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其余为葡萄孢属、酵母菌、青霉、担子菌、曲霉及交链孢霉等,空气中的真菌孢子的含量与季节有关,夏天潮湿季节最多,冬季和干旱季节较少。
与此相反,室内空气中,曲菌及青霉菌在秋季及冬季含量较高。
其它欧洲国家也有类似发现,但交链孢霉在不同国家变化很大。
第二节真菌变态反应的基础研究
一、真菌分类及其特征
真菌的种类很多,分布广泛,自然界中约有十万余种。
受到地理、气候等因素的影响,大气中真菌的种类和含量变化很大,受到生活条件和生活习俗的影响,室内真菌的浓度也有很大的差异。
致敏性强且空气中飘散数量大的真菌种类有数百种,引起人体致敏的主要是室内真菌。
尽管空气中真菌的数量极大,形态各异,但它们都具有共同的特征。
是具有丝状体的分枝状的营养结构,有细胞核和细胞壁,不含叶绿素,是典型地进行有性繁殖和无性繁殖的有机体,含有多糖和蛋白质等物质。
根据现代分类学方法,真菌门下分为五个纲,与变态反应有关的共有四个纲。
(一)接合菌纲
本纲是较低等的一类真菌,也是数量最少的一个纲。
其中毛霉科是该纲中最大的一个科,这个科中的毛霉、根霉、梨头霉、共头霉等,即是条件致病菌,也是引起变态反应的重要致敏真菌。
1.菌丝多为管状,通常无横隔,有分枝,菌丝直径较大。
2.无性繁殖时,在孢子囊中产生孢子。
孢子囊通常生在营养菌丝的顶端或是生在被称为孢囊梗的特殊繁殖菌丝的顶端。
在孢子囊的幼期,其中充满着多核的原生质。
当发育时,整个原生质割裂成许多小块,每个小块发育成为一个孢囊孢子。
孢囊孢子主要靠风力传播,在适当的条件下,孢子萌发一芽管,进而发育成新的菌丝体。
3.有性繁殖时,为配子或配子囊交配,然后形成休眠孢子、接合孢子。
(二)子囊菌纲
是真菌中比较大的一个纲。
从它们的复杂结构看,较接合菌进化得多,而且很可能是从接合菌演变而来。
如空气中常见的毛壳菌、蛹孢假壳菌、荚孢腔菌等。
1.大多数种产生的子实体都含有子囊。
子囊多为细长的棍棒形或圆筒形的袋状结构,少数为球形、卵形或长方形。
通常子囊为一个腔,里面形成子囊孢子,也有的为分隔子囊。
2.子囊内具有一定数量的孢子,通常为8个,但因菌种的不同,孢子的数目多少不完全一样。
孢子的大小、形状、颜色及其它特征变化很大。
一般以子囊孢子的特征作为子囊菌分属的依据。
3无性繁殖可通过分裂、芽殖、断裂、粉孢子、厚垣孢子或分生孢子等进行。
4有性繁殖是将两性的核结合起来,聚在一个细胞内,形成配偶,称双核期。
经过连续的双核并裂产生许多双核细胞。
双倍体的核在将要发育成子囊的子囊母细胞中结合后,立即进行减数分裂,产生8个核,从而形成典型的8个子囊孢子。
5许多子囊菌,每年只出现一次有性阶段,经常遇到的是分生孢子阶段。
(三)担子菌纲
这是真菌各纲中最高级的一个纲。
如蘑菇、木耳、灵芝以及空气中极常见的黑粉菌、锈菌等都属于本纲。
1有特殊的产孢体,称担子,担子上有4个担孢子。
担孢子的质配、核配和减数分裂发生在担子内。
担孢子可以是圆形、椭圆形、狭长形或腊肠形。
无色素或有色素,颜色浅淡,当孢子成团堆积时方可识别。
2无明显的生殖器官,两性的结合是由未经分化的菌丝的结合或孢子的结合。
结合时只行质配,不行核配,结果有一个双核细胞期,并以特殊的锁状联合的方式形成新的双核细胞。
两性细胞核在形成孢子之前才行核配,随之行减数分裂,产生单倍体的担孢子。
3无性繁殖借助于芽殖、菌丝体的裂殖或产生分生孢子和粉孢子。
黑粉菌经常产生分生孢子,它的分生孢子是从担孢子和菌丝体两者芽殖而形成的。
锈菌产生夏孢子,它在起源上和功能上是分生孢子。
许多其他的担子菌也产生分生孢子。
有些担子菌的菌丝体通常裂成单细胞段,这些菌丝体的碎片即粉孢子。
4.有性繁殖是以体细胞配合或受精作用来实现的。
在产生细胞的种内,两个单核细胞菌丝互相接触,接触点的胞壁溶化,一个细胞的核穿孔而进入另一个细胞内,使之成为双核。
这个双核细胞连续分裂产生二生的双核菌丝体。
在产生粉孢子的担子菌的种内,质配作用常在粉孢子和营养菌丝的联合时发生。
总之,担子、双核菌丝体和锁状联合的形成,是担子菌的三个典型特征。
(四)半知菌纲
这一纲是尚未发现有性阶段的子囊菌及少数担子菌的分生孢子阶段的类群。
它还包括一些在有性阶段发现前已经描述及定名的已知子囊菌及担子菌的无性阶段。
如曲霉、青霉、芽枝菌、交链孢霉、木霉等。
1.它们仅靠分生孢子或菌丝的碎片进行繁殖。
分生孢子通常产生在分生孢子梗上,分生孢子梗的形态不一,它们的产生可以从普通的营养菌丝而来,无任何明显的器官,或者可以组成一定的子实体,最普通的子实体有分生孢子器及分生孢子盘。
2.在它们的生活史中,仅发现了无性阶段,所以称之为半知菌。
3菌丝都有分隔。
很多为腐生菌,但有许多对人类极为重要,是引起植物、动物和人类病害的寄生菌。
二、空气中气传真菌调查
空气中真菌的调查是探明各地空气中常见真菌种类、数量、季节分布情况的一种重要方法,这对于筛选致敏真菌,指导真菌变态反应患者的诊断和治疗有重要意义。
制备真菌变应原的菌种的选择,就是根据空气中的调查资料配合真菌的致敏性来确定的。
把空气中最常见、孢子播散数量最大和致敏性最强的真菌进行分离和筛选,保留纯菌种,进行实验室培养,可制备成各种真菌变应原浸液供临床诊断和免疫治疗。
一般认为,真菌调查由曝片和曝皿同步进行,由于曝片调查对某些较小的真菌孢子难以观察和分辨,所以曝皿调查也是非常重要的。
通常调查应至少持续一年才能较为全面地了解该地区主要致敏真菌。
(一)空气中曝片及镜检计数方法
1.曝片方法于空气中暴露涂有软凡士林粘附剂的载玻片(25mm×
75mm)。
将涂有粘附剂的载玻片放于取样器内,每天定时取放片,该片在空气中暴露24小时。
将取回的载玻片放一块甘油胶染色剂,微溶后加盖22mm×
22mm干净盖玻片。
一般于次日进行镜检。
2.镜检计数方法镜检时,将载玻片放在显微镜载物台上,自左至右,慢慢移动推尺,到头后推尺轻轻上移,将载玻片推上一个新的镜检部分,再从右往左移动推尺。
以此类推,顺序把盖玻片复盖范围全部看完。
详细记录真菌的种类与数量。
我院于1989年8月1日—1990年7月31日每天上午十点暴露涂有凡士林粘附剂的载玻片一张,24小时取回,加一滴中性树胶,加盖22mm×
22mm盖玻片,全盖玻片镜检,记录真菌孢子、菌丝体数量。
全年曝片365张,共收集真菌孢子101112个,菌丝体片2367个,已鉴定真菌孢子101089个,共37个种属。
(二)空气中曝皿及镜检计数方法
1.曝皿方法将带有消毒培养基的平皿(直径lOcm)在空气中暴露3~5分钟。
暴露地点可根据需要而定。
暴露完毕,将平皿放置在室温下或25℃恒温箱中培养。
每天观察、记录生长的菌落及鉴定其名称。
平皿应放置在固定地点,观察时要轻轻取放,防止真菌孢子被震落,造成培养基的污染而影响调查计数的准确性。
一般以每周或每月曝皿一次,时间应与曝片一致,至少以一年为限。
2.镜检计数方法为了防止因某些真菌生长迅速,很快长满培养皿,影响其它真菌生长,孢子一旦生成,应马上进行分离鉴定并记录。
一个菌落即作为一种真菌记录。
统计时,菌落与真菌种类要分别计算。
我院应用11cm培养皿,马铃薯一葡萄糖、蔡氏、沙氏三种琼脂培养基在曝片处、医院门前广场和病区设置三个固定点曝皿,每点三皿,半月一次,每天上午十点曝皿3分钟,25℃生化培养箱内培养,每天观察,记录菌落数,直到无新菌落出现为止,挑取菌落用直接压片或载玻片培养方法于镜下鉴定,对已鉴定的真菌进行显微照相,并转入试管琼脂斜面培养和保存。
全年曝皿24次,共216个琼脂平皿,收集菌落3012个。
三、真菌的变应原性研究
真菌和真菌孢子作为一种抗原物质,它在人体内产生抗体的能力比较低,可能由于真菌和真菌孢子不产生外毒素,亦无表面抗原存在;
.或认为真菌孢子的细胞膜上有一层化学稳定的物质,使细胞内的抗原成分不易释放,故激发抗体产生的功能较低,在临床上,真菌抗原浸液皮肤试验的强度与阳性率均明显低于花粉抗原浸液。
真菌诱发变态反应的过程与对结核菌诱发变态反应的过程相似,故采用真菌抗原浸液进行皮肤试验时,既可以出现速发相皮肤反应,又可以出现迟发相皮肤反应,有时为双相反应。
我们曾对75例变态反应性结膜炎病例的皮肤试验结果进行了观察,真菌迟发相反应阳性率明显高于速发反应。
所谓致敏真菌,主要是一些植物病原菌和腐生菌。
过去多数人认为真菌的主要抗原有效成分存在于真菌孢子中。
后来有人发现,菌丝和孢子中都有致敏原,国内外许多实验室对数种真菌的变应原成分进行过研究,包括抗原的纯化、免疫检测分析等。
Gravesen于1979年通过交叉放射免疫电泳分析,发现交链孢霉含有10种以上抗原成分。
1980年Yunginger等对交链孢霉进行了生化分析,发现一种抗原性较强的糖蛋白,称之为Alt-l,其分子量在25000~50000之间。
Aukrust等于1979年对芽枝霉的抗原性作了分析,发现含有60多种蛋白成分,其中有4种属于主要的抗原决定簇,其余部分为次要抗原决定簇。
对其中2种抗原决定簇进行提纯,分子量为13000和25000。
对10种不同种系的芽枝霉进行抗原性比较,发现不同种系中主要抗原决定簇的含量差别极大。
1980年Kauffman等对烟曲霉的抗原成分进行分析,发现培养时间长的菌群比培养时间短的菌群抗原性高。
1969年Pepys发现烟曲霉致敏后,发现其不但可以诱发机体产生特异性IgE,还可以产生特异性IgG,成为烟曲霉可以诱发变态反应性支气管肺曲菌病发病的重要依据。
北京协和医院曾于1984年开始对青霉、交链孢霉、曲霉等进行免疫电泳及琼脂扩散测定,发现了一些不同的区带。
1986年对产黄青霉抗原进行了初步分离提纯。
1986年北京医科大学对交链孢霉变应原进行了初步活性鉴定,发现了一种抗原性较强的成分。
1987年Reed发现烟曲霉与土曲霉(A.Terreus)、棒曲霉(A.clavatus)、黑曲霉(A.nigra)、黄曲霉(A.flavus)之间均有很高的抗原交叉性。
从上述资料中,我们可以看出,气传致敏真菌的抗原性问题是一个极为复杂的问题。
不但在不同种系的真菌中变化很大,而且在同一种系的真菌中亦可能存在不同的抗原决定簇。
今后如何针对我国的常见致敏真菌的抗原性问题进行研究,将有大量的工作有待探索。
由于真菌的遗传特性复杂,形态各异而且多变,决定了它的变应原性的复杂性。
真菌的抗原物质绝大部分来自真菌的孢子和菌丝,不同的真菌菌株在有性繁殖期与无性繁殖期两个不同的阶段,在形态上有明显差别。
不同真菌的变应原性又往往具有相对的交叉反应性。
同时,同一种真菌变应原作用于不同的真菌变态反应病人时,可以出现截然不同的反应。
真菌的形态与发育又受环境的影响而变异。
不同的接种条件、培养基成分、培养温度及湿度,均可导致真菌形态的自动变异,从而影响其抗原性。
据Hoffman(1981)报告,用交链孢霉孢子制备的变应原中发现了8种重要的变应原成分,其中有几种是用交链孢霉菌丝所制备的变应原浸液中所没有的,提示了真菌孢子和菌丝的变应原成分是不同的。
70年代后期在支气管哮喘患者中,发现有16%—28%对烟曲霉变应原浸液皮试呈阳性反应,认为这类病人可能属于一类特殊的变态反应类型,称之为变应性支气管肺曲菌病。
相继对烟曲霉及其它真菌种类如交链孢霉、腊叶芽枝菌等的变应原成分进行了提纯和分离,结果如表50-1所示。
自从对烟曲霉的变应原进行分离层析以来,并结合临床进行对照分析,取得了很大进展,例如发现了烟曲霉的Ag3为不耐热成分,加热后可使变应原性明显降解。
Ag7则为引起变应性支气管肺曲菌病最重要的变应原成分等。
目前对真菌变应原的分离提纯正在作更深入的研究。
在分离方法上采用交叉免疫电泳,可在不同的区带上进行更细的层析,取得更纯净的变应原成分。
再用克隆化的技术,制备出效价高、特异性强的真菌变应原。
这对指导真菌变态反应的诊断和治疗,甚至对阐明真菌变态反应的发病及防治机理,可能在分子水平上取得突破性进展。
对于真菌变应原性测定,一种为生物学方法,通过真菌变应原的皮肤试验或其它激发试验,推测其变应原强度与活性。
另一种为放射免疫法,即利用放射变应原吸附试验(RAST),从体外测定变应原浸液的变应原强度与活性。
因RAST方法需要一定仪器设备,有些试剂国内缺乏,而且价格昂贵,目前用于大量致敏真菌筛选有一定困难。
60年代Shelley等人曾发现速发相反应患者的嗜碱粒细胞或肥大细胞在体外与特异性抗原相作用时,可引起这些细胞脱颗粒,此后,人嗜碱粒细胞脱颗粒试验(HBDT)方法经过不断改进,逐步趋于完善。
我们曾采用HBDT许氏改进方法,用阿利新兰代替甲苯胺兰染色,可减少染色误差,用血球计数板观察结果,简便省时,和皮肤试验有较好的符合率(87%)。
应用皮肤试验和HBDT方法相结合测定真菌变应原性,可以从体内和体外两个方面反映真菌变应原强度,有助于得出正确结果。
抗原和抗体结合可在任何比例下发生,但有一个最适数量的比例(等价带),此时,结合反应表现得最强。
在HBDT试验中,进行了几种单价真菌变应原稀释度(蛋白质含量)试验,结果表明10-4变应原稀释度嗜碱粒细胞脱颗粒较好。
因所用真菌种类多,特性各异,其浸液中有效变应原成分和含量也会有所不同,对于每种真菌变应原,选择它的最佳稀释度(蛋白质含量)进行HBDT试验,可能会取得更好的结果。
总之,气传真菌种类繁多、分布广泛,是诱发支气管哮喘的重要变应原之一。
据报道美国现已进入市场的商品真菌变应原浸液制剂多达280余种,而我国目前应用于临床诊断和治疗的真菌抗原仅有20~30种,因此深入开展变应原分离提纯是今后我国真菌变态反应学研究的重要任务。
第三节真菌变应性哮喘的临床研究
真菌孢子进入正常人的气道后,完整气道粘膜上皮的屏障作用对吸入的真菌孢子起着重要的防御机能,将真菌孢子拒之体外,同时气道内的巨噬细胞的吞噬作用也在清除吸入的真菌及其孢子中起重要作用,因此真菌很少能够成为病原体。
由于气道粘膜上皮的屏障作用有效地限制了真菌抗原与气道相关的淋巴组织接触。
因此,血循环中针对真菌的特异性IgE水平通常较低、用双向免疫扩散法及EI_ISA-IgG滴定法测定沉淀素均阴性。
而对于特应性素质的病人来说,当气道反复不断地接触真菌孢子或菌丝体抗原时,在气道巨噬细胞吞噬真菌的同时,气道内的免疫系统还将其作为外来抗原进行提呈处理,由此可以产生针对真菌的特异性IgE而导致气道的致敏,诱发呼吸道的变态反应致使哮喘发作。
曲霉、青霉、芽枝菌、交链孢霉、木霉、毛霉、根霉、梨头霉、共头霉、担子菌及念珠菌等真菌孢子均可作为抗原而产生特异性IgE,并可引起气道变应性炎症。
一、真菌变应性哮喘的发病情况
(一)发病概况
由于实验技术上的限制和无相应的诊断标准,目前国内外对真菌变应性哮喘的发病率尚未提出一种确切的数据。
由于真菌过敏的临床表现比花粉过敏复杂得多,它不一定有明显季节性,各种真菌间的交叉反应又很高,其发病率统计,各地差异较大。
北京协和医院通过真菌皮肤试验阳性率21%,国内有人报告真菌变应原皮肤试验阳性率高达70%。
近年来各种职业性真菌变态反应的发生率增高,据美国人口统计局统计,美国农业人口总数在八百万以上,其中1/4经常接触谷物,有1/2~3/4的病人在谷尘中暴露,由于存放过久的谷尘中含有较多的真菌,许多由此引起真菌性哮喘、急性或慢性农民肺等。
我国农业人口数十倍于美国,且以手工操作为主,真菌变态反应必然是十分重要的问题。
今后随着农业、畜牧饲养业、酿造及发酵业、食品加工、蘑菇种植、制药业的发展,以及生活环境中空调器的使用、密闭式建筑物的增多,均可能进一步导致真菌变态反应的增加。
JimenezDiaz及SanchezCuenca发现西班牙对室内尘土过敏的病人中,实际上大多是对尘土中的真菌过敏。
1939年Wittich发现谷尘中的锈菌及黑粉菌孢于是明尼苏达州哮喘病人的主要致敏病原。
Bruce发现对交链孢霉过敏的24个病人中,有15例发病与空气中交链孢霉的计数高峰期相吻合。
70年代以来,Reed及Salvaggio等就致敏真菌的抗原分离提纯作了大量工作。
对多种真菌职业性变态反应作了深入研究。
1983年Crook就念珠菌对人体免疫功能的影响以及念珠菌过敏问题作了多方面的探讨。
1957年北京协和医院开始进行真菌变态反应的临床及实验室研究。
30多年来,通过数以万计病人的临床诊断和治疗及实验室空气中真菌曝片、曝皿培养等调查,对我国致敏真菌的种类、飘散规律、检验方法、抗原制备、真菌鉴定、菌种保存、抗原提纯等做了大量工作。
对于真菌所致的支气管哮喘、过敏性肺炎、肺泡炎、变应性肺支气管曲菌病取得了一些实践经验,为今后真菌变态反应的综合研究,创造了必要的条件。
(二)年龄与真菌过敏发病率的关系
研究发现对真菌过敏的发病率与患者的年龄有密切关系。
通过对将10年作为一个年龄段的调查证实,10岁以下年龄段的真菌过敏发病率最高,通常年龄越小,对真菌的过敏的发生率就越高,而随着年龄的增长,对真菌的敏感性可迅速下降。
这种现象与花粉过敏形成了鲜明的对照。
在低龄组的各种真菌皮试阳性率通常与本地区空气中真菌孢子的种类和含量较为一致,提示了当地空气中真菌的调查结果可以作为低龄组儿童进行真菌皮试的参考。
Koivikko等证实了哮喘儿童对真菌的过敏发生率相对较高,同时该结果也与儿童血清中放射性变应原吸附试验的特异性IgE滴度相对较高是一致的。
真菌性抗原有时可对严重哮喘患者构成严重威胁,是一种重要的哮喘诱发因素,严重时可导致儿童及年青的哮喘猝死。
Beaumont等对成人哮喘患者的真菌变应原提取液进行皮试调查,其阳性率小于5%,而且往往发生在对其它空气中的变应原也过敏的哮喘患者。
低龄组患儿对真菌过敏的发生率较高的原因可能与真菌广泛存在于空气中(特别是室内的流通性较差的空气)有关,而且各种真菌之间有着较高的抗原交叉性,因此从新生儿起就随时有真菌致敏的机会,同时由于婴幼儿室内活动较多,致敏的机会就更大于花粉。
一旦随着年龄增长,对真菌敏感性迅速下降。
这可以部分解释世界各地有关真菌过敏发生率的较大差异。
免疫记忆细胞可使气道产生针对真菌的特异性抗体如分泌性免疫球蛋白A(slgA),使机体对真菌的敏感性迅速下降。
气道中真菌孢子的及时清除,减少了这些抗原暴露于支气管相关淋巴组织(bronchial-associatedlymphoiddtissues),使免疫反应减轻。
哮喘缓解期或非典型的哮喘患者,可无明显体征。
在发作时,胸廓饱满,呈吸气状。
叩诊为过清音,心浊音界缩小。
呼气时可闻及哮鸣音,如果哮喘发作严重,呼吸困难加剧,而哮鸣音反而减少。
哮喘严重发作持续24小时以上称哮喘持续状态。
患者极度呼吸困难,烦躁不安,大量出汗,紫绀,可发展到血压下降,神志不清或昏迷,呼吸衰竭。
长期反复发作和感染者可并发慢性支气管炎、肺气肿等。
严重发作时可并发气胸、纵隔气肿、肺不张。
晚期可并发肺原性心脏病。
(二)其他真菌性变应性呼吸道疾病
真菌除可以诱发变应性哮喘外,还可诱发其他肺实质的真菌性支气管肺的变应性疾病,如真菌诱发的变应性肺炎(又称真菌性外源性变应性肺泡炎)等,这是一组非IgE介导的真菌性变态反应在肺部的表现,其发病机理、病理生理和临床过程均与支气管哮喘有较大区别。
作为哮喘防治工作者对这些疾病也应有所了解,以便于临床工作中鉴别诊断和治疗。
这些病人常由于吸人生活或职业环境中的各种真菌孢子而致病。
有些非真菌性的无机或有机粉尘,化学或药物等颗粒,吸入后也可致病,但真菌为其主要的病原。
临床上已知与生活或工作环境中真菌或放线菌有关的肺与支气管的变态反应性疾病主要有以下几种:
1.空调器性变应性肺炎(airconditionerallergicpneumonitis)由于长期吸入生活环境中空调器上大量生长的嗜热性放线菌所引起。
2.湿化器性变应性肺炎(humidifierallergicpneumonitis)由于吸入来自家庭、办公室或车间内所用的湿化器上繁殖的大量真菌孢子引起,有时一些非真菌性的喜湿菌如枯草杆菌等也可致病。
3.农民肺由于大量吸入发霉的农作物、干草、粮食或饲料上各种真菌孢子而发病。
致病的菌种为干草小多孢菌(micropolysporafaeni)。
4.蘑菇肺由于在人工栽培中吸入大量成熟的蘑菇散发出的担孢子(besidiospora)或吸入栽培蘑菇用的肥料中嗜热性放线菌所引起。
5.蔗屑沉积肺发病于榨糖厂工作人员,由于吸入发酵的甘蔗内嗜热性放线菌或干草小多孢菌所引起。
6.发酵工人肺(或称啤酒工人肺)主要发生于酿造工人,多数是在酿造车间中吸入棒曲霉(spergillusclavatus)孢子而发病。
7.制酪工人肺见于制酪厂工人,由于工作中吸入乳酪青霉(Penicilliurncasei.)而引起。
8洗涤剂肺由于在洗涤剂生产过程中为加强洗净度,需要加一种洁净酶,多为枯草杆菌酶(bacillussubtilisenzymo),是由枯草杆菌所产生。
洗涤剂生产者在工作中吸入枯草杆菌酶或枯草杆菌,日久可引起洗涤剂肺。
9.磨房肺发生于各种食物加工中的磨房工人,由于工作中吸入一种名为食谷菌(sitophilusgranarius)的真菌引起。
10.伐木工肺多见f伐木工人,由于吸入树皮腐败时散发的交链孢霉、树皮酵母菌(cryptostromacorticale)等真菌而引起的。
11.红杉锯末病发生于锯木工人,吸入发霉锯屑中生长的茁霉属(pullularia)孢子引起。
12.软木尘肺发生在软木制作工人中,由于长期吸入发霉软木尘屑中的真菌孢子所引起。
其
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- 真菌 过敏性 哮喘