细胞治疗实验室工艺流程Word格式文档下载.docx

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患者基本情况

采血日期：

姓名

年龄

性别

科室

病案号

主管医生

床号

传染病

临床诊断

病理切片

细胞制备标准操作记录

分血

数量

单位

日期

操作人

复核人

备注

自体血浆体积

ml

白细胞体积

Ficol体积

批号：

PBMC总量

×

109

DC细胞制备

1、PBMC用量

×

108

2、铺瓶（板）

瓶（板）

3、加DC培养液体积

4、DC诱导因子（100X）

5、第五天加DC成熟剂1（100X）

6、第六天补加DC成熟剂2（100X）

7、第七（八）天收集DC

107

CIK细胞制备

1、添加IFN-r

IU

2、PBMC用量

3、接种体积

4、添加CIK混合因子（100X）

5、补液

第1次

第2次

第3次

第4次

第5次

第6次

CD3AK细胞制备

1、添加CD3AK混合因子（100X）

2、PBMC用量

4、补液

γδT细胞制备

2、接种体积

3、添加γδT混合因子（100X）

NK细胞制备

3、添加NK细胞混合因子（100X）

细胞冻存及复苏标准操作记录

细胞冻存标准操作记录

编号

细胞

类型

冻存数量（支）

冻存液

存放

位置

细胞复苏标准操作记录

复苏数量（支）

复苏

用途

自体细胞制剂回输记录

次数

细胞类型

批号

体积（ml）

回输方式

运送人

接收人

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

自体细胞制剂检控记录

外观

细菌真菌

培养

革兰氏染色

细菌内毒素

最终检定结果

存活率

回输细胞批号

均匀悬浊液，无异物

第一次回输前3天

每次回输当天

需经检定合格后方可回输

存活率≥85%

□是□否

□阳性□阴性

□合格□不合格

CIK细胞培养标准操作流程

一、溶液的配置

1、热灭活自体血浆的制备：

将自体血浆装在无菌的离心管内，放入56摄氏度水浴锅内热灭活40分钟，取出用2500转离心10分钟，取出上清备用。

2、IFN-r母液（1000X）：

用无血清培养基配成100万IU/ml。

3、CIK混合因子（100X）：

冰箱4度保存。

4、CIK完全培养基：

无血清培养基加1%-2%热灭活自体血浆。

二、CIK细胞制备：

1、血细胞单采机采集病人浓缩白细胞和血浆（80-100ml）。

2、准备2支50ml离心管，每管加入淋巴细胞分离液20ml。

3、将浓缩白细胞从血袋中取出，直接等量加到上述2支50ml离心管淋巴细胞分离液上面，2000转离心25分钟，升降速调到最低值。

4、取出上层的血浆收集到一支50ml离心管中，余下的部分除红细胞外全部收集到2支50ml离心管中，加生理盐水到50ml，1500转离心10分钟，去除上清，合并2支管内的细胞到一支50ml离心管中，加50ml生理盐水，取20ul样品用于计数，1200转离心7分钟，去除上清。

5、所有的血浆留出12支5ml用于回输，其余全部56摄氏度灭活40分钟，灭活完成后2500转离心10分钟，收集上清备用。

6、将细胞用CIK完全培养基配成1X106/ml，加入IFN-r母液至1000IU/ml，接种1个细胞培养袋，袋内加200mlCIK完全培养基。

7、24小时后，按1:

100加入CIK混合因子。

8、第5天，按4倍稀释添加含300IU/mlIL-2的CIK完全培养基。

9、第8天到第9天，按2倍稀释添加含300IU/mlIL-2的CIK完全培养基。

同时取样做细菌真菌培养。

10、以后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前1天取样送检做革兰氏染色检查。

11、等拿到细菌真菌培养结果后，检查所有结果是否为阴性。

CIK培养到第10天-15天内回输。

12、回输时收集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。

13、将收集到的细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，2万IUIL-2，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。

14、将完成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。

DC细胞培养标准操作流程

2、DC基础培养基：

用无血清培养基+2%热灭活自体血浆。

3、DC诱导剂（100X）：

4、DC培养基：

DC基础培养基加入DC诱导剂

4、DC成熟剂1（100X）：

5、DC成熟剂2（100X）：

二、DC细胞制备：

1、取PBMC，加入IMDM培养基配成5X106/ml细胞悬液，按每孔3ml接种到6孔板内，放入培养箱。

2、2小时后，取出，晃动去除上层杂细胞，留下贴壁的单核细胞（体积比其它细胞稍大），每孔加入3mlDC培养基。

3、第5天，按每孔30ul加入DC成熟剂1，取样做细菌、真菌培养。

4、收集细胞前12小时每孔加入30ulDC成熟剂2，同时取样送检做革兰氏染色检查。

5、DC培养到第7-8天，收集细胞，用生理盐水洗3次，分成4份，其中一份用于当天回输，其余冻存在-80度冰箱中。

6、将生理盐水清洗过的DC细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。

7、将完成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。

CD3AK细胞培养标准操作流程

2、CD3AK混合因子（100X）：

3、CD3AK完全培养基：

无血清培养基+1%-2%热灭活自体血浆+CD3AK混合因子。

二、CD3AK细胞制备：

1、PBMC用CD3AK完全培养基配成1X106/ml，接种培养瓶或培养袋培养。

2、第5天，按4倍稀释添加CD3AK完全培养基。

3、第8天到第9天，按2倍稀释添加CD3AK完全培养基。

4、以后每隔一天按2倍稀释补一次液，第一次回输前1天取样送检做革兰氏染色检查。

5、等拿到细菌真菌培养结果后，检查所有结果是否为阴性。

CD3AK培养到第10天-15天内回输。

6、回输时收集细胞于离心管内，1200转离心7分钟，去除上清，收集细胞后加生理盐水再离心2次，1200转离心7分钟。

7、将收集到的细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，2万IUIL-2，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。

8、将完成的细胞悬液封好瓶口，核对病人姓名、性别、年龄、住院号、细胞数、无菌结果、病区及治疗项目，确认无误后，贴上标签，送病区进行回输。

γδT细胞培养标准操作流程

2、γδT混合因子（100X）：

3、完全培养基：

无血清培养基1%-2%热灭活自体血浆。

二、γδT细胞制备：

1、将PBMC用完全培养基配成2X106/ml，加入混合因子，接种培养瓶或培养袋培养。

2、第5天，按2倍稀释添加含400IU/mlIL-2的完全培养基。

3、第8天到第9天，按2倍稀释添加含400IU/mlIL-2的完全培养基。

γδT培养到第10天-15天内回输。

7、将收集到的细胞加入到150ml注射用生理盐水中，加入5ml自体血浆，留1ml细胞悬液到1.5ml离心管中，4摄氏度存放3月备查。

NK细胞培养标准操作流程

2、NK细胞混合因子（100X）：

SCGM无血清培养基+1%-2%热灭活自体血浆。

二、NK细胞制备：

1、将PBMC用完全培养基配成1X106/ml，加入NK细胞混合因子，接种培养瓶或培养袋培养。

2、第5天，添加2倍量完全培养基，加入500IU/mlIL-2。

3、第8天到第9天，按2倍稀释添加含500IU/mlIL-2的完全培养基。

NK培养到第10天-15天内回输。

细胞冻存和复苏标准操作流程

1、程序降温盒的准备：

按程序降温盒上的标示量加入250ml异丙醇作为冷冻液，室温放置。

2、冻存液的配置：

热灭活自体血浆加入10%DMSO。

9、细胞冻存

1、将要冻存的细胞离心1200rpm，7min，去除旧的培养液。

2、轻轻混匀细胞沉淀，加入适量配制好的冻存培养液，DC细胞调整细胞密度为5×

106/ml～2×

107/ml，每管冻存0.5ml；

PBMC调整细胞密度为1×

107/ml～2×

108/ml，每管冻存1-2ml。

3、将细胞分装入冻存管中，在冻存管上标明细胞的名称，病人名称，病人编号，冻存时间。

4、将冻存管放入室温状态的程序降温盒，直接置入-80℃冰箱。

5、程序降温盒内的异丙醇需要定期添加，防止蒸发造成冷冻液不足。

10、细胞复苏

1、在离心管内先准备好冻存液体积10倍以上的清洗液（DC用生理盐水、PBMC用培养基）。

2、水浴锅内水温达到37度。

3、将冻存管放入水浴锅内，不停晃动，直到全部融化为止，一般要求在1分钟内融化完毕。

4、将细胞尽快转移到清洗液中，1200转离心7分钟，去除上清，得到复苏后的细胞。