PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对肝癌HepG2细胞凋亡的阻碍Word格式文档下载.docx
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RNAinterference;
eukaryoticexpressionvector
【摘要】目的:
构建针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体,体外观看其对肝癌HepG2细胞凋亡的阻碍.方式:
设计针对PEG10基因的3个siRNA靶序列,构建真核表达载体siRNA1,siRNA2和siRNA3,脂质体别离转染HepG2细胞后实时定量PCR,检测其对HepG2细胞PEG10基因表达的阻碍,MTT法、流式细胞仪和激光共聚焦检测转染siRNA后的HepG2细胞的生长活性及凋亡.结果:
成功构建了针对PEG10基因的3个特异性siRNA表达载体.它们不同程度地抑制了HepG2细胞PEG10基因的表达,以siRNA2抑制效率最高,可达%.HepG2细胞的生长也明显受到抑制(P&
),大量HepG2细胞凋亡,siRNA2凋亡率最高,为%.结论:
靶向PEG10基因的siRNA表达载体可抑制肝癌HepG2细胞的生长,诱导细胞凋亡,该作用与降低PEG10基因的表达有关.
【关键词】PEG10基因;
0引言
PEG10(paternallyexpressedgene10)是在肝细胞癌组织中发觉的一个新的遗传印记基因[1],属于父方表达的印记基因[2-3],以往的研究[4-6]显示此类印记基因的过表达可致使细胞的恶性转化.本研究室的前期研究[7]发觉,PEG10基因在肝癌组织中异样表达,且特异性比甲胎蛋白(AFP)更高.故PEG10基因的高表达与肝癌发生关系紧密,干扰其表达可能成为肝癌医治的新手腕.咱们拟采纳RNAi技术,构建针对PEG10的siRNA真核表达载体,转染肝癌细胞HepG2,观看其抑制PEG10基因的表达及其对肝癌细胞生长和凋亡的阻碍,为其应用于肝癌医治奠定基础.
1材料和方式
材料人肝癌细胞株HepG2和大肠杆菌DH5α由本实验室保留.质粒psiRNAhH1neo(美国InvivoGen公司);
限制性内切酶BbsⅠ和T4DNA连接酶(美国NEB公司);
MMLV逆转录酶、RNA酶抑制剂和Taq聚合酶(美国Promega公司);
optiMEM和转染试剂Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司);
高纯质粒提取试剂盒(杭州Vgene公司);
DNA凝胶回收试剂盒(上海华舜生物工程公司);
人AnnexinVFITC试剂盒(深圳晶美生物工程).FACSort流式细胞仪(BactonDickinson公司);
FV500共聚焦显微镜(Olympus公司);
MultiskanMk3酶标仪(ThermoLabsystems公司).
方式
靶序列的设计利用GenBank检索PEG10mRNA(录入号:
AB049834)全长序列,遵循siRNA的设计原那么,通过Invivogen公司提供的siRNAWizard在线软件挑选出3条21nt的序列.即siRNA1:
5′GCAGAAGCTCACAGAGGAGAA3′;
siRNA2:
5′GCACAACTACCCAGCTTTCAT3′;
siRNA3:
5′GTTCGATGGCAACCCAGACAT3′.同时设计出非特异性靶序列:
5′GATTCCATTAGACATCACACA3′.两头引入BbsⅠ酶切位点,由上海生工生物工程公司合成.
靶向PEG10的siRNA真核表达载体的构建将化学合成的正义链和反义链退火,形成shRNA表达模板,与经BbsⅠ酶切后线性化的psiRNAhH1neo载体连接,将连接产物转化到用氯化钙法制备的感受态DH5α中,搜集转化后菌落,涂布在含卡那霉素的LB培育板上,37℃倒置培育12~16h,蓝白斑挑选,挑选白色阳性单克隆.37℃摇菌12~14h,提取质粒,由上海英骏生物技术公司进行测序鉴定.
图1靶向PEG10的siRNA真核表达载体的构建(略)
细胞转染转染前1日取对数生长期的HepG2细胞,以3×
105/孔接种于6孔板,细胞融合达40%~60%时转染.转染方式依照脂质体Lipofectamine2000说明书进行.依照是不是进行质粒转染和转染质粒的不同分为6组.即空白对照组(不进行转染的同期培育的HepG2细胞),空质粒组(转染psiRNAhH1neo空质粒),siRNA1组、siRNA2组和siRNA3组(别离转染3个重组质粒siRNA1,siRNA2和siRNA3),非特异性siRNA组(转染重组的非特异性siRNA质粒).
1.2.4实时定量PCR检测PEG10表达将重组质粒和空质粒别离转染HepG2细胞并培育48h后用Trizol试剂提取各组1×
107细胞总RNA,逆转录成cDNA第1链,然后以cDNA为模板,别离对PEG10基因及βactin进行RealtimePCR反映,反映体系为:
cDNA1μL,20μmol/L的上下游引物各μL,dNTP混合液3μL,TaqDNA聚合酶3U,MgCl2溶液3μL,10×
PCR缓冲液μL,SYBRGreenIμL,去离子水补至25μL.PCR扩增条件94℃变性5min,35个PCR循环(94℃20s;
58℃20s;
72℃20s),72℃延伸5min,75℃时检测荧光信号,绘制标准曲线.引物序列:
PEG10,上游:
5′CCAAGTCGCTGTCTGCTCTGA3′,下游:
5′GCGTAGTGACCTCCTGTTCCA3′;
βactin,上游:
5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′,下游:
5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′.依照绘制的标准曲线取得PEG10基因及βactin表达的相对浓度,以PEG10基因与βactin相对浓度的比值来反映PEG10表达量.每一个样品做2个平行管,实验重复3次.利用RotorGene分析软件对实验结果进行分析.PEG10表达抑制率(%)=(1-转染组PEG10表达量/对照组PEG10表达量)×
100%.
法检测细胞增殖取对数生长期HepG2细胞,转染前1日以1×
104/孔接种96孔板,将重组质粒和空质粒别离转染细胞中,继续培育24,48,72,96,120h后别离加入5g/LMTT20μL,37℃避光孵育4h,弃去培育基,加入100μLDMSO,避光30min,待其完全溶解后,用酶标仪测定A490nm值.以空质粒转染组作为阴性对照,实验重复3次,细胞生长抑制率(%)=(1-转染组吸光度值/对照组吸光度值)×
流式细胞仪检测凋亡率搜集转染48h的HepG2细胞,PBS洗涤并重悬细胞,750mL/L冰乙醇固定1h,PBS冲洗后加入终浓度为50mg/L的碘化吡啶(PI)和终浓度为100mg/L的RNaseA,避光30min后,上机检测.
共聚焦显微镜检测将PBS洗涤转染48h的HepG2细胞,加入250μL结合缓冲液,再加入5μLAnnexinV/FITC,混匀后于室温避光孵育10~15min,加入20mg/L的PI10μL,室温避光孵育5~10min,在共聚焦显微镜下观看并拍照.
统计学分析:
采纳SPSS统计软件包进行统计分析,计量资料以x±
s表示,组间比较采纳单因素方差分析,P&
表示不同有统计学意义.
2结果 2.1psiRNAhH1neo重组质粒测序鉴定取白色克隆菌液送上海英骏生物公司测序鉴定,结果显示插入的siRNA1,siRNA2和siRNA3片段已正确连入psiRNAhH1neo载体,重组质粒构建成功.
2.2siRNA表达载体对PEG10基因mRNA的抑制作用实时定量PCR结果显示,未转染组、空质粒组和非特异性siRNA组的PEG10基因高表达,siRNA1,siRNA2和siRNA3组的PEG10基因表达明显受到抑制(P&
).siRNA2组PEG10的表达抑制最明显(图2).
aP&
vs空白对照组.
图2实时定量PCR检测PEG10基因表达水平(略)
2.3siRNA对HepG2细胞增殖的抑制siRNA1,siRNA2和siRNA3组对HepG2细胞生长均有显著的抑制作用(P&
).转染后96h,细胞生长的抑制作用达到平台期,并持续到转染后120h(图3).siRNA2组作用最明显.
vs非特异性siRNA组.
图3siRNA对HepG2细胞生长的阻碍(略)
2.4siRNA诱导HepG2细胞凋亡转染后48h,siRNA2组的细胞凋亡率为%,明显高于其他组(图4).
A:
空白对照组;
B:
空质粒组;
C:
非特异性siRNA组;
D:
siRNA1组;
E:
siRNA2组;
F:
siRNA3组;
M1:
凋亡细胞百分率.
图4转染后48h流式细胞仪检测细胞凋亡率(略)
2.5凋亡细胞形态学激光共聚焦显微镜显示,凋亡细胞的细胞膜被AnnexinⅤFITC标记,镜下呈绿色荧光,初期凋亡细胞的细胞膜不被PI着色;
晚期凋亡细胞或坏死细胞同时被AnnexinⅤFITC和PI标记;
活细胞两种荧光均无标记(图5).
绿色荧光检测;
B:
红色荧光检测;
C:
双荧光检测.
图5siRNA2对HepG2细胞凋亡的阻碍(略)
3讨论
RNAi技术是最近几年来涌现出的一种有效的基因沉默手腕,能高效、特异地抑制细胞内基因地表达,其发挥作用的关键是siRNA靶位点的选择和制备.咱们选择表达载体法,与目前经常使用的其他制备siRNA的方式如化学合成法、体外转录法、“鸡尾酒法”和表达框法等相较,既经济高效又能够进行长期稳固的研究.咱们采纳的psiRNAhH1neo载体,其H1启动子是RNA聚合酶Ⅲ启动子,它能够高效特异的转录出smallhairpinRNA(shRNA,47nt),进而在体内被切割成siRNA(21nt),大大提高了RNAi的效率和特异性.咱们设计合成的3个特异性siRNA真核表达载体,转染肝癌HepG2细胞后,实时定量PCR结果证明PEG10的表达均显著下调,说明选择的靶位点是有效的,构建的siRNA真核表达载体能够成功地抑制肝癌细胞中PEG10的表达.其中siRNA2组的成效最为突出,提示siRNA2可能是靶向PEG10的最有效的靶序列之一,能够用于咱们的后续实验.
肿瘤的发生进展与基因的异样表达关系紧密,遗传印记基因的改变对肿瘤发生的阻碍已引发人们的关注.目前已有研究提示肝癌的发生存在着遗传印记基因的异样表达[8].Tsou等[9]发觉遗传印记基因PEG10基因在肝癌细胞中高表达,而在正常人的肝、胰、结肠、胃、淋巴细胞和表皮细胞中无表达.咱们运用RNAi技术,靶向干扰PEG10基因的表达.结果显示,转染靶向PEG10的特异性siRNA真核表达载体能明显抑制肝癌细胞的生长,诱导肝癌细胞凋亡.故本研究也证明了PEG10基因的过表达与肝癌的发生紧密相关,阻断PEG10基因的表达可望成为医治肝癌的有效手腕.
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