生物质谱在蛋白质组学研究中应用Word文档下载推荐.docx
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为了从更高层次上深入解读生命的本质和生命
活动的规律。
3、为人类疾病的病理研究、早期诊断、治疗以及
药物开发提供依据。
1、蛋白质组表达谱
(proteomeexpressionprofiling)
针对已有基因组或转录组数据库的生物体、组织或细胞,建立相应蛋白质组或亚蛋白质组数据库。
如:
Humanplasmaproteomeproject;
Humanliverproteomeproject。
2、蛋白质组修饰谱
(proteomemodificationprofiling)
建立生命功能执行和调控网络相关的蛋白质
翻译后修饰数据库。
3、基本生物学问题
研究与生命活动过程中密切相关的问题。
比如:
Post-translationalmodification;
Protein-proteininteraction;
Genome-Transcriptome-Proteome。
4、临床应用问题
以重要的生命过程或人类一些重大疾病为对
象,进行重要的生理和病理体系或过程的研究,
即进行比较蛋白质组学研究。
Diseasemarker-diagnosis
Mechanismofthedisease
Drugtarget-therapy
5、蛋白质组学中的新技术和新方法
建立蛋白质组学支撑技术平台以及生物信息
学研究工具。
一种细胞、组织或生物体有多少蛋白质?
人类基因组含有3~4万个基因,仅是果蝇
或线虫的两倍左右。
人体:
1个受精卵1012细胞,103细胞类型。
其“蛋白质组”随“时”、“空”处于变化之中,而“基因组”则处于永恒于之中。
生命体的统一性源于基因组
生命体的复杂性基于蛋白质组
五、主要研究策略
1、研究基础
(1)生物学的发展,特别是基因组测序的
完成为我们提供了蛋白质组数据库;
(2)生物质谱和分离科学的进步为我们提
供了分离和鉴定的必须手段;
(3)计算机技术的提高,特别是生物信息
学的发展为我们处理海量数据提供了
有力的支持。
2、蛋白质组学研究方法分类
(1)蛋白质定性分析
依据分析对象是整体蛋白质混合物或酶切后的多肽混合物,蛋白质组的定性分析方法分为自下向上法(bottomup,针对多肽混合物)和自上向下法(topdown,针对整体蛋白质混合物)。
依据蛋白质数据库中是否存在所鉴定的蛋白质,蛋白质组的定性分析方法进一步分为:
对蛋白质数据库中含有待鉴定的蛋白质,包括:
肽质量指纹谱法(PMF,适合于简单蛋白质混合物);
肽序列标签法(PST,适合于复杂蛋白质混合物)
对蛋白质数据库中不存在待鉴定的蛋白质,采用从头测序法(denovo)
(2)蛋白质组相对定量分析方法
①直接进行比较,包括SDS-PAGE、2DE、HPLC;
②标记方法,包括同位素标记亲和标签
(ICAT)、元素标记亲和标签(ECAT)、
同位素氨基酸细胞培养标记(SILAC)和
DYGE技术;
③直接同位素标记法,如酶促18O标记。
3蛋白质组研究方法进展
(1)复杂蛋白质组体系
目前对于组织、细胞和血浆等复杂蛋白质组的分析,均采用多维分离技术与质谱联用的方法。
(2)简单的蛋白质组体系
对于特定的、简单的蛋白质组分析,既可采用多维分离技术与质谱联用的方法,也可以采用较少步骤的分离和质谱联用技术。
其技术路线如图3所示。
1、表达谱构建
2、修饰谱构建
3、蛋白质组定量
1、表达谱构建
(1)2DE-MALDI-TOF/TOFMS技术平台
2DE-MALDI-TOF/TOFMS技术路线具有分离效率高、直观和相对定量的特点,被广泛应用于蛋白质组学的研究。
目前该技术在我们实验室已经成功地应用于胎肝蛋白质组、血浆蛋白质组和成人肝脏蛋白质组等组织和细胞系蛋白质组的研究。
2DE-MALDI-TOF/TOFMS技术平台
技术路线特点:
成功率(考染):
大于90%
蛋白质组双向电泳zoom胶技术与MALDI-TOF/TOFMS联用
为了获得更高的分离度,展示更多的蛋白质点,采用ZOOM胶技术是一个重要的选择,并通过MALDI-TOF/TOFMS的联用,可鉴定更多的蛋白质点。
胎肝全蛋白2-DE表达谱
共鉴定:
601,唯一蛋白质:
330
(2)多维分离-质谱分析技术平台构建
作为2DE-MS技术平台的重要补充,多维分离技术路线已经受到人们的高度重视。
多维液相色谱既可用于整体蛋白质预分离,也可用于多肽混合物的预分离。
与小分子相比,由于蛋白质或多肽的理化性质(分子量、等电点和疏水性等)的显著差异,使其在色谱柱中的传质速率和容量因子相差较大,所以在对其进行分离时,一般采用梯度洗脱,且色谱峰较宽。
整体蛋白质分离方法选择依据:
(1)依据分子形状和大小,如超滤、体积排阻等;
(2)依据分子密度性质,如蔗糖梯度密度离心技术;
(3)依据分子等电点不同,如离子交换、色谱聚焦、
等电聚焦;
(4)依据分子疏水性不同,如反相色谱、疏水色谱;
(5)依据亲和性不同,如亲和色谱;
(6)依据与金属离子螯合性质的不同,如IMAC方法
对磷酸化肽段提取;
(7)依据特殊化学反应基团,如巯基填料选择性富集
含巯基的肽段。
液相色谱-质谱联用方法用于严重急性呼吸系统综
合征冠状病毒结构蛋白质的研究
到2003年5月初,全世界完成全基因组测序并提交到Genebank的病毒株已达到11株,其中包括由军事医学科学院微生物流行病研究所和中国科学院基因组研究所提交的BJ01病毒株的全基因组序列。
SARS-CoV(BJ01)基因组
基因组预测的SARS-CoV(BJ01)蛋白质的理化性质
研究意义
SARS冠状病毒基因组序列的测定为SARS病原学及后续研究奠定了基础,但基因组全序列的解析并不等于揭示了基因组所编码的全部蛋白质。
依靠生物信息学的系统分析,可以较为全面地预测病毒基因组所编码的全部蛋白质,但是难以洞悉蛋白质合成后所发生的大量的裂解、修饰与定位、转运。
研究目的
采用蛋白质组学的策略,通过系统研究SARS冠状病BJ01株的天然结构蛋白质,全面验证基因组与生物信息学推测的SARS冠状病毒的蛋白质组及其裂解、修饰的蛋白质表达谱,为全面揭示SARS的发病机理、提供SARS早期诊断及药物筛选的靶标、研制有效的治疗药物提供基础。
N蛋白质肽序列检索结果
S蛋白质肽序列检索结果
M蛋白质肽序列检索结果
N蛋白质分子量
Theoretical:
45935Da
Measured:
45929Da
Difference:
0.13/1000
MALDI-MS测定N蛋白质分子量
1N蛋白降解片段
2完整N蛋白
SARS-CoV攻击VeroE6细胞裂解液蛋白质HPLC
小结
1、利用蛋白质组学策略,从SARSCoV感染的VeroE6细胞提取
液中成功鉴定出S、N及M三个结构蛋白质,其中M蛋白首次
在蛋白质水平鉴定出来;
2、精确测定N蛋白的相对分子质量,证明其氨基末端的第一
个氨基酸-丝氨酸发生乙酰化修饰,提示不存在理论预测的
磷酸化修饰;
3、通过比较表明两种方法在蛋白质组学研究中各具优缺点,
可根据不同目的选择使用。
胎肝线粒体蛋白质制备
胎肝组织充分清洗后进行匀浆,然后对匀浆液(2%蔗糖,蛋白质酶抑制剂,2~3g/10ml)进行蔗糖密度梯度离心(120000g,90min)提取线粒体,最后用裂解液(8Murea,65mMDTT,40mMTris)提取全蛋白质,25000g离心并过滤后,进一步进行整体蛋白质分离。
用ProteomLabPF2D色谱仪对胎肝线粒体提取液进行二维色谱分离示意图
对胎肝线粒体全蛋白提取液的一维色谱分离
一维色谱分离M2B3馏分的反相色谱分离图
色谱条件:
反相柱为4.6mmI.d.35mm,C18,1.5μm;
流速为0.5ml/min;
检测波长214nm;
溶剂梯度:
0~100%B,60min,100%B保持8min,1.0min回到100%A平衡色谱系统;
每管收集2min。
整体蛋白混合物二维色谱分离实验结果:
一维色谱聚焦:
40个馏分(0.3pH或5min)
二维反相色谱:
20个馏分(1.0min)
总计:
800个馏分。
M2C8_21反相色谱馏分酶切液进行MicroLC-ESI-IonTrapMS
扫描中保留时间为12.90min时的一级质谱图
SEQUEST处理的结果
判据:
电荷为+1时,Xcorr值2.0;
电荷为+2时,Xcorr值2.2;
电荷为+3时,Xcorr值3.5;
△Cn≥0.1;
而且至少2肽段或3个连续的y或b序列
NanoLC-ESI-Q/TOFMS
M2B3_18反相色谱馏分酶切液的NanoLC-ESI-Q/TOFMS
一级质谱总离子流色谱图
M2B3_18反相色谱馏分酶切液的NanoLC-ESI-Q/TOFMS二级质谱四通道总离子流色谱图
M2B3_18反相色谱馏分酶切液中m/z为795肽段的NanoLC-ESI-Q/TOFMS二级质谱的质谱图
MASCOT对数据进行检索
结论
一、通过整体蛋白质两维色谱预分离和毛细管反相液相色谱-质谱鉴定方法联用,离子阱质谱鉴定出478个胎肝蛋白质,Q/TOF质谱鉴定出319个胎肝蛋白质,总计797个胎肝蛋白质,其中确定的线粒体蛋白质接近20%,在国内外人胎肝线粒体蛋白质组表达谱构建中首次分离鉴如此之多的蛋白质,表明实验设计和技术路线是可行的;
二、实验中发现蛋白质的疏水性、pI值、样品缓冲液以及数据库的选择等都会对最终的检出结果有影响,因此在进行实验及结果处理时值得注意。
反相色谱-SDS-PAGE-串联质谱分析技术
样本制备方法:
称取成人肝脏组织样品0.1g,加入提取液(8.0M脲,2.0%SDS)2.0mL,超声(超声0.5s,停2s,60次)溶解后,离心分离(15000g,40min),取上清备用。
反相色谱分离人肝脏蛋白质混合物色谱图
A,第1次制备;
B,第32次制备
150mm×
4.6mmi.d.,C8,5m,30nm;
流速:
0.75mL/min;
检测波长:
214nm;
非线性溶剂梯度:
100%A(5%aqueousacetonitrileplus0.1%TFA)~10%B(95%aqueousacetonitrileplus0.1%TFA),10min;
10%B~35%B,10min;
35%B~75%B,40min;
75%B~100%B,8min;
100%B,5min100%B~100%A,3min;
平衡32min后进行下一次分离。
馏分90中第24条蛋白质带的总离子流色谱图(A)、相应的
一级质谱图(B)和m/z:
809离子的串联质谱图(C)
实验结果和讨论
通过整体蛋白质混合物的两维分离、胶上酶切和提取,得到474个多肽混合物。
按上述方法分析,共鉴定出9696条肽段,去冗余后得到2552条肽段,归结于402种蛋白质和240个蛋白质簇。
不同蛋白质随pI的分布
不同蛋白质随分子量的分布
不同蛋白质随疏水性参数的分布
通过RPLC-SDS-PAGE与纳升毛细管液相色谱-串联质谱联用技术对人肝脏蛋白质组表达谱的构建及其理化性质的统计分析,表明该技术路线兼顾了反相色谱分离度高和SDS-PAGE兼容性号的优点,可用于复杂组织或细胞中蛋白质组表达谱的构建或比较蛋白质组的研究。
全程自动化的固相金属亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱
磷酸化蛋白质分析技术
IMAC毛细管亲和色谱柱的制备—
两通固定滤膜筛板制作法及柱装填技术
1,两通阀2,毛细管色谱柱
3,过滤膜4,连接毛细管
5,加样枪6,刃环和空心螺母
7,匀浆管8,高压恒流泵
9,旋涡混合器
在100μm内径的石英毛细管中成功装填进了20μm粒径的亲和色谱填料
自动化IMAC-RPHPLC-MSMS分析平台
IMAC-RPHPLC-MSMS分析平台的测试和优化
IMAC柱对磷酸肽吸附的选择性
洗脱液类型对质谱结果的影响
Washbuffer对亲和选择性的影响
甲酯化修饰对亲和选择性的影响
IMAC柱对磷酸肽吸附的选择性
样品:
磷酸肽+磷酸酶水解去磷酸化肽段混合物
✓
使用磷酸钠(钾)溶液洗脱容易生成碱金属加和峰,使质谱图变得更复杂而且使肽段的信号分散,离子信号强度减弱
✓用磷酸氨盐溶液洗脱没有发现碱金属加和峰
洗脱液类型对质谱结果的影响
Washbuffer对亲和选择性的影响
含酸性氨基酸残基的肽段,侧链上的羧基也易与金属离子发生静电作用导致非特异性吸附
✓使用高盐浓度的酸性溶液可减少部分非特异性吸附
甲酯化修饰对亲和选择性的影响
对肽段末端及酸性氨基酸残基的羧基进行甲酯化修饰,会提高IMAC亲和柱对磷酸肽的亲和选择性
✓甲酯化反应不能完全进行,一个肽段上修饰不同数目甲基的几种形式会同时存在,分散了肽段的信号强度
✓产生立体异构体,使肽段在反相色谱中的保留也被分裂
✓甲酯化反应过程会造成样本的损失
✓使用要慎重,与常规方法互补
IMAC-RPHPLC-MSMS自动化分析平台测试结论
⏹整个技术平台的工作都可以通过仪器参数设置和样品表的编排来自动完成,程序控制,全程自动化,便于改变条件优化实验参数
⏹用标准肽的分析表明该体系对磷酸肽具有一定的选择性亲和富集能力,采用适当的清洗和洗脱溶液会提高亲和提取效率
⏹对肽段的酸性氨基酸残基的羧基进行甲酯化修饰,会提高IMAC亲和柱对磷酸肽的亲和选择性,但可能会造成信号分散和样本损失
建立了磁性纳米材料制备、选择性富集结合生物质谱分析磷酸肽新方法
方法特点:
●修饰过程简单、快速;
●无样品损失、高灵敏度;
●可处理飞摩尔-皮摩尔的样品;
●高通量。
应用:
磁性纳米材料制备、选择性富集结合生物质谱分析磷酸肽新方法已经用于鼠肝质膜的磷酸化蛋白质组分析。
相关工作已经在RCM和JPR上发表。
生物素酰肼标记-亲和素纯化富集方法的建立及在肝癌细胞膜糖蛋白研究中的应用
生物素法富集膜糖蛋白流程图
三个富集技术路线
①:
肽段水平富集;
②:
蛋白水平富集;
③:
两次富集(蛋白/肽段)
(3000cutoff:
3000Da超滤)
质谱图显示糖肽富集效果
富集前
富集后
三条富集技术路线结果
HepG2膜糖蛋白分析
蛋白水平富集酶切后,其肽段体系复杂程度和动态范围都大大增加,低丰度糖肽的检出几率会大大减小,因此,采用肽段水平富集方法。
(1)从蛋白水平富集,对HepG2细胞膜糖蛋白进行研究,共
鉴定到171个跨膜蛋白,SP库确认其中44个蛋白是糖
蛋白。
(2)从肽段水平富集,对HepG2细胞膜糖蛋白进行研究,鉴
定到70个非冗余糖肽,73个糖基化位点,其中3个肽段
各有2个糖基化位点。
糖肽对应于48个非冗余糖蛋白。
(3)合并蛋白和肽段富集鉴定结果,共83个HepG2膜糖蛋
白,73个糖基化位点,构建了HepG2肝癌细胞膜糖蛋白
数据。
(4)这些膜糖蛋白主要是一些免疫相关蛋白、转运蛋白、癌
症转移相关的细胞粘附因子以及膜受体等,参与了炎症
反应、细胞粘附、信号转导等多种重要生理过程。
3、蛋白质定量新技术新方法
蛋白质定量新技术新方法
蛋白质(组)定量的意义
(1)作为生命执行体的蛋白质,通过其定位、修饰和相互作用
发挥功能作用时都与其量的多少相关;
(2)蛋白质标志物的发现与相对定量方法相关;
(3)蛋白质标志物的临床应用也涉及到绝对定量方法;
(4)蛋白质组学(表达谱、修饰谱和相互作用)已经向动态蛋
白质组学发展,必然要求定量方法的支持。
拟解决的关键科学问题
(1)规模化蛋白质组绝对定量方法的建立;
方法的灵
敏度、重现性和动态范围优化。
(2)不同状态中低丰度蛋白质组的相对定量;
相对定
量方法动态范围、覆盖率和准确度。
(3)非标记定量模式与科学合理的新算法。
蛋白质定量内容:
蛋白质的定量包括绝对定量和相对定量,其蛋白质定量的研究对象包括:
(1)纯化后蛋白质的绝对定量;
(2)总蛋白质的绝对定量;
(3)复杂生物体系中一种或数种蛋白质的绝对和相对定量;
(4)复杂生物体系中大多数及全部蛋白质的绝对和相对定量。
蛋白质定量的常用方法
(1)基于光吸收或发射性质的光谱定量方法,如紫外及
可见光吸收和荧光定量方法;
(2)基于色谱或毛细管电泳与紫外光吸收定量方法;
(3)基于同位素稀释的质谱定量方法;
(4)基于凝胶电泳和光密度度的定量方法;
(5)基于抗体和荧光标记的定量方法;
(6)蛋白质相对定量方法。
目前国内外蛋白质定量研究现状
绝对定量方法
(1)光谱定量
280nm光吸收蛋白质定量法;
LOWRY蛋白质定量法或改进LOWRY蛋白质定量法;
BCA蛋白质定量法法;
BRADFORD蛋白质定量法;
Fluoraldehyde蛋白质定量法;
ELISA蛋白质定量法等。
(2)稳定同位素稀释法(内标法)用于质谱法进行蛋白质的
绝对定量;
(3)多反应检测蛋白质或肽定量法;
(4)规模化蛋白质的半绝对定量方法(基于统计方法)。
采用蛋白鉴定的分值与相应蛋白质的丰度的关系
进行半定量的方法;
蛋白质丰度指数(PAIs,proteinabundance
indices)与相应蛋白质丰度的关系进行半定量的方法;
指数蛋白质丰度指数(emPAIs,exponentially
modifiedproteinabundanceindices)与相应蛋白质
丰度的关系进行半定量的方法。
相对定量方法
(1)在蛋白质水平上,基于两维分离或与荧光标记结合的比
较方法,如2DE、PF-2D和DIGE;
(2)基于质谱技术的不同状态的同一种肽段提取的离子流色
谱图比较的方法(非标记定量);
(3)稳定同位素标记方法,包括化学标记和代谢标记,如18O
水标记、同位素酸酐试剂标记、同位素醛试剂标记、
cICAT、iTRAQ和SILAC等;
(4)双功能试剂结合金属标记的方法;
(5)同系物标记-SDS-PAGE或2DE结合质谱的蛋白质相对定量
方法。
iTRQA试剂结合生物质谱用于蛋白质组的相对定量方法
基本原理
(1)试剂的反应基团(PRG)特异地与肽段的N-端氨基和Lys的ε-氨基结合;
(2)平衡基团与不同质量的报告基团在一级质谱图上显示为一个峰,为肽段质量数加上144Da;
(3)在二级质谱图上,报告基团特异性地断裂,其比值即为两样本中蛋白的相对定量。
考察因素
(1)标记完全程度;
(2)动态范围(30倍,相对误差<
30%);
(3)灵敏度;
(4)色谱行为,同位素效应不显著;
(5)质谱行为,主要为y离子序列。
通过实验的考察和优化,建立了iTRAQ标记试剂结合MALDITOF-TOFMS的蛋白组相对定量方法。
脂肪肝大鼠肝组织全蛋白
注意事项:
(1)不能引入带有伯氨基的试剂(还原剂:
TCEP;
半胱氨酸残基封闭剂:
MMTS(硫甲磺酸S-甲酯));
(2)标记过程中水相比例:
小于30%;
(3)体系不能肽复杂,即对于复杂生物样本需要预分离步骤。
SILAC标记结合生物质谱定量蛋白质组方法的建立和应用
细胞培养的稳定同位素标记技术(SILAC)的基本原理:
分别用含有天然同位素和稳定同位素标记的必须氨基酸取代细胞培养基中的相应氨基酸,通过5-6代的细胞传代,稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞合成的蛋白质中,从而实现基于质谱的蛋白质组定量分析。
简单、直接、高效、准确。
寻找阳性率高、特异性强的肝癌标志物的研究课题。
通过对甲胎蛋白阳性肝癌细胞系和甲胎蛋白阴性肝癌细胞系差异比较研究,发现了一批甲胎蛋白阴性的差异蛋白,其中蛋白分子TGM2在甲胎蛋白阳性和阴性肝癌细胞中有显著差异,有可能成为肝癌诊断的标志物。
DTPA螯合稀土金属标签蛋白质组定量
原理和方法流程图
实验方法考察
结论
建立了一种以稀土元素为质量标签的自主创新的定量蛋白质组新方法,该方法具有以下的优点:
⏹化学试剂价廉易得
⏹化学标记反应条件温和,为普遍标记,无肽段歧视
⏹肽段的二级图谱为连续的y系列离子,可提高蛋白鉴定的可信度
⏹有8种稀土元素是单同位元素,有28种自由组合,可大大扩展质量标签的选择范围
基于酸酐双功能试剂修饰辅助、结合
稳定同位素18O标记的蛋白质组定量新方法
方法特
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- 生物 蛋白质 研究 应用