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21微生物的染色及观察
2.1微生物的染色及观察
—、染色的基本原理
•借助细胞对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等物理因素和细胞与染料发生化学反应而进行的
•细菌等电点较低,pH值人约在2・5之间,故在中性、碱件或弱酸性溶液中,菌体蛋门质电离肩带阴电荷:
而碱性染料电离时染料离子带阳电。
因此,带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。
所以,在细菌学上常用碱性染料进行染色。
二、染料的种类和选择
染料分为天然染料和人工染料两种。
人然染料冇胭脂虫红、地衣素、石戏和苏木索等。
目刑主婆采用人工染料,幺从煤焦油中捉取获得,是苯的衍生物.多数染料为难溶于水.而易溶于冇机溶剂中。
为使它们易溶于水.通常制成盐类。
染料可按其电离后染料离了•所帶电荷的件质.分为酸性染料、碱性染料、中性(复合)染料和单纯染料四大类.
1、酸性染料
这类染料电离頤染料离f带负电,如伊红、刚果红、藻红、苯胺黑、苦味和酸性复红等,町与碱性物质纳合成盐。
X培养基肉椭炎分解产酸便dHTi下降时,细苗所带的正电荷增加,这时选抒酸性染料,易被染色。
2、碱性染料
这类染料电离厉染料离子带正电,可与酸件物质结合成盐.微牛物实验牢一般常用的緘件染村仃美兰、甲基紫、结晶紫、祓性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等,在一般的常况F.细苗易被碱性染料染色。
3、中性(复合)染料
酸性染料与碱性染料的结合物叫做屮性(复合)染料,如瑞脱氏(Wright)染料和基姆萨氏(Gimsa)染料等,后者常用于细胞核的染色。
4、单纯染料
这类染料的化学亲和力低,不能和被染的物质牛成盐,其染色能力视其是否溶丁•被染物而定,因为它们人多数都属于偶氮化合物,不溶于水,但溶丁•脂肪溶剂屮,如紫丹类(Sudanb)的染料。
三、染色
微生物染色分为单染法和复染法两种。
前咅用•种染料使微牛物染色,但不能鑒别微生物。
以染法是用两种或两种以匕染料,有吟别微生物作用。
常用复染浓何革兰氏染色沐和抗酸性染色法以及特殊染色法(如芽胞、鞭毛、细胞核等)。
仅品微生物检验中常用的兄单染色法和革兰氏染色法。
1、单染色法
用一种染色剂对涂片进行染色,简使易行,适于进行微生物的形态观察。
在-•般怙况下,细菌菌体多带负电荷,易于和带正电荷的碱性染料结合而彼染色。
因此,常用碱件染料进行单染色,如美兰、孔雀绿、碱性复红、结晶紫和中性红等。
注:
若便用酸性染料,多用刚果虹、伊红、藻红和酸性品红等・使用酸性染料时,必须降低染液的PH值.便其呈现強酸件(低于细瀚*1体等电点八让繭体带匸电荷.才易r彼酸性染料染色.
单染色法过程:
(1)制片
在干净的载玻片上滴上一小滴蒸啊水,用接种环进行无菌操作,挑収培养物少许,置水滴小,9水混介做成总液并涂成直径约1丿里米的洒层,为避免因菌数过多聚成集团,不利观察个体形态,町在载玻片•侧再加滴水.从已涂布的闔液中再取-环于此水滴中进行稀释.涂布成薄层,若材料为液体培养物或固体培养物中洗卜制备的菌液,则直接涂布丁谶玻片上即可。
(2)自然十燥水或窗液
涂片最好在宰温卜•使其□然卡燥,为了干得快些,町将标本面向上,乎持坡玻片诩小心在酒粘灯高处微微加热,便水分蒸发,但切勿紧雒火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。
(3)固定
•固迟的目的:
1)杀死微牛物,固泄细胞结构。
2)保证菌体fil勺粘附在载玻片上,防止标本被水冲洗織
3)改变染料对细胞的通透性,因为死的原生质比活的易r染色。
•方法:
利用■温.手执伐玻片的•端.标本向出在酒稍灯火焰外圧尽快的來冋通过3・4次,共约2・3秒钟,并不时以载:
吸片笛而加热触及皮肤.不觉过烫为宜(不超过60C),放直待冷后进行染色。
•注:
在研究微牛物细胞结构时应采用化学固定法。
化学固定法常用的固定剂:
酒粘(95%)、酒帖和醴备半的混合物、丙刖、1-2%饿酸等。
饿酸能很快固定细胞但不改变其结构,故较常用。
•饿酸固运细胞的技术:
在菇养皿中放一玻頊.在玻璃上放置玻璃毛细管,在毛细管中注入少量的1-2%饿酸溶液,同时A」皮璃上再放*湿标本涂片的载玻片.然后把培养血盖匕经过1・2分仲后•把标本从培养皿中取出干燥。
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(4)染色:
标本固定后,滴加染色液,约1・3分钟。
;i:
整个涂片(或有标本的部分)2浸在染稻脚%
单染色过稈:
涂片固定染水洗干燥
染色液
染色结果
特点
石碳酸复红
繭体呈红色
着色快,时间短
美兰
菌体呈兰色
着色慢,时间长,效果清晰
草酸彼
菌体呈紫色
染色迅速,着色深
2、复染色法(革兰氏染色法)
(1)革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上自很多差别,染色反应不一样.现在-般i人为革兰氏阳性苗休内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物,它与碘和结晶紫的复合物结合很牢,不易脱色,阴性菌复合物结合程度底,吸附染料差,易脱色,这足染色反应的主要依据。
(2)阳件菌菌体等电点较阴性菌为低.在相同PH条件下进行染色,阳性菌吸附碱性染料很多,因此不易脱去,阴性菌则相反。
所以染色时的条件要严格控制。
例如:
在强碱的条件下进行染色,两类菌吸附碱性染料都多,都町呈正反应:
PH很低时,则町都呈负反应。
(3)两类胡的细胞權等对结品紫-碘复合物的通透件也不一致,阳牲菌透性小,故不易被脱色,阴性歯透性人,易脱色。
所以脱色时间,脱色方法也应严格控制。
过程:
V——燥一定——染(见前)
舰翔歸敝嘛诰帮綸脱羁瞬貓y册眈
(3)复染
脱色后再用•种染色剂进行染色.勺不披说色部位形成鲜明的对照,便「•观察・隹氏染色在洒精脱色后用番红垠后进彳」••染色,就足复染。
(5)丁燥
若色标本洗净后.将标本晾干.或用吸水纸把多余的水吸去,然后晾干或微热烘干.用吸水纸时.切勿将閑体擦掉。
革兰氏染色法
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