酵素活性测定分析Word格式文档下载.docx

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2.當養分充足的時候，細胞只會吸收養分，而避免產生轉化的作用，產生不必要的反

應。

反應速率圖如下

三、實驗步驟

（1）Micropipet使用：

1.依據吸取溶液體積選擇Pipet型號。

2.設定體積時，若由低旋到高值，則需超過設定值三分之一的刻度；

若由高旋至低值，則直接旋至設定值。

且在轉時避免超過設定值之最大與最小值。

3.套上適當Tip並以下圖方式吸取溶液，盡可能將Tip與液面垂直，且小心緩慢地操作。

4.釋放溶液時，將Tip接觸管壁，慢慢壓下按鈕至第一段，過1~2秒再壓下第二段。

注意事項：

a.勿將Pipet浸入溶液。

b.吸取酸液或具腐蝕性溶液後，請將微量吸管拆解開，各部位零件以蒸餾水沖洗乾淨，擦乾後再正確組合回復原狀。

c.微量吸管的任何部份切勿用火燒烤，亦不可吸取溫度高於70℃的溶液，避免蒸氣侵入腐蝕活塞。

d.吸取黏度高溶液，請先將微量吸管頭尖端以刀片或剪刀將出口切大，並先行預潤後再吸取。

e.套有微量吸管頭的微量吸管，無論微量吸管頭中是否有溶液，均不可平放，需直立架好。

f.用完Pipet後，將其調回量取範圍最大值，以避免彈簧彈性疲乏。

（2）分光光度計使用：

A.基本操作

1.開機並設定儀器（若欲測定波長均在340nm以上，則需記得將Deuterium光源關閉）。

2.將空白試樣放入儀器中歸零，再放入樣品量取

B.牛血清蛋白濃度測定

1.取1mg牛血清蛋白溶於10mL蒸餾水，當標準液。

2.將標準液稀釋成不同倍率，作吸收度測定（與水比較）。

3.取吸收度在0.2~0.8的樣品（至少要五點）作檢量線

4.若標準偏差在0.999左右則Pipet及分光光度計應有一定技術水準。

（3）培養基製作、劃菌、勾菌：

A.培養基製作（LB）：

1.配製1%Bactotryptone、0.5%Bactoyeastextract、1%NaCl，並以5NNaOH調至pH7.0。

（%為重量百分比）

2.用濕式滅菌法滅菌30分鐘。

3.待冷卻至50度左右，便在無菌操作台視需要決定是否加入抗生素（A液）。

4.若在步驟

（1）中加入Agar，便可利用倒在培養皿來作LB-plate。

B.劃菌落：

1.以滅菌牙籤（或鉑銥圓環）沾取菌落，並在上法所作之plate以下圖方式劃出橫線。

2.將培養皿倒置，並在其上標示記號及日期，於適當環境培養。

C.勾菌：

1.無菌操作下，取一適當試管（已滅菌過），一手打開試管蓋，加熱管口後，以Pipet吸取3mLA液於試管。

2.將已沾菌落的竹籤伸到溶液內攪一攪，再將管口過火後，把蓋子蓋回。

3.將試管放置於適當環境培養。

D.注意事項：

1.只要沾過菌的器具或培養基，均需滅菌。

桌面或地面沾到菌液均要以漂白水擦拭過或者以高壓滅菌槽滅菌。

2.本實驗以E.coli為例，而酵母菌或E.coli的最佳培養環境為37度。

因此隨著培養菌種的不同，需應調整環境。

（4）生長曲線測定：

1.取兩個滅菌過的三角瓶，各用吸量管吸30mLLB培養基（1%Tryptone、0.5%Yeastextract、1%

NaCl）。

而兩個均加入glucose（0.5%），其中一個多加lactose（1%）以標籤標明。

2.取培養過的E.coli菌液1mL各加入此兩瓶中。

將兩瓶拿去適當環境培養（37℃,170rpm）

3.以LB培養基作blank，將兩瓶每隔1小時測一次光學密度OD600（包含為培養前作為0時。

且吸收度超過0.8時，需稀釋至0.8以下，再借由稀釋倍率來求得光學密度）至到達生長曲線

之停滯期時停止。

四、實驗結果

五、討論

此實驗是未完成的，因為做的時間太少，理論上要做到Lactose的生長曲線會繼續在成長，如下圖理論上應該是這種曲線

在同時存在glucose和lactose的培養基下,菌株會先利用單醣形式的glucose,lactose因為是雙糖不容易被分解掉，所以菌珠比較喜歡用單糖，所以glucose一旦被用完，lactose可以利用promoter表現我們要的蛋白質β-galactosidase，表現出來後lactose一來可以誘導，也可以因為它誘導出β-galactosidase這個酵素，被分解成Glucose和galactose，所以這兩個會變成單糖，因此比較好被分解，所以會有兩段的生長趨勢。

DNA分離與分析

一、原理

質體DNA分離（鹼溶裂法）︰

將細胞懸浮後，利用鹼處理破壞DNA中鹼基對的氫鍵，使質體DNA及染色體DNA打開形成單股結構，再加入酸中和,染色體DNA因分子過於龐大，急速中和反應使得鹼基匆忙配對，形成雜亂無序的巨大分子，加入鹽類使溶解度降低產生沉澱，離心後，質體DNA會留在上清液中，可加入酒精或異丙醇使上清液沉澱即可得所需質體DNA。

藥品

功能

TEbuffe

懸浮細胞

NaOH

使DNA變性

SDS

溶解細胞

醋酸

中和鹼性

鉀鹽

與DNA形成錯合物,有利沉澱

酒精

沉澱質體DNA,去除鹽類

異丙醇

沉澱質體DNA

洋菜膠電泳分析︰

DNA含有磷酸根，在中性及鹼性環境下帶負電，通電後會往正極移動，洋菜膠體中有許多孔隙，濃度越高，孔隙越小；

在電場中，不同大小的DNA片段在洋菜膠體的孔隙內往正極移動，體積越大者，移動時所受的阻力越大，其移動越慢，而體積較小者，則移動較快，因此藉由洋菜膠體電泳的過程可將不同大小的DNA分開。

二、試劑藥品

鹼溶裂法

TEbuffer：

25mMTris-HCI,10mMEDTA,pH8

Lysisbuffer：

0.2NNaOH,1%SDS

Neutralizationbuffer：

5Mpotassiumacetate

洋菜膠電泳

洋菜膠（agarose,lowEEO）

1xTAE電泳緩衝液

10x追蹤染劑：

0.25%bromophenolblue,0.25%xylenecyanol,0.1MEDTA,50%glycerol

SYBRgreenstocksolution（100X）

DNAmarker：

包含12個片段100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1200,1500（bp）

三、操作步驟

製備8-well1.2%agarosegel配製：

1.秤取agarose0.3g，加入1xTAE25mL，微波加熱後注入鑄膠器中

DNA分離：

1.依前述法培養E.coli（含pEGFP-C1）

2.以高速離心6000rpm,1min，收取細胞

3.加入200μLTEbuffer，震盪使細胞懸浮

4.加入200μLLysisbuffer，輕輕翻轉數次

5.加入200μLNeutralizationbuffer，輕輕翻轉數次

6.高速離心12000rpm,10min，取上清液於微量離心管

7.加入500μL異丙醇（IPA），高速離心12000rpm,10min後移除上清液

8.加入500μL乙醇98%，高速離心12000rpm,10min移除上清液

9.將質體DNA靜置烘乾，加入20μLTEbuffer即是純化後質體DNA

1.待測樣品溶液分別加入2μLSYBRgreen及2μLloadingdye靜置30min

2.將調配好樣品溶液依序注入well進行電泳

3.以電壓100V進行電泳,待染劑行進至膠體2/3處，關閉電源,取出膠片

4.以UVtransilluminator觀察色帶位置並紀錄結果

5.與標準品分子量比較，估計各DNA片段之分子量

Lane1:

A標準品溶液100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1200,1500（bp）

Lane2:

B樣品溶液（含質體pEGFP-C1）

Lane3:

C樣品溶液（含質體pEGFP-C1）

pEGFP理論大小：

5473bp

（由於操作時間不足，使得色帶分佈較差）

五、結果討論

1.為何C組注入口有殘留？

Ans：

可能是因為我們是利用簡易的鹼溶裂法萃取質體DNA，所以在純化過程中可能會因為固液分離時，抽取到染色體或蛋白質等雜質，致使在電泳分析時會因為分子大小差距甚大，使得大分子雜質在樣品注入槽中殘留。

六、結論

這次選用的標準品分子量100~1500（bp）與待測質體pEGFP-C1理論大小5473（bp）不符，導致無法正確判斷樣品所含DNA分子大小，且因為質體DNA具有三種不同的構形,而標準品分子只具有線性型態存在，所以不能準確判斷質體DNA的大小,但由實驗結果可確定實驗操作中有分離出DNA，並且此DNA大於1500（bp），因此下次電泳操作應改變標準品的DNA色帶分佈。

蛋白質之分離、純化與分析

（I）離子交換層析分離

各種蛋白質的帶電性強弱不同，與離子交換介質間吸引力的大小會有差異，可以進行分離。

蛋

白質的帶電性，會因環境的pH不同而有改變。

PI等電點

當pH值介於等電點時protein為電中性,當pH值小於PI則protein帶負電，當Ph值大於PI則

protein帶正電，利用此一特性可依其分子帶電性的差異來分離。

離子層析分為陰及陽離子交換

層析分離，其中差異是在前者之固定相為帶正電後者為負電，則分別會吸附帶負電及正電之蛋

白質。

（II）金屬層析分離

許多蛋白質或酵素分子上帶有金屬離子，則此蛋白質可能會吸附該金屬。

若把某金屬固定到固

定相上，怎此固定相會專一性的吸附需要此金屬的蛋白質。

基因操作時，經常在表現蛋白質的

端點，加上一段含有6個his的片段；

則此表現蛋白質，可以吸附到含有鎳的固定相上，洗去

雜質後可用imidazzole流洗出來。

（III）蛋白質電泳

蛋白質分子是由胺基酸組成，而胺基酸帶有可解離的胺基（-N+H3）和羧基（-COO-），是典型的兩性

電解質，在一定的pH條件下會解離而帶電。

帶電的性質和多少取決於蛋白質分子的性質及溶

液的pH值、離子強度。

在某一pH條件下，蛋白質分子所帶的正電荷恰巧等於負電荷數，即靜

電荷等於零，此時蛋白質質點在電場中不移動，溶液的這一pH值稱為該蛋白質的等電點（pI）。

如果溶液的pH值大於pI，則蛋白質分子會解離出氫離而帶負電，此時蛋白質分子在電場中正

極移動。

如果溶液的pH值小於pI，則蛋白質分子結合一部份氫離子而帶正電，此時蛋白質分

子在電場中向負極移動。

而流動率與所帶電荷成正比,而與分子量成反比；

但若分子量一樣,但形狀愈不規則,或體積越鬆

散者泳動率越小。

（SDS是界面活性劑，可使蛋白質變性，並在分子表面均勻佈上一層負電荷。

）

二、實驗藥品

1.WashBuffer:

50mMNa2HPO4pH7.0

2.ImidazzoleBuffer:

3.DEAE-cellulose

1.WashBuffer:

50mMNa2HPO4pH8.0NaCl20mM

50mMNa2HPO4pH8.0NaCl250mM

3.金屬螯合親和層析膠體

（III）蛋白質電泳藥品

30%acrylanidemix

1.5MTris（pH8.0）

10%Ammoniumpersulfate

10%SDS

TEMED

1.震盪作為固定相之DEAE-cellulose膠體使之懸浮，小心倒入管柱中，讓膠體慢慢沉降

2.在沉降過程中隨時加入WashBuffer，勿使膠體乾掉。

3.待膠體完全沉降後，高度約在0.5cm左右。

膠柱以WashBuffer一直流洗，流速可以不考慮。

4.將預測液同上述膠體過濾法，當預測液全部沒入膠體後，收集流出液

5.以WashBuffer流洗10ml後，去除膠體上方的緩衝液，但勿使膠體乾掉。

6.最後以ImidazzoleBuffer溶離預測物，流洗約1ml。

7.收集上步驟之衝提液，以進行SDS-PAGE電泳分析。

（II）金屬螯合層析分離

1.固定相金屬螯合親和層析膠體1ml裝填於管柱中，成為一淡藍色膠柱。

2.以WashBuffer5.0ml流洗，加入欲測液2.5ml。

3.再次以WashBuffer5.0ml流洗，最後以ImidazzoleBuffer1.0ml流洗下欲分析物並收集液。

4.收集衝提液，以進行SDS-PAGE電泳分析。

（III）跑蛋白質電泳

1依表配置分離膠體

2.將配置好膠體注入膠槽中，以Isopropanol壓平液面，挿入齒模靜置20min

3.將Isopropanol倒出，依表配置焦集膠體並注入，插入齒模以形成樣品槽

4.將樣品加入3Xloadingdye置於95℃恆溫器中加熱10min（蛋白質標準液只需加熱5min）

5.待加熱樣品冷卻後，依序注入樣品槽，以110V進行電泳分析

6.待染料色帶跑至膠片底部即可關掉電源

7.將膠片取出，置於Stainindbuffer中染色5min

8.將染色後膠片取出，以自來水洗清殘餘染色劑，倒入20mLDestainingbuffer脫色

9.以照相系統存取結果並討論

A標準溶液（含6個片段94.7;

66.2;

45;

29;

20.1;

14.4kd）

B樣品溶液（含VHb）使用金屬螯合層析分離

C樣品溶液（含VHb）使用離子交換層析分離

D樣品溶液（同B）

E樣品溶液（同C）

F標準溶液（同A）

VHb理論大小：

20.1kb

為何色帶呈現扭曲？

可能是當初在製作膠體時，容器底下氣泡未排除乾淨，於是在膠體凝結時，氣泡移動導致膠體分佈不均。

蛋白質電泳是利用待測樣品的帶電性不同，藉由膠體的孔隙，使不同大小的蛋白質通過所需時間的時間不同，藉此分析蛋白質的種類；

以金屬螯合層析的結果可知分離出的蛋白質分子量主要約為20.1kd，以及少許低於20.1kd的蛋白質存在，有可能是雜質；

而離子交換層析所得的結果，在20.1kd附近完全無滯留，可能由於在做離子層析時pH值調整為7,使得PI點為7之蛋白質（VHb）不帶電，導致分離失敗；

應在做離子層析分離時，將pH值調整為7以上，使蛋白質帶負電，應可分離出目標蛋白質（VHb）。

酵素活性測定分析

一、實驗目的

1.學習如何正確使用分光光度計

2.學習應用beer’slaw原理

2.測定金屬離子純化酵素三階段，並比較其活性

酵素活性之維持

A酵素的安定性不同

酵素在細胞中合成後，有的分泌到細胞外，有的運送到細胞器官中貯存或應用。

前者（分泌性酵素）因為要在細胞外的惡劣環境中生存，因此較為堅韌，不易受到破壞；

反之，細胞內的酵素，都以較濃的濃度集中在保護良好的胞器內或胞膜上，一但抽離細胞暴露在氧氣中，可能很容易失去活性。

不同的蛋白質，會有不同的處理方法。

例如，胞膜上的酵素就相當麻煩，在安定性與活性分析上，就有相當的不同；

其純化方法，也與水溶性酵素有很大差異。

B.酵素失活的原因

可歸類成如下的物理性或化學性原因。

（1）蛋白質變性：

離開細胞的生理環境後，蛋白質可能遇到極端的pH條件、不適的溫度或變性劑（如SDS或尿素），均會使蛋白質的構形破壞。

（2）酵素活性區破壞：

在抽取過程中，若失去cofactor，或者活性區的關鍵胺基酸被修飾，均可造成。

最常見的影響是氧化，尤其是cysteine上的-SH基很容易被氧化。

一般加入EDTA除去可活化氧分子的二價離子；

或加入抗氧化劑，以自身氧化防止-SH基氧化。

（3）蛋白脢水解：

細胞內有許多蛋白脢，細胞被打破後即釋放到酵素溶液中，很快水解酵素。

可用蛋白脢的抑制劑防止之，但蛋白脢有數大類，各有不同類的抑制劑；

一般使用PMSF（phenylmethylsulfonylfluoride）是Ser型蛋白脢的抑制劑，但也抑制部分其它類型者；

PMSF在水溶液中很快就會降解。

（4）酵素抑制劑：

在自然界中或以人工合成，發現許多酵素有抑制劑，可以專一性地抑制酵素活性；

有可逆性的，也有不可逆的，通常不可逆抑制劑的效果都很強烈。

凡是可以水解蛋白質上胜汰鍵的酵素，均統稱為蛋白脢。

蛋白脢的種類非常多，我們大致歸納為四大類，均依其催化特性來命名。

例如metalprotease是因為分子中含一金屬離子，此金屬離子不但可維持酵素的正確分子構形，也可以參與催化反應；

Ser及Cysprotease是因為催化區上含有一個Ser或Cys胺基酸為主要的催化機團；

而Aspprotease也是因為分子上需要有兩個Asp基團，以便抓住水解所需的水分子。

每一類蛋白脢家族內，其成員的催化機制都相同，但催化目標的專一性不同；

例如Ser家族內的trypsin嗜好水解鹼性胺基酸，而chymotrypsin喜歡較大的芳香基團。

c.如何保持活性

若酵素不太穩定，活性不易保持，請參考下列處理方式：

（1）儘快進行純化及各項分析，隨時保持在4℃或冰浴中。

（2）讓酵素保存在硫酸銨固体沉澱中，要比溶液狀態安定得多。

（3）勿讓高純度的酵素，保存在稀濃度溶液中，否則要加BSA當安定劑。

（4）勿隨意凍結或解凍酵素液，可加防凍劑（如甘油或醣類）以液態保存。

（5）冷凍乾燥雖可長期保存酵素，但有些酵素活性可能會因而下降。

（6）若容易受微生物污染，可經無菌過濾後保存（當然也會損失一些酵素）。

酵素活性單位

　活性單位（activityunit）是酵素活性高低的指標。

一個活性單位的定義，是在固定溫及pH下，每分鐘可催化1mmole基質的活性。

但很多情況下，為了操作或計算的方便，直接用測定產物所得的吸光值，除以單位時間來表示活性，因此活性單位的定義可能不同。

有關酵素活性及其基本背景，請複習生物化學中的酵素章節；

你在大學所念到的酵素知識，在研究所還是完全適用。

反應流程

D型安基酸氧化酶只會反應D型安基酸，所以它不會反應L型的安基酸，會產生NH3跟α-ketoacid還有H2O2，因為α-ketoacid我們不行及時偵測，可是H2O2一反應出來可以馬上跟我們的呈色劑（紅色框框）產生反應，這兩個紅框裡我們必須用peroxidase來進行催化，就會產生有顏色的出來（藍框框）。

三、實驗藥品

H2O、Potassinmphosphatebuffer,pH8.0、D-alanine、o-phenylenediamine/o-dianisidine、

Horseraddishperoxidase、Enzyme（DAOase）

四、實驗步驟

1.取純化後之酵素及粗菌液至於冰水浴中待用

酵素為DAOase

將原菌液利用利用超音波打破菌體，為粗菌液，在利用離子純化液及金屬層析純化液分為purified、throughout，並加以編號

超音波打破時要注意不可轉太久，以免過熱導致蛋白質不能使用

2.分別依序加入

Reagent

Stock

Final

Volume

H2O

675

L

Potassinmphosphatebuffer,pH8.0

1M

0.1M

100

D-alanine

0.3M

0.03M

o-phenylenediamine/o-dianisidine

0.3%

0.03%

Horseraddishperoxidase

0.25U/

5U

20

Enzyme（DAOase）

10

DAOase加入後動作要快,否則反應已過最高峰,則會有誤差,活化的目的將不會明顯的呈現出來

3.將分光光度計開啟,並點選Timecoursemeasurement,在選擇Measurement之parameter將參數依下列更改Photometricmode=abs;

Response=quick;

wavelength=453nm;

Endtime=300sec;

Datapitch=0.2sec;

Display=auto

4.利用分光光度計之動力學參數來偵測OD453之隨時間變化。

5.分別分析粗菌液、離子交換純化液及金屬層析純化液之間之活性差異。

計算：

beer’slaw

A：

吸收度

：

莫耳吸收光度b：

輻射路徑長度c：

濃度

比活性（U/ml）=

=

Vt（總體積）=1005

LVs（樣品體積）=0.01

L

12.6：

Millmolarex