色谱分析教案Word文档下载推荐.docx
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1.创立:
1906年,俄国植物学家Tsweet发现色谱分离现象(植物色素分离见图示)。
在碳酸钙上出现了具有不同颜色的色带,并将由此色带组成的谱图命名为“色谱图”。
2.现状:
一种重要的分离、分析技术,分离混合物各组分并加以分析
固定相——除了固体,还可以是液体
流动相——液体或气体
色谱柱——各种材质和尺寸
被分离组分——不再仅局限于有色物质教学要求、方法及时间分配
三、色谱法的特点
1优点:
“三高”、“一快”、“一广”
2缺点:
四、色谱法的分类
1.按两相分子的聚集状态分类
2.按固定相的固定方式分类
3按分离机制分类
色谱法简单分类:
五、色谱法的发展
1、历史
2、在我国的发展
3、展望
第二节色谱过程和基本术语
一、色谱过程、分离原理及特点
㈠色谱过程
㈡色谱分离原理
㈢色谱分离特点
1.不同组分通过色谱柱时的迁移速度不等→提供了分离的可能性
2.各组分沿柱子扩散分布→峰宽↑→不利于不同组分分离。
二、色谱流出曲线和有关概念
㈠色谱流出曲线和色谱峰
1.流出曲线(色谱图):
电信号强度随时间变化曲线
2.基线:
无样品时的电信号
(二)保留值:
色谱定性参数
1.保留时间tR:
2.死时间tm(或t0):
3.调整保留时间tR'
:
4.保留体积VR:
5.死体积Vm(或V0):
6.调整保留体积VR'
7.相对保留值ris(选择性系数α):
调整保留值之比
(三)色谱峰高和峰面积
1.峰高h:
2.峰面积A:
(四)色谱区域宽度:
1.标准差σ:
2.半峰宽W1/2:
3.峰宽W:
4.
三、分配系数与色谱分离
㈠分配系数和容量因子:
相平衡参数
1.分配系数K(平衡常数):
2..容量因子k(容量比,分配比):
㈡分配系数和容量因子与保留时间的关系
第三节色谱基本原理
一、塔板理论
(一)、塔板理论的提出
(二)、塔板理论的假设
1、将塔分成若干小段,每段相当一块塔板,用n表示,在每块板上组分瞬间达到气液平衡。
2、所有组分开始时都处在柱中第零号塔板上。
3、流动相以脉冲形式进入,每个脉冲相当于一个塔板体积。
4、组分在所有板上线性吸附或分配,分配系数是一常数
(三)、理论板数的计算
n=5.54(
)2n=16(
)2
neff=5.54(
)2neff=16(
)2
理论与有效的关系:
neff=(
)2n
(四)、塔板理论的评价
二、速率理论
(一)、范氏方程的提出
(二)、速率理论的模型
组分分子在柱内的行为大致是:
组分分子由载气携带向前走,而固定液分子将其回拉,由于载气分子的连续流动,逐渐释放,由于各组分与固定相分子作用力不同,在柱中滞留时间不同,运行速度不同。
组分分子还受到载体阻力,浓差扩散、传质阻力等影响。
速率理论方程H=A+B/u+Cu
(1)涡流扩散项H1=
=2λdP
(2)分子扩散项H=
=2rDg/u
(3)流动相传质阻力H3=
=0.01
u
(4)固定相传质阻力H4=
=
(三)、范氏方程讨论
1、颗粒大小与粒度范围
2、u对H的影响
3、k’、Tc对H的影响
三、色谱分离度
(一)、理论板数与有效板数的关系
(二)、相对保留值与T的关系
(三)、分离方程
Rs=
R具体情况,具体分析。
第二章气相色谱分析法(8学时)
通过本章的学习,掌握气相色谱法的基本原理,气相色谱的速率理论方程,掌握气相色谱的工作系统,了解色谱柱柱效的评价方法,掌握色谱条件的选择方法和色谱新技术的进展
1.色谱法定性;
2.色谱法定量
1.色谱柱的填充与制备2.组分与固定液作用力关系
填充柱气相色谱系统
色谱柱的填充与制备
色谱定性和定量分析
组分与固定液作用力关系
内标法定量
第一节填充柱气相色谱系统1学时
第二节气固色谱固定相1学时
第三节 气液色谱固定相2学时
第四节色谱定性分析2学时
第五节色谱定量分析2学时
讲解气相色谱分离模式时注意两种模式分离原理的比较
讲解气相色谱分离模式时与第三章液相色谱分泌模式比较和呼应。
第一节填充柱气相色谱系统
一、系统流程图
二、分析单元
(一)气路系统
1、作用
2、构成
3、常见气路系统
4、载气流速的测量与校正
(1)测量方法:
(2)如果柱前压、柱前流速
出口Fc=
(二)进样系统
(三)色谱柱
1形状
2规格:
3材质
(四)检测器
1作用:
将色谱柱分离后的各组分的浓度信号转变成电信号。
2种类:
(1)热导池检测器:
(2)氢火焰离子化检测器:
(3)电子捕获检测器:
(4)火焰光度检测器:
(5)质谱检测器:
(五)记录仪
2注意:
。
3要求:
(六)温度控制系统:
第二节气固色谱固定相
一、气固色谱的优点和缺点
二、常用固定相
1、炭:
活性炭、碳分子筛
2、氧化铝
3、硅胶SiO2xH2O
4、分子筛
5、GDX高分子多孔微球
第三节气液色谱固定相
一、液色谱载体
固定相=载体+固定液
(一)对载体的要求
(二)载体的分类
1硅藻土载体:
由天然硅藻土锻烧而成,主要成分无机盐。
根据制造工艺和助剂不同,分为红色与白色硅藻土两类。
2非硅藻土载体
(三)载体的表面处理
1、处理的原因
2、处理的方法
(1)酸洗:
(2)碱洗:
(3)硅烷化:
(四)载体的选择
二、气液色谱固定液
(一)对固定液的要求
(二)组分与固定液分子间的作用力
组分之所以能够分离,是由于它们在柱中k’不同,在固定液中的溶解力不同,组分与固定液分子间的作用力不同,
1、定向力:
2、诱导力:
3、色散力:
4、氢键作用力:
(三)固定液的分类
1、按极性分类
(1)按相对极性分类
A规定
B计算方法
q=lg[
]
Px=100—(1-
)
(2)相特征常数法--Rohrschneider(罗氏常数)
1966年,Rohrschneider提出了相特征常数法,常称为罗氏常数。
选用五种不同性质的组分来表征一种固定液的特性,每种组分与固定液间作用力类型不同;
用五种代表物在多种固定液柱上的保留指数,与在非极性固定液柱上保留指数之差,来代表固定液的相对极性,使极性的表达更加完善。
P=ΔI=IP-IS
2、按固定液的化学类型分类
烃类
聚硅氧烷类
醇、醚类
酯类
有机皂土、液晶、手性固定相
(四)固定液的选择
1、已知样品
(1)按相似性原则
(2)按主要差别ΔTb或极性差。
(3)按麦氏常数选择固定液
(4)特殊样品选特殊固定液
(5)混合固定液
2、未知样品
(1)毛细管柱初分离
(2)几种最佳固定液
三、气液色谱填充柱的制备
1、根据样品选择固定液、载体。
2、根据固定液选择溶剂。
3、根据配比和所需固定相的量,计算所需固定液的量、载体的量。
4、涂渍
5、柱的填充
(1)柱的清洗:
(2)柱的填充:
(3)柱的老化:
第四节色谱定性分析
一、一般定性
1、已知物直接对照法定性
(1)利用保留时间和保留体积定性
(2)利用相对保留值定性
(3)用比保留体积定性
(4)已知物峰高增加法定性
(5)双柱定性
2、保留值随分子结构或性质变化规律定性
(1)碳数规律
(2)沸点规律
(3)LC中的保留值规则
二、保留指数定性(Kovats)
1、保留指数的计算
I=100[Z+
n]
2、X在Z、Z+1之间
3、测量方法
二、联用方法定性
四、化学方法定性
第五节色谱定量分析
色谱定量的依据是:
组分的重量或在载气中的浓度与检
测器的响应信号成正比Wi=fiAi
一、峰面积的测量
1、对称峰面积
2、不对称峰面积
3、峰高乘保留时间
4、自动积分仪法
5、峰高在定量分析中的作用
一定的样品,
二、定量校正因子
意义
为什么提出?
1、校正因子的表达式
(1)质量校正因子fm
(2)摩尔校正因子
(3)体积校正因子
2、相对响应值
3、峰高定量校正因子
三、百分含量的计算
1、归一化法
Xi%=
使用条件
特点
2、内标法
100
特点
3、外标法(校正曲线法)
特点
4、叠加法(内加法)
xi%=
100=
5、转化定量法
气谱中使用的一种定量方法,将被测组分在进入检测器前利用催化剂转化为同一组分,一般转化为CO2或CH4,使定量工作简化。
第三章高效液相色谱分析法(8学时)
通过本章的学习,了解高效液相色谱法的特点及适用范围;
掌握各种分离原理及色谱条件的优化和选择原则。
1.HPLC的分离模式的分离机制
1.HPLC流动相的要求2.影响HPLC分离的因素
1.HPLC的用途及特点2.HPLC的分类和发展
HPLC的分离模式的分离机制;
HPLC流动相的要求
基本类型的分离机制;
流动相是如何参与分离机制
第一节概述1学时
第二节液谱过程的理论1学时
第三节高效液相色谱柱1学时
第四节液谱流动相及其选择性1学时
第五节分离模式及原理4学时
讲解流动相和固定相时与第二章气相色谱的内容呼应、比较。
讲解流动相是如何参与分离机制时与第二章气相色谱的内容呼应、比较。
第一节概述
以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法,根据固定相形式不同,可分为纸色谱、薄层色谱和柱色谱,柱液相色谱。
根据分离原理又可分为:
吸附色谱、分配色谱、离子色谱、排阻色谱等,目前,液相色谱主要指柱液相色谱。
一、发展简况
几十年来,色谱学科不论在色谱工作者人数、发表著作的数量、所分离样品的种类和复杂性,以及分离速度等方面都有很大的发展,而且这期间有几次飞跃:
第一次,四十年代分配色谱纸色谱;
第二次,六十年代早期凝胶、排阻色谱。
预计还会有更大发展,现代液相色谱技术使柱色谱不论在分离效率、分析速度还是在操作自动化方面都发展到一个崭新阶段。
二、HPLC的特点
1、可分离分析高极性、高分子量和离子型的各种物质。
2、柱效很高,每米可达3万块以上,一般用20--25cm的柱子,由于固定相的不断改进,最短的只有3cm,板数可达3000--4000,能满足一般分析的需要,有很高的分析速度。
3、柱子短,对压力要求低。
过去高压,现在高精度、高稳定性。
4、一般在室温下操作,样品不需预处理,操作方便,容易掌握。
5、流动相的作用比气谱中大,流动相的选择成为一个主要问题。
6、HPLC不仅用于分析目的,还可用于制备纯样品。
7、柱子昂贵,消耗大量溶剂,仪器价高,缺高灵敏度、通用的检测器。
三、HPLC装置
(一)、HPLC流程
(二)、各部件构成及作用
1、储液器
2、过滤器
3、梯度洗脱
4、高压输液泵
5、进样装置
6、检测器
(1)作用:
(2)种类:
紫外检测器、电化学、极谱、电导、库仑、离子选择电极最常用的是紫外检测器和折光检测器。
第二节液谱过程的理论
一、溶质在色谱过程中的保留值
tR=
(1+K’)
二、液相色谱过程中的谱带扩展
影响谱带展宽也主要由涡流扩散、分子扩散和传质三部分组成,但是,由于流动相物理性质的差别很大。
(一)溶质在流动相流动中的涡流扩散
(二)径向分子扩散
(三)固定相颗粒表面滞流层对扩散的影响
(四)颗粒内滞流层对溶质扩散的贡献
(五)动力学阻力
三、柱效和板高方程
1、板高和板数
n=16
=5.54(
H=L/n
2、折合参数
3、板高方程
第三节高效液相色谱柱
一、固定相
强调固定相的选择---选择最佳分离方法,并不排除某些化合物可通过流动相的改变,使用通用固定相实现特殊组分的分离。
2类型
(1)薄壳型微球
(2)深孔大颗粒
(3)小颗粒
二、柱型
常用的标准柱型:
发展方向:
主要材料:
三、柱的选择性
在气谱中,固定相的种类很多,选择固定相是分离的关键,在液谱中不同,虽然固定相的种类不少,但是,除柱效外,其它性质无明显区别。
四、色谱柱的填充
1、干法:
2、湿法(匀浆法):
一般地说,在粒度小于20μm的固定相的情况下,可以用匀浆法(湿法)填充。
第四节液谱流动相及其选择性
一、流动相的作用
流动相---溶剂--洗脱液---载液
样品--质--洗脱物
固定相一定,组分的保留和分离主要由溶剂决定,对一个确定的组分,流动相决定k’的能力-溶剂强度;
k’和溶剂强度成反比。
二、对流动相的要求
1、良好的化学稳定性,只溶解样品,不发生反应。
2、与所用检测器有相容性,如紫外检测器-溶剂在紫外区不能有吸收。
常用的溶剂有十六种,在液谱中经常使用二元或多元溶剂的混合流动相,调节洗脱强度和选择性
3、尽量使用粘度小的溶剂。
4、溶剂易于获取并易于纯化。
5、沸点太低,传输过程中易出现气泡。
6、毒性尽量小,不易起火。
7、成本低。
三、溶剂的分类
1、溶剂强度
2、溶解度参数
3、选择性参数
第五节分离模式及原理
一、液-固吸附色谱LSC,
(一)分离原理
平衡常数
K=
选择性决定于溶剂强度之差,如果改变溶剂的浓度、性质、PH值等,就可使ε值发生较大的变化,使保留值变化,这就是梯度洗脱的根据。
(二)固定相
(三)流动相
流动相以非极性溶剂为主,在液谱中,可供选择的固定相种类不多,主要靠改变流动相来实现对复杂样品的分离。
(四)、应用
液固色谱最适合于不同极性化合物的分离,极性越大,吸附作用越大,k’值越大。
用液固色谱法分离异构体比其它类型的色谱法有更好的选择性,是广泛使用的一种方法,主要缺点是峰拖尾。
二、液-液分配色谱
(一)、分离原理
流动相与固定相为互不相溶的两种液体,组分既溶解于固定相,也溶解于流动相,根据在两相中溶解度的不同分配,相当于液--液萃取。
在一定色谱条件下
(二)、固定相
在惰性载体表面涂敷或键合一层固定液薄膜,前者称涂层固定相,后者称键合固定相。
由于固定液在流动相中的溶解,不能稳定的保持在载体上,给操作带来麻烦。
因此,键合固定相使用更多些。
1、涂层固定相:
2、键合固定相:
(三)流动相:
1正相色谱
2反相色谱
3PH值对保留值有影响,
化学键合相的诞生,为色谱分离开辟了广阔的前景,不仅用于反相、正相,部分用于离子交换、体积排阻等。
三、离子对色谱
在两相体系中,一个离子型化合物或能解离的分子,在水相中与适当的平衡离子形成离子对,被有机相提取:
平衡常数
(三)、流动相
主要用于离子型或可离子化的化合物,这些化合物多数与生命科学有关系,如天然化合物、合成药物、生物体液等等。
四、离子交换与离子色谱
离子交换在交换剂表面进行
A+B---R=====B+A----R
1、微粒树脂型-聚苯乙烯树脂
2、表面多孔型离子交换剂
3、硅胶键合相多孔微粒
1有机溶剂:
2缓冲溶液:
3溶液强度:
4PH影响:
五、体积排阻色谱
固定相表面有不同尺寸的孔,样品中组分的分子量不同,体积也不同,如果样品分子直径大于孔径直径,分子不能进入小孔,随流动相迅速流出,如果样品分子直径小于孔径直径,流出速度慢。
(二)固定相
六、亲和色谱
一对可相互作用的生物分子,一个被固定在固定相表面上,另一个为样品分子。
反配体被配体固定相所吸附形成可逆的复合物,没有被吸附的“杂质”随洗脱液流出,被吸附的生物分子,通过洗脱液组成或条件的变化,洗下来,达到分离与纯化的目的。
第四章薄层色谱分析法(4学时)
通过本章学习,使学生了解薄层色谱法的特点,掌握薄层色谱法的理论和薄层色谱技术的实验条件的选择。
1.薄层色谱分离原理;
2.薄层色谱定性、定量分析
薄层色谱的基本操作过程
1.薄层色谱法的用途及特点2.薄层色谱法的发展
薄层色谱定性、定量分析
薄层色谱分离原理
第一节薄层色谱概述0.5学时
第二节薄层色谱固定相和流动相1学时
第三节薄层色谱定性、定量分析1.5学时
第四节薄层色谱操作1学时
讲解薄层色谱分离原理时与第三章液相色谱中吸附、分配色谱分离模式呼应。
第一节薄层色谱概述
一、薄层色谱概念
二、薄层色谱的特点
三、薄层色谱应用
1可用于判断两个化合物是否相同(同一展开条件下是否有相同的移动值);
2可用于确定混合物中含有的组分数;
3可用于为柱色谱选择合适的展开剂,监视柱色谱分离状况和效果;
4可用于检测反应过程。
第二节薄层色谱固定相和流动相
一、固定相选择
二、展开剂选择
薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样,主要根据样品中各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解度等因素来考虑。
展开剂的极性越大,对化合物的洗脱力也越大。
选择展开剂时,除参照表列溶剂极性来选择外,更多地采用试验的方法,在一块薄层板上进行试验
三、相对移动值
在不同的展开条件下,各化合物的移动距离不会相同,而在同一条件下,相对于展开剂的移动距离,各化合物有可比较的展开数据,称为相对移动值,或比移值:
Rf=li/lo
第三节薄层色谱定性、定量分析
一、定性分析—日光,紫外光,显色
1.比移值Rf
2.相对比移值Rs
二、定量分析—洗脱法,薄层扫描法
定量分析——10×
20cm
第四节薄层色谱操作
一、制板(以硅胶板为例)
二、点样
三、展开
四、显色,计算Rf值
第五章毛细管电泳色谱分析法(4学时)
通过本章的学习,使学生了解毛细管电泳的特点和进展,掌握毛细管电泳的理论及其实验条件的选择。
毛细管电泳的分离模式
毛细管电泳实验条件的选择。
1.毛细管电泳用途及特点2.毛细管电泳的分类和发展
第一节毛细管电泳色谱法概述1学时
第二节毛细管电泳仪系统1学时
第三节毛细管电泳的分离模式2学时
讲解毛细管电泳法的分离模式时与传统电泳、经典电泳法比较。
第一节毛细管电泳色谱法概述
一、由来、发展
高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE)是近年来发展起来的一种分离、分析技
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