡正详、梁伯强、谷镜汧、侯宝璋和林振纲、秦光煜、江晴芬、李佩琳、吴在东、杨述祖、杨简、刘永等为我国病理学教学、师资培养以及病理学的发展,呕心沥血,艰辛创业,功绩卓著。
在他们的主持和参与下,我国从无到有地编著了自己的具有我国特色的病理学教科书和参考书。
同时,大力推进我国的病理尸检和活检工作以及科研工作,对长期以来严重危害我国人民健康的地方病和寄生虫病(如克山病、大骨节病、黑热病、血吸虫病等)、肿瘤(如肝癌、食管癌、鼻咽癌等)以及心血管疾病(如动脉粥样硬化症、冠心病等)等常见病、多发病、进行了广泛深入的研究,到得了丰硕的成果。
这些成就不仅对我国当前病理学教学、科研和检验工作,而且对今后我国病理的发展,都起着重要的作用。
病理的发展与自然科学,特别是基础科学的发展和技术进步有着密切的联系。
当人们还只能依赖肉眼和简单的放大镜观察事件时,便只能产生器官病理学;
只有到了显微镜和细胞学问世之后,才有可能诞生了细胞病理学;
而半个多世纪以来,由于电子显微镜技术、特别是20多年来一系列有关新方法新技术的相继建立和细胞生物学、分子生物学、环境医学以及现代免疫学、现代遗传学等新兴学科及其分支的迅速兴起和发展,对医学科学、也对病理学的发展产生了深刻的影响,带来了新的动力。
近年来,超微病理学(ultra-structuralpathology)包括分子病理学(molecularpathology),以及分子免疫学(molecularimmunology)、分子遗传学(moleculargenetics)等等新的边缘学科和学科分支的建立,促使病理学已不仅从细胞和亚细胞水平,而且深入到从分子水平、从人类遗传基因突变和染色体畸变等去认识有关疾病,研究疾病的起因和发病机制。
现代遗传病理学认为,在人类疾病中虽然只有一小部分具有明显的遗传特征,但原则上几乎所有疾病都受遗传因素的影响。
现代免疫病理学的研究则逐步阐明了许多长期以来未被认识的疾病的病因、发病机制及其本质,发现许多疾病的发生发展均与机体的免疫状态密切相关。
这些进展和发现,为许多疾病的防治开辟了新的前景。
我国病理在前辈病理学者奠定的坚实基础上,经过新一代病理学者的努力,已有了长足的进步,在队伍和条件的建设上得到了显著的发展。
我国是一个幅员辽阔、人口众多的大国,疾病谱和疾病都具有自己的特点,开展好这方面的研究,不仅对我国医学发展和疾病防治具有极为重要的意义,同时也是对世界医学的贡献。
面对这一任务,我国病理学的发展具有充分的现实条件和广阔的前景。
当前,我们既要面对现实,大力提倡和开展病理尸检工作,充分利用我国充丰富的疾病材料“资源”,积极发展我国的人体病理学,也要充分利用各种途径吸收世界上的新方法新技术,同时这要根据我国的实际情况,开发和建立自己的新方法新技术,加强我国的实验病理学研究,使我国病理学的发展跟上世界病理学发展的步伐,并在某些方面处于领先地位。
这当是我国当代病理学者的责任和任务。
第一章 细胞和组织的损伤
第一节 概述
生活机体的细胞和组织经常不断地接受内外环境各种刺激因子的影响,并通过自身的反应和调节机制对刺激作出应答反应。
这种反应能力可保证细胞和组织的正常功能,维护细胞、器官乃至整个机体的生存。
但细胞和组织并非能适应所有刺激的影响,当刺激的性质、强度和持续时间超越了一定的界限时,细胞乃受损甚至死亡。
然而,在正常和发生了适应性改变的、损伤的死亡的细胞之间,在结构和功能上往往并无截然的界限。
可复性的和不可复性的改变之间,也常难以截然区分。
总之,这些过程都是逐渐过渡的。
至于一个刺激究竟会引行细胞的适应性改变、损伤还是死亡,也只有待其作用一定的时间(潜伏期),细胞和组织出现明确的结构变化以后,才能从形态上加以判断。
这段潜伏期的长短不仅决定于刺激因子的性质和强度,还取决于受累细胞和组织的种类。
例如中枢神经系统特别是神经节细胞对于缺氧的耐受能力就远不如结缔组织细胞,也不如肝、肾、肺等器官的实质细胞。
常温下大脑缺氧后尚能复苏的时间极限为8~10分钟(大脑壳核又比其他部位如脑干核团更为敏感),肝通常为30~35分钟,肾为60~180分钟,肺约为60分钟(支气管上皮约为90分钟)。
当然对于细胞损伤的观察又和所用方法的灵敏度和分辨能力有关。
例如在肝缺血时,5分钟后即可从生化上证明其氧化磷酸化过程明显降低,而最初的结构改变如内质网、线粒体、细胞膜等亚细胞结构的改变,则约在缺血15分钟后才能在电子显微镜下检见,但这些改变通常还是可复性的,只要在30分钟内能恢复血流灌注,则这些改变仍可恢复正常。
然而此时在光学显微镜下,一般尚不见明显的改变。
只有当缺血持续达30分钟以上时,细胞的损伤才达到不可复的程度,并趋于死亡。
但也要在缺血达2小时以后才能在光学显微镜下检见肯定的细胞损伤。
当然,肉眼观能检见的改变还远远在此以后。
第二节 细胞的超微结构及其基本病理过程
Virchow在19世纪中期所奠定的细胞病理学说,通过近代对细胞及其病变的超微结构以及结构与功能相结合的研究,已经获得了新的更广更深的基础,扩大和加深了对疾病的理解。
细胞是一个由细胞膜封闭的基本生命单元,内含一系列明确无误的互相分隔的反应腔室,这就是由细胞膜为界限的各种细胞器,是细胞代谢和细胞活力的形态支柱。
细胞内的这种严格分隔保证各种细胞器分别进行着无数的生化反应,行使各自的独特功能,维持细胞和机体的生命活动。
细胞器的改变是各种病变的基本组成部分。
一、细胞核
细胞核(nucleus)是遗传信息的载体,细胞的调节中心,其形态随细胞所处的周期阶段而异,通常以间期核为准。
细胞核外被核膜。
核膜由内外二层各厚约3nm的单位膜构成,中间为2~5nm宽的间隙(核周隙);
核膜上有直径约50nm的微孔,作为核浆与胞浆间交通的孔道,其数目因细胞类型和功能而异,多者可占全核表面积的25%;
在肝细胞核据估算约有2000个核孔。
核浆主由染色质构成,其主要成分为脱氧核糖核酸(DNA),并以与蛋白质相结合的形式存在,后者由组蛋白与非组蛋白组成。
染色质的NDA现在已可用多种方法加以鉴定和定量测定。
核内较粗大浓缩的、碱性染料深染的团块状染色质为异染色质,呈细颗粒状弥散分布的、用普通染色法几乎不着色的染色质则为常染色质。
一部分异染色质也可以上述两种状态存在。
从生化角度看,异染色质不具遗传活性,相反,常染色质则大部分具遗传活性。
间期核的染色质模式还反映细胞的功能状态。
一般而言,大而淡染的核(浓缩染色质少)提示细胞活性(如蛋白质和酶的合成)较高;
小而深染的核(浓缩染色质较多)则提示细胞活性有限或降低。
(一)细胞损伤时核的改变
1、核大小的改变核的大小通常反映着核的功能活性状态,功能旺盛时核增大,核浆淡染,核仁也相应增大和(或)增多。
如果这种状态持续较久,则可出现多倍体核或形成多核巨细胞。
多倍体核在正常情况下亦可见于某些功能旺盛的细胞,如肝细胞中可见约20%为多倍体核。
在病理状态下,如晚期肝炎及实验性肝癌前期等均可见多倍体的肝细胞明显增多。
核的增大除见于功能旺盛外,也可见于细胞受损时,最常见的情况为细胞水肿。
这主要是细胞量匮乏或毒性损伤所致,是核膜钠泵衰竭导致水和电解质运输障碍的结果。
这种核肿大又称为变性性核肿大。
相反,当细胞功能下降或细胞受损时,核的体积则变小,染色质变致密,如见于器官萎缩时。
与此同时核仁也缩小。
2.核形的改变光学显微镜下,各种细胞大多具有各自形状独特的核,可为圆形、椭圆形、梭形、杆形、肾形、印戒形、空洞形以及奇形怪状的不规则形(图1-1)等。
在电镜下由于切片极薄,切面可以多种多样,但均非核的全貌。
核的多形性和深染特别多见于恶生肿瘤细胞,称为核的异型性(atypia)。
3.核结构的改变细胞在衰亡及损伤过程中的重要表征之一是核的改变,主要表现为核膜和染色质的改变。
核浓缩(karyopyknosis):
染色质在核浆内聚集成致密浓染的大小不等的团块状,继而整个细胞核收缩变小,最后仅留下一致密的团块,是为核浓缩。
这种浓缩的核最后还可再崩解为若干碎片(继发性核碎裂)而逐渐消失。
核碎裂(karyorrhexis):
染色质逐渐边集于核膜内层,形成较大的高电子密度的染色质团块(图1-2)。
核膜起初尚保持完整,以后乃在多处发生断裂,核逐渐变小,最后裂解为若干致密浓染的碎片。
核溶解(karyolysis):
变致密的结成块状的染色质最后完全溶解消失。
即核溶解。
核溶解变可不经过核浓缩或核碎裂而一开始即独立进行。
在这种情况下,受损的核很早就消失。
上述染色质边集(即光学显微镜下所谓的核膜浓染)、核浓缩、核碎裂、核溶解等核的结构改变为核和细胞不可复性损伤的标志,提示活体内细胞死亡(坏死)。
4.核内包含物(intranuclearinclusions) 在某些细胞损伤时可见核内出现各种不同的包含物,可为胞浆成分(线粒体、内质网断片、溶酶体、糖原颗粒、脂滴等),亦可为非细胞本身的异物,但最常见的还是前者。
这种胞浆性包含物可在两种情况下出现:
①胞浆成分隔着核膜向核内膨突,以致在一定的切面上看来,似乎胞浆成分已进入核内,但实际上大多仍可见其周围有核膜包绕,其中的胞浆成分常呈变性性改变(如髓鞘样结构,膜碎裂等)。
这种包含物称为胞浆性假包含物(图1-3);
②在有丝分裂末期,某些胞浆结构被封入形成中的子细胞核内,以后出现于子细胞核中,称为真性胞浆性包含物。
图1-1恶性肿瘤细胞的奇异形核
图中央为一巨大的瘤细胞核,核膜曲折凹陷,使核呈奇异形(纤维肉瘤的电镜照片)×
23000
图1-2 细胞核染色质边集中毒性肝炎的肝细胞×
8000
图1-3 核内假包含体
垂体嗜酸性细胞瘤的瘤细胞,左侧瘤细胞核内可见一卵圆形包含体,有膜包绕,内含细胞器和胞浆分泌颗粒×
8400
非胞浆性(异物性)核内包含物的种类繁多,性质各异。
在真性糖尿病时,肝细胞核内可有较多糖原沉积。
在常规切片制作过程中,糖原被溶解,核内出现或大或小的空洞(糖尿病性空洞核)。
在铅、铋、金等重金属中毒时,核内亦可出现丝状或颗粒状真性包含物,其中有时含有相应的重金属(如铅中毒时)。
此外,在某些病毒性疾病如DNA病毒感染时,可在电镜下检见核内病毒颗粒,如聚积成较大集团(如巨细胞包含体病),则亦可在光学显微镜下检见,表现为较大的核内包含物。
5.核仁的改变核仁(nucleolus)为核蛋白体RNA转录和转化的所在。
除含蛋白的均质性基质外,电镜下核仁主由线团状或网状电子致密的核仁丝(nucleolonema)和网孔中无结构的低电子密度的无定形部(parsamorpha)组成。
核仁无界膜,直接患浮于核浆内。
形态上和生物上核仁由3种不同的成分构成:
①原纤维状成分,内含蛋白质及与其相结合的45S-rRNA;
②细颗粒状成分,主要由12S-rRNA构成,为核仁的嗜碱性成分;
③细丝状成分,仅由来自胞浆的蛋白质构成,穿插于整个核仁内。
3种核仁成分的空间排列状态可反映细胞的蛋白合成活性,例如:
壳状核仁:
原纤维状成分集中位于核仁中央,细颗状成分呈壳状包绕于外层。
这种细胞的合成活性甚低。
海绵状核仁:
这种核仁的原纤维状与细颗状成分呈海绵状(或线团状)排列。
这种细胞的合成活性升高。
大多数所谓的“工作核”具有这种核仁。
高颗粒性核仁:
由海绵状核仁转化而成,原纤维状成分几乎消失,核仁主要由颗粒状成分构成,故组织学上呈强嗜碱性,细胞的合成活性旺盛。
这种核仁常见于炎症和肿瘤细胞。
低颗粒性核仁,与上述高颗粒性核仁相反,这种核仁的细颗粒状成分锐减,故电镜下原纤维状成分显得突出,电子密度较低。
这种核仁常见于再生时,因此时细颗粒成分(rRNA)过多地被胞浆所利用。
分离性核仁:
超微结构上3种核仁成分清楚地互相分离,原纤维状和细颗粒状成分减少。
这种核仁变小,无活性,常见于核仁转录过程被抗生素、细胞抑制剂、缺氧和蝇菌素中毒等所完全阻断时。
由此可见,核仁的大小和(或)数目的多少常反映细胞的功能活性状态:
大和(或)多的核仁是细胞功能活性高的表现,反之则细胞功能活性低。
二、细胞膜
细胞膜是包于细胞表面、将细胞与周围环境隔开的弹性薄膜,厚约8~10nm,由脂质和蛋白质构成,故为脂蛋白膜,对于细胞的生命活动和功能具有十分重要的意义。
细胞膜在许多特定场合可向外形成大量的纤细突起(微绒毛、纤毛),或向内形成各种形式的内褶(图1-4),
图1-4 肾近曲小管上皮细胞之基底褶及其中的线粒体 ×
16000
以利于其功能活动。
相邻细胞的细胞膜之间还可形成闭锁小带、附着小带、桥粒和缝隙连接等各种特化结构,以保持细胞间的联系。
此外,新近还发现,在相领细胞膜上有“粘附分子(如adhesionmolecule,cadherin)”,对细胞正常结构和联系以及细胞极性的维持和细胞的分化等,均具有重要作用。
细胞膜除作为细胞的机械性和化学性屏障外,还具有一系列重要的功能诸如细胞内外的物质交换、细胞运动、细胞识别以及细胞的生长调控、免疫决定和各种表面受体形成等。
细胞的物质交换:
细胞内外的物质交换主要以两种方式进行,一为渗透,一为出入胞过程。
渗透乃指低分子物质(主要为水和电解质)通过细胞膜进出细胞,又可分两种情况:
一种是按该物质在细胞内外环境中的浓度差,由浓高的一侧弥散底到低的一侧(被动运输);
另一种则逆浓度差进行,即由浓度低的一侧向浓度高的一侧输送(主动运输),其经典的例子即Na+和K+的运输(在细胞内Na+和K+的比例为1:
20,而在细胞外隙则为30:
1),即依靠所谓“钠泵”的作用将Na+移向细胞外隙,而使K+移向细胞内。
这种主动运输是一个耗能的过程,并由Na+和K+激活细胞膜上的ATP酶分解ATP而提供所需的能量。
因此,如ATP酶受到某些毒物的抑制,则这种主动运输过程也同样受到阻抑。
除Na+和K+外,其他一些有机物质如葡萄糖、氨基酸以及一些低分子代谢产物也是借这样的过程运输的。
第二种物质运输方式为出入胞过程。
较大的分子和颗粒不能借渗透过程通过细胞膜,乃借出入胞过程将细胞内物质运送到细胞外和将
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