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产物结构
BP反应
attBxattP
入门克隆
attL1-基因-attL2
LR反应
attLxattR
表达克隆
attB1-基因-attB2
完成构建Gateway™表达克隆仅需两步(图2):
1.创建入门克隆,通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。
2.混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway™LRClonase™酶,产生表达克隆。
(表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。
)
*在BP反应中基因转移形成入门克隆,在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。
可以通过以下几种方法构建Gateway™入门载体。
无论您选择何种方法,创建的入门载体都是用来与各种目的载体进行重组。
PCR克隆(定向TOPO®
克隆至入门载体或与供载体BxP重组)
·
限制性内切酶消化和连接进入入门载体
使用pCMV·
SPORT6或pEXP-AD502*构建Gateway™兼容cDNA文库
Gateway™改造过的克隆资源*
(*这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点。
这些克隆可以通过与供载体及BPClonase™酶反应转换到入门载体。
请登录获得已有克隆资源的更多信息。
PCR-定向(PCR-Directional)TOPO®
克隆
定向TOPO®
克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效。
进行5分钟的简单连接,产生>90%的重组子。
您不仅会比用连接酶介导的方法更快的获得克隆,而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。
克隆提供高效的一步法克隆策略,可以定向克隆平端PCR产物到入门载体。
平端PCR产物定向克隆的效率>90%,从而简化了筛选。
同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或限制性内切酶。
目前有两种定向TOPO®
克隆载体:
pENTR/D-TOPO®
和pENTR/SD/D-TOPO®
(表2和图3),它们具有有以下特点:
位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway™目的载体进行有效重组
通用M13位点便于测序
基于pUC的ori位点提供高产量质粒
大肠杆菌中卡那霉素(kanamycin)抗性基因筛选
表2-两种pENTR/D-TOPO®
载体的简单比较
图3-Gateway™定向TOPO®
入门载体
特点
优点
无SD(Shine-Dalgarno)位点
真核细胞中天然、N-或C-端融合;
大肠杆菌中N-端融合;
如果基因包含有SD序列,可在大肠杆菌中进行C-端或天然蛋白表达
pENTR/SD/D-TOPO®
含SD(Shine-Dalgarno)位点
包含基因10和一个SD序列,可以有效的启动天然蛋白和融合蛋白在大肠杆菌中的表达
构建入门载体的各种选择
A限制性内切酶消化
作为PCR克隆的替代方法,有5种Gateway™入门载体可以使用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆。
这些载体配合合适的目的载体,可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。
为了在真核细胞中有效地翻译蛋白,所有的5个Gateway™入门载体提供了Kozak序列。
此外,pENTR™11提供了SD(Shine-Dalgarno)序列,便于在大肠杆菌中有效的翻译。
BPCR重组克隆
重组是从PCR产物创建Gateway™入门克隆的另一种方法。
这种方法是通过合并attB位点到上游和下游引物上,然后共同孵育扩增PCR产物和pDONRTM载体(包含attP位点)及Gateway™BPClonaseTM酶混合物。
接着转化进大肠杆菌中,您将会获得包含目的基因的入门克隆,同时目的基因两侧具有attL重组位点。
这个入门克隆可以与任何Gateway™目的载体进行重组(参看图2)。
CGateway™改造过的cDNA文库
如果您已经有了用Gateway兼容载体构建的cDNA文库,您就可以通过pDONRTM载体和BPClonaseTM酶混合物进行一个简单的重组反应,很容易地把单个克隆转换成Gateway™入门克隆。
这样就不再需要亚克隆和测序,为您节约数小时的时间。
SuperScriptcDNA文库使用pCMV·
SPORT(登录获得更多信息)构建,有几种的人组织来源可供选择,这些文库有很大一部分是全长的插入片段,可以完全代表来源mRNA。
如要了解Gateway兼容文库的详细列表,请登录
D入门克隆的切入点――克隆资源
您可以从与10000个与人类基因相关的35000个克隆中进行选择,这些克隆的70%以上是全长序列的。
这些克隆来源于使用特殊的高级cDNA文库构建技术,oligodT引物,以及SuperScriptTMII反转录酶所构建的文库。
许多克隆来源于I.M.A.G.E.协会,NCICGAP项目,ResGenTM库或UltimateORF库。
克隆资源因为已克隆到Gateway改造过的载体,所以可以快速地将基因转到各种表达系统中。
图4-进入Gateway™系统的各种路线
*目前的克隆资源带有attB位点,需要与pDONR质粒重组
触手可及的最高级表达系统
一旦您构建好Gateway™入门克隆,蛋白表达和分析的大门就会向您敞开。
使用Gateway™技术,您可以进入到几乎是无数种的表达系统。
因为没有一个单一的表达系统蛋白适合于每一种蛋白,优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析您的蛋白(图5)。
为了扩展表达的选择,Invitrogen已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系统中。
无论您选择哪个系统――体外,细菌,酵母,昆虫,或哺乳动物――都可以获得Gateway™目的载体。
此外,你可以很容易地把你自己最喜欢的表达载体转换成Gateway™目的载体。
图5-在Gateway™系统表达全长开放阅读框
大肠杆菌GUS基因、人类MAP4和Eif-4E基因平行转移进目的载体,在Sf9昆虫细胞(杆状病毒)或大肠杆菌BL21-SITM菌株表达天然蛋白、N-端His或N-端GST融合蛋白。
在所有的系统中均观察到GUS良好的表达,而MAP4只在昆虫细胞中表达,Eif-4E只在大肠杆菌中表达。
在Hartley,J.L.etal.(2000)GenomeResearch10(11):
1788-95可以找到更多的细节。
表3-Gateway™技术入门选择
进入Gateway™
使用PCR和BP重组
使用限制性内切酶和超螺旋载体
12535019
Gateway™和pDONR™221PCR克隆系统
11813011
pENTR™1A入门载体
12536017
卡那霉素抗性pDONR™221
11816014
pENTR™2B入门载体
12213013
庆大霉素抗性pDONR™207
11817012
pENTR™3C入门载体
使用TOPO®
11818010
pENTR™4入门载体
K240020
CloningKit
11819018
pENTR™11入门载体
K2400480
HTPpENTR/D-TOPO®
Gateway™酶混合物
K2400500
11789013
Gateway™BPClonase™酶混合物
K242020
pENTR/SD/D-TOPO®
11791019
Gateway™LRClonase™酶混合物
K2420480
HTPpENTR/SD/D-TOPO®
12538013
Gateway™LRClonase™Plus酶混合物
K2420500
体外表达
Expresswayinvitro蛋白合成系统简化当前市场上的体外(无细胞)表达系统。
仅需两小时,您就可以在一个反应管中获得高达50μg的表达蛋白,而无须传统细胞表达体系的烦琐和花费。
仅需加入优化构建的超螺旋或线性DNA模板到Expressway反应管,DNA模板由T7启动子驱动。
每一个反应管中包括大肠杆菌(E.coli)抽提物(可以同时进行转录和翻译)和强大的ATP能量更新系统(保证连续高水平活跃蛋白表达的能量水平要求)。
Gateway™技术为进行基因功能分析和蛋白表达提供了广泛深入的方法。
您可以通过把目的基因转移到优化构建的体外表达载体,pEXP1-DEST或pEXP2-DEST(表4)(包括在系统中),然后开始体外蛋白合成。
pEXP1-DEST或pEXP2-DEST载体中的T7启动子,核糖体结合位点(RBS)(仅pEXP1-DEST)以及T7终止子之间的间隔的序列搭配都为Expressway的蛋白表达专门优化(图6),从而用Expressway进行蛋白表达。
转移的基因定向、阅读框正确,并随时可以用于表达。
图6pEXP1-DEST™和pEXP2-DEST™载体
表4-Gateway™体外蛋白合成目的载体
产品
目录号
组成
描述
pEXP1-DEST™
V960-01
N-端6xHis,具有EK裂解酶识别位点的XpressTM表位
体外表达最佳配置
T7启动子产生重组蛋白
6xHis提供ProBondTM树脂快速纯化
V5表位提供方便的检测
表位激酶识别位点可以进行裂解(pEXP1-DEST)
pEXP2-DEST™
V960-02
C-端V5-6xHis标签提供方便的检测和纯化
大肠杆菌表达
大肠杆菌提供了几种有利于重组蛋白生产的优点,包括容易操作、生长迅速和培养基要求简单。
大肠杆菌非常适于表达用于抗体生产和结构研究的蛋白。
目前有很多具有不同启动子的大肠杆菌目的载体(表5),从而为您提供一系列表达选择。
Gateway™目的载体也会为您提供N端或/和C端融合标签的选择,从而简化表达蛋白的纯化和检测。
我们提供的产品正在不断的扩展。
如需要广泛的信息资源,请联系技术服务或登录
表5-GatewayTM大肠杆菌表达目的载体
pBAD-DEST49*
12283-016
araBAD启动子
N-端硫氧还蛋白
C-端V5-6xHis
毒性蛋白严谨调节表达
融合部分提供有效蛋白翻译和增加可溶性
V5表位检测
6xHis提供ProBond™树脂快速纯化
pET-DEST42*
12276-010
T7/Lac启动子
T7启动子提供高产量的重组蛋白
T7启动子下游lacO
操纵子序列提供lac抑制子的结合
lac抑制子(lacI)提供大肠杆菌中严谨转录调节
pDEST™14
11801-016
无标签
简单柱纯化(pDEST™15和pDEST™24)
6xHis提供ProBond™树脂快速纯化(pDEST™17*)
pDEST™15
11802-014
N-端GST
pDEST™17*
11803-012
N-端6xHis
pDEST™24
12216-016
C-端GST
*6xHis标签来自Qiagen授权
酵母表达
酵母是最简单的真核生物之一。
基因组了解清楚,生长迅速,并且非常适于大规模发酵。
由于酵母是真核细胞,它可以进行高等真核细胞的一些翻译后修饰,因而可以在廉价、易于操作的宿主中,为您提供一些哺乳动物表达的优点。
Invitrogen的Gateway™酵母表达目的载体(表6)允许您利用酵母表达的优势生产目的蛋白。
如需要广泛的信息资源,请联系技术服务或登录
表6-Gateway™酵母表达目的载体
载体名称
pYES2-DEST52*
12286-019
GAL4启动子
C-末端V5-6xHis
S.cerevisiae中高水平表达
V5检测表位
6xHis进行快速纯化(ProBond™resin)
在酵母中进行功能分析
除了在酵母中表达蛋白,现在用于研究蛋白-蛋白相互作用的ProQuest™酵母双杂交系统也是Gateway™-改造过的(表7)。
这种双杂交系统允许您:
通过重组反应转移目的基因到bait载体或prey载体
使用基于GAL4转录因子重建系统确定相互作用
筛选完整文库或单一克隆
通过提供低拷贝数质粒,具有独立启动子的三种报告基因,阳性和阴性对照,及一组扩展的酵母对照菌株降低假阳性率。
快速转移DNA序列进其它系统进行多种应用
表7-ProQuest™双杂交系统
ProQuest™Two-HybridSystemwithGateway·
Technology
10835-031
系统包括:
pEXP-AD502(未酶切)*
pDEST™32*
pDEST™22*
pDBLeu
确定两个蛋白之间相互作用的完全酵母系统
构建cDNA或基因组文库,确定与bait蛋白相互作用的蛋白
构建bait蛋白
为第二个已知目的基因构建prey蛋白
使用传统的方法构建bait蛋白
pEXP-AD502NotI-SalICut
12211-017
GAL4AD
ADH启动子
进行cDNA或基因组文库定向克隆的激活结构域融合载体
组成型中等强度启动子
*3个载体全部是Gateway™-改造过的,而且具有att重组位点。
昆虫细胞表达
昆虫可以提供重组蛋白高水平、可溶性的表达。
由于昆虫细胞是较高等的真核细胞,它可以提供很多哺乳动物的翻译后修饰及悬浮状态下生长的优势。
由于杆状病毒和果蝇表达系统(DES·
)的改进,蛋白在昆虫细胞中表达已经大大简化。
InvitrogenGateway™昆虫表达目的载体允许您在您选择的昆虫系统中生产蛋白,并且获得您想要的表达结果。
Bac-to-Bac®
杆状病毒表达系统通过应用与bacmid的体内重组,简化了杆状病毒的表达。
这将允许您快速、简便地生产可以在昆虫细胞中表达的重组杆状病毒载体。
目前有3种Gateway™目的载体可以满足Bac-to-Bac®
杆状病毒表达系统的应用。
这些载体允许裂解病毒系统中多角体(polyhedron)启动子控制下的天然蛋白、6xHis融合蛋白或GST融合蛋白的表达。
果蝇表达系统(DES®
)允许在果蝇S2细胞中进行非裂解稳定或瞬时重组蛋白的表达。
DES®
使用简单的载体及直接的转染方法,然而却生产高水平的重组蛋白。
最早自转染后两天就能够观察到瞬时表达,而仅仅两周就可以建立稳定的多克隆细胞系。
表8-Gateway™目的载体
杆状病毒
pDEST™8
11804-010
polyhedrin启动子,无标签(天然蛋白)
Bac-to-Bac®
系统高水平表达
快速、容易生产重组杆状病毒
ProBond™树脂快速纯化(pDEST™10*)
简单的柱纯化(pDEST™20*)
pDEST™10*
11806-015
polyhedrin启动子,N-端6xHis
pDEST™20*
11807-013
polyhedrin启动子,N-端GST
稳定昆虫表达
pMT-DEST48
12282-018
金属硫蛋白启动子C-端V5-6xHis
DES®
系统金属诱导的高水平表达
V5表位检测融合蛋白
质粒-基础的系统提供昆虫细胞中异源蛋白的表达
pIB/V5-His-DEST
12250-018
OpIE2启动子GP64启动子C-端V5-6xHis
与两侧加有attL位点的Gateway™入门载体有效重组
快速筛选稳定细胞系
目的基因组成性表达
表达bsd抗性基因
﹡6xHis标签来自Qiagen授权。
哺乳动物表达
哺乳动物表达系统通常用来生产较高等的真核细胞蛋白。
由于转录、mRNA加工和翻译的信号是保守的,因而哺乳动物细胞一般会产生正确加工的、有活性的蛋白。
哺乳动物表达系统是生产天然蛋白的理想表达系统,这些天然蛋白可以用于功能的研究和应用。
许多Invitrogen高级哺乳动物载体已经被改造,以使用Gateway™技术(表9)。
可以得到高水平诱导和组成表达Gateway™目的载体。
这些载体提供各种N-或C-端融合标签,从而对表达蛋白进行方便和可靠的检测和纯化。
表9-Gateway™哺乳动物目的载体
哺乳动物细胞调控表达
pT-REx-DEST30
12301-016
CMV启动子,无标签(天然蛋白)
CMV/TetO2启动子进行四环素调控表达
最高水平的诱导表达
6xHis提供ProBond™树脂快速纯化(pT-REx-DEST31*)
pT-REx-DEST31*
12302-014
CMV启动子,N-端6xHis
哺乳动物细胞组成表达
pDEST™26*
11809-019
pDEST™27
11812-013
CMV启动子,N-端GST
pcDNA-DEST40*
12274-015
CMV启动子,C-端V5-6xHis
CMV启动子高水平组成型表达
选择标签进行检测、纯化或用做报告子
pcDNA-DEST47
12281-010
CMV启动子,C-端GFP
pcDNA-DEST53
12288-015
CMV启动子,N-端GFP
pcDNA™3.1/nV5-DEST*
12290-010
pcDNA™3.2-DEST
12489-019
pcDNA™v6.2-DEST*
12489-027
pDEST™12.2
11808-011
pEF-DEST51*
12285-011
EF-α启动子,C-端V5-6xHis
来自于非病毒启动子的高水平组成性表达
V5表位简化融合蛋白检测
病毒表达
pAD/CMV/V5-DEST™
V493-20
CMV启动子
Virapower腺病毒表达系统进行高水平瞬时表达
可以选择CMV或您自己的启动子
pAD/pl-DEST™
V494-20
无启动子
PLenti6/V5-DEST™
V496-10
Virapower慢病毒表达系统
CMV启动子提供高水平表达
cDNA文库构建载体
pCMVSPORT6
NotⅠ-SalⅠcut**
12209-011
cDNA定向克隆产生Gateway™-兼容文库
*6xHis标签来自Qiagen授权。
**pCMV·
SPORT6包含attB位点,而且可以用限制性内切酶和连接酶进行传统的克隆。
使您的最喜欢的载体与Gateway™兼容
Gateway™技术具有非常大的灵活性,它允许您把您最喜欢的载体作为目的载体。
您可以使用Gateway™转换系统(图6),很容易地把任何载体变成Gateway™兼容载体。
仅仅需要在您的载体的平末端限制性酶切位点插入一个包含attR重组位点的盒(cassette),用氯霉素抗性筛选转换子。
目前有三种平末端的盒,可以将任何表达载体转化成目的载体,每个盒在5’端含有attR1位点,后面带氯霉素抗性基因(Cmr)和ccdB基因。
attR2位点的盒的3’端,每个盒在三个可能的开放阅读框中的一个框架中连接N端和C端的融合蛋白。
图7-Gateway™载体转换盒
产品名称
规格
GatewayVectorConversio
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