临床生物化学检验II 大题重点Word格式.docx
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保证检测系统的完整性和有效性
1、核实检测系统性能:
如果实验室的检测系统具有溯源性,并已被许多实验室广泛应用,实验室只需核实该系统已被认可的性能。
——精密度和准确度。
2、确认检测系统性能:
如果实验室购置的检测系统在国内刚刚推出,但产品的分析性能已经由厂商进行了详细的评价,所有的分析性能资料已被生产厂商所在国的有关监督机构认可,且获得了生产许可证,实验室在使用该检测系统检测患者标本前应对该检测系统的基本性能进行评估。
确认实验应做精密度、准确度和结果可报告范围。
3、评价检测系统性能:
一个新的检测系统或对原有检测系统的任何改变都必须对该系统的性能进行全面评估,内容有精密度、准确度、可报告范围、分析灵敏度、分析特异性和参考区间。
有关基质效应
一、基质/基体(matrix):
反应溶液中或样品中除分析物以外的所有组分。
二、基质效应:
1、美国临床标准化委员会(NCCLS)文件中从两个角度定义:
①样品中除分析物以外的其它成份对分析物测定值的影响;
②基质对分析方法准确测定分析物的能力的干扰。
2、对于临床实验室:
不同于新鲜标本的反应特性使测定结果产生的偏差
三、基质偏差:
基质效应所致分析结果的偏差。
【评价】
1、首先明确基质效应评价的前提:
①通常认为新鲜(或冰冻)血清无基质效应;
②决定性方法或参考方法无基质效应。
2、选定制备物,如胆固醇定标物或质控物。
3、按照一定程序,选择比较方法与被评价方法进行制备物胆固醇的基质效应检测。
4、通过检测,发现存在基质效应,则需进一步评估基质偏差的大小。
评价过程:
量值溯源:
就是应用参考系统。
即用参考测量程序或参考物质建立或验证常规检验结果的准确性。
实验室信息系统(LIS):
对实验室日常工作、科室管理、学科建设和实验室发展等方面所产生及所需求的信息,通过计算机收集、处理、存储、输送和应用的系统。
LIS在实验室的应用,有助于提高实验室的整体管理水平,提高工作效率,减少漏洞,提高检验质量。
【组成】
1、临床检验信息:
实验室日常工作所产生的信息,如检测结果、质控数据、工作记录等信息。
2、实验室管理信息:
实验室的各种文件、技术资料、行政管理、检验收费、后勤供应、仪器维修保养等与实验室管理有关的信息。
1、如何确定参考范围:
标准:
参考个体(按预定标准选择的个体)→组成:
参考人群(包括尽可能多的参考个体)→选出:
参考组→测定:
参考值→分析:
分布特征(正态、偏态)→统计:
参考值限度→指定:
参考范围(参考值区间)
2、应用参考凡事应注意哪些问题?
①正确选择受检对象——具有代表性。
②合理规定参考人群的条件,如年龄、性别、民族,以及标本采集的时间和地区因素等。
③保证一定数量的受检人数,一般应有100例以上,若分布呈偏态时应在120例以上,特殊情况至少也应30例以上。
④测定方法标准化,保证结果的可靠性和可比性。
⑤根据专业知识确定单、双侧位界,严格按照统计要求进行测定结果的处理。
诊断试验结果与常见评价指标:
联合试验:
临床上常用的单项诊断试验都不够完善,灵敏度和特异度均不是很高,可联合使用两种或更多种的试验来提高诊断灵敏度或诊断特异度,即~。
1、平行试验可提高诊断灵敏度,但降低了特异度;
2、系列试验可提高诊断特异度,但降低了灵敏度。
ROC曲线:
以灵敏度为纵坐标、(1-特异度)为横坐标,将相对应的各临界值连接起来的折线图,称为受试者工作特征曲线(ROC曲线),简称受试者工作曲线。
根据金标准诊断结果将诊断试验数据分段、设定各临界值、划分四格表,再计算各临界值下的真阳性率、假阳性率,最后绘制ROC曲线,计算曲线下面积(AUC)。
【应用】
ROC曲线的优点:
ROC曲线将灵敏度与特异度以图示方法结合在一起,可准确反映某分析方法二者的关系,是试验准确性的综合代表。
方法简洁、直观,可用肉眼直接作出准确性判断。
作用:
①选择合适的临界值:
最靠近ROC曲线左上角的临界值时,其假阳性和假阴性的总数最少。
②比较两种或两种以上的诊断试验对同种疾病诊断的可靠性:
ROC曲线下面积(AUC)越大,说明该诊断试验性能越好。
ROC曲线的缺点:
①ROC曲线图上显示的不是真正的判断值,实际的分界值通常没有在图上表示出来。
②研究分析对象的数目没有在图上表示出来。
③当样品数减少,图形呈锯状和崎岖不平;
即使样品数目大,也可能是崎岖不平。
④画图和计算均比较繁琐。
酶含量的表示方法
一、酶活性浓度的单位
(一)酶活性单位
1、惯用单位:
酶活性测定方法的建立者所规定的单位。
由于单位定义不同,参考值差别很大,难以进行比较
2、IU:
即国际单位,在特定的条件下,每分钟转化1μmol底物的酶量为一个国际单位。
(二)酶活性浓度:
单位体积样品中的酶活性单位,习惯用U/L来表示体液中酶活性即酶活性浓度
(三)正常上限升高倍数(ULN):
用测得的酶活性结果除以参考范围上限。
二、酶蛋白质量浓度表示法:
以mg/L或µ
g/L来表示
优点:
①灵敏度高:
灵敏度达到ng/L至μg/L的水平。
②特异性高:
测定的影响因素较少,几乎不受体液中激活剂、抑制剂的影响,不受药物的干扰。
③可测定一些酶活性很难测定的酶。
如不表达酶活性的酶原或脱辅基的酶蛋白或失活的酶蛋白。
④与酶活性测定一起,计算免疫比活性,有可能为临床应用提供新的资料和信息。
⑤在同工酶测定中的应用:
与电泳法和层析法相比,免疫学法测定简单快速灵敏度高,标本量少,重复性好。
与化学抑制法相比特异性好。
米氏方程:
底物浓度[S],最大反应速度(V或Vmax),米氏常数(Km)
1、一级反应:
当[S]<
<
Km时,反应速率与底物浓度[S]成正比,呈一级反应。
V=Vmax[S]/Km=K[S],是用工具酶来测定各种代谢物浓度的方法学基础。
2、零级反应:
当[S]>
>
Km时,反应速率与底物浓度[S]无关,V=Vmax=K[E],称为零级反应,反应速率与酶浓度[E]成正比。
酶学测定时一般底物浓度可选择为Km的10~20倍。
酶活性测定的方法:
1、固定时间法:
将酶与底物在特定条件(缓冲液、温度等)下孵育,经过一定时间后,用终止液终止反应,通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量,除以时间即可计算出底物消耗速度(-d[S]/min)或产物生成速度(d[P]/min),将速度换算为µ
mol/min便是以国际单位表示的酶活性。
【评价/特点】即定时法:
测定酶与底物作用反应一定时间后底物或产物变化的总量,计算酶促反应平均速度。
比较简单,最后测定时因酶促反应已被终止,故所用仪器无需恒温装置,显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。
缺点:
无法知道在整个酶促反应进程中是否都处于线性期。
利用该法测定酶活性浓度,必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要非常精确,否则会引起较大误差。
2、连续监测法:
将酶与底物在特定条件(缓冲液、温度等)下孵育,每隔一定时间(2s∼60s)连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化,从而计算出每分钟的信号变化速率,求出酶活性浓度。
【评价/特点】
又称速率法或动力学法,指在酶促反应过程中用仪器监测某一反应产物或底物的浓度随时间的变化量,求出酶反应初速度,间接计算酶活性浓度的方法。
无须终止酶促反应,不需添加其它成色试剂,就能将反应物变化的多点测定结果连接成线,观察到整个反应过程,选择线性反应期来计算酶活性,结果准确可靠。
要求检测仪器具有恒温装置及自动检测功能,自动生化分析仪都能达到这些要求。
同工酶(isoezyme):
同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体,具有相同的催化作用,但其分子构成、空间构像、理化性质、生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的一组酶。
测定方法:
1、平衡法:
标本中待测物的量有限,经过酶促反应逐渐被消耗,当剩余的底物量很小(<
1%~5%)时,指示反应信号逐渐达到平衡,即通常所说的终点,所以又称为终点法。
平衡法的特点是测定待测物的总变化量,即测定的是“浓度”。
2、速率法(rateassay)又称动力学法、连续监测法,测定的是速率(通常指的是初速度)。
当底物的消耗量较小时(<
5%),酶促反应呈一级反应,此时的反应速度(v)与代测物的浓度成正比例。
两者的比较:
代谢物酶法分析的优点
①酶作用的特异性高,血清等体液样品不需预处理就能测定,简化了实验程序;
②试剂酶大多是蛋白质,没有毒性,避免了化学品对环境的污染;
③酶促反应温和,制成试剂盒可适用于自动分析。
代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范围等方面都优于传统的化学法。
代谢物酶法分析根据设计原理的不同可分为:
1、单酶反应直接法,可用于尿酸、胆红素(单底物),乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、碳酸氢根(双底物)的测定
2、酶偶联法,可用于体液葡萄糖、尿素、肌酐、甘油三酯、胆汁酸、乳酸、丙酮酸、酮体、乙醇、唾液酸以及氨、钾、镁离子的酶法测定。
3、酶循环法,应用见下
4、酶活性恢复法,应用见下
5、激活剂和抑制剂测定法:
可用于有机磷的酶法测定、抑制性ALP法测定茶碱,激活HK法测定镁离子
酶循环法:
利用底物和辅酶的反复反应,使待测物的酶促反应产物不断扩增。
当待测物浓度很低时,指示反应可检测信号很小。
利用酶促反应,使待测物和终产物之间的部分反应能循环进行,使检测信号不断增加。
【临床应用】
1、产物循环----氧化酶-脱氢酶系统,可用于甘油浓度的测定
2、底物循环----脱氢酶-辅酶系统,可用于胆汁酸、肉毒碱、同型半胱氨酸、高密度/低密度脂蛋白胆固醇的测定。
3、氨循环----合成酶-脱氢酶系统:
可用于氨的测定
试剂酶:
作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。
衡量其纯度的主要指标:
①酶的比活性,酶的比活性越高,酶的纯度越高。
②杂酶含量。
酶活性恢复法:
很多酶必需某些无机离子、微量元素或辅酶存在才发挥其催化活性。
脱去酶中关键的无机离子、微量元素或辅酶之后,酶即失去或降低其催化活性。
将无活性或低活性的酶与标本混合,标本中的无机离子、微量元素或辅酶使该酶复活或激活,复活或激活的比例可反映这些无机离子、微量元素或辅酶的含量。
无机离子测定:
丙酮酸激酶法测定钾离子、β-半乳糖苷酶法测定钠离子、淀粉酶法测定氯离子、异柠檬酸脱氢酶法测定镁离子。
微量元素测定:
超氧化物歧化酶法测定铜离子、碳酸酐酶法测定锌离子
酶法分析的设计要求
(一)共性要求
1、所用试剂酶的特异性:
指示酶要有更高特异性;
2、消除干扰因素:
加消除剂、抑制剂和用双试剂法;
3、试剂中的附加剂:
应不抑制酶的活性,不影响试剂的稳定性,不与底物和体液中的物质作用;
4、如何提高灵敏度:
①酶循环法;
②荧光法。
(二)平衡法设计的要求
1、酶的用量要足够大,能使反应1min~3min达到平衡,以保证较快完成测定。
2、反应要朝正反应方向进行,如果反应的平衡常数太低,可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应pH等方法,并设标准管一起到达平衡以后测定。
3、Km在保证测定线性的前提下要尽量小。
(三)速率法设计的要求
1、所用酶的Km应足够大,以保证测定线性和较长的反应动态期。
Km太小,可加入竞争性抑制剂加大Km。
2、酶用量要合适,用多了可能导致线性期缩短,甚至一级反应丧失。
一般酶用量比平衡法小。
3、速率法酶促反应受很多因素影响,只有很好控制反应速度(v)才与代测物的浓度成正比例。
1、决定性方法:
准确度最高,系统误差最小的方法,其测定结果与“真值”最为接近。
主要方法:
重量分析法、中子活化法、同位素稀释-质谱分析法(ID-MS)等。
用途:
用于评价参考方法与一级标准品,不直接用于鉴定常规方法的准确性。
2、参考方法:
准确度与精密度已经被充分证实,且经公认的权威机构颁布的方法。
干扰因素少,系统误差很小,有适当的灵敏度、特异度、较宽的分析范围并且线性良好;
重复测定中的随机误差可以忽略不计。
能在条件优越的实验室作常规分析。
主要用于鉴定常规方法、鉴定二级标准品和为质控血清定值、商品试剂盒的质量评价。
3、常规方法:
具有足够的精密度、准确度和特异度,有适当的分析范围,经济实用的方法,其性能指标符合临床或其它目的的需要。
常规方法在作出评定以后,经有关学术组织认可,可以作为推荐方法。
标准品(参考物,referencematerial):
它的一种或几种物理或化学性质已经充分确定,可用以校正仪器和某种测定方法的物质。
分级:
1、一级标准品(原级参考物):
它是已经确定的稳定而均一的物质,其数值已由决定性方法确定,所含杂质已经定量。
属于有证参考物质(CRM)。
用于校正决定性方法,评价和校正参考方法以及为“二级标准品”定值。
2、二级标准品(次级参考物):
可以是纯溶液(水或有机溶剂的溶液),也可以存在于相似基质中。
可由实验室自己配制或为商品,示值必须用一级标准品和参考方法并由训练有素的,能熟练掌握参考方法的操作者确定。
主要用于常规方法的标化和控制物的定值。
方法评价的基本内容:
通过实验途径,测定并评价方法的精密度和准确度。
评价实验的过程就是对误差的测定。
1、回收:
分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。
2、回收率:
Tt:
分析样品的测定结果Tb:
基础样品的测定结果Tt–Tb:
回收量C:
分析样品中加入的纯分析物的浓度(加入后浓度)
1、干扰:
在测定某分析物时,受另一非分析物影响而导致测定结果增高(正干扰)或降低(负干扰)。
2、干扰物质:
分为内源性(样品中存在的)和外源性(外界污染的)两类。
①内源性的干扰物:
血清中固有的代谢产物,如血清中的甘油、胆红素、脂类、蛋白质、血红蛋白等;
治疗药物,肠道营养等。
②外源性干扰物:
样品收集中的添加物如抗凝剂、防腐剂、稳定剂,容器和塞子的污染等;
试剂中的杂质和杂酶等。
如何用单值指标判断评价试验结果:
1、精密度允许分析误差:
95%样品的允许误差限度。
2、医学决定水平:
用Xc表示,是指临床判断结果具有临床意义的被分析物浓度。
试剂盒(reagentkit,kit):
用于检验项目测定的含有使用说明书的所有配套试剂的组合。
【分类】
1、固体试剂和液体试剂
①固体试剂:
冻干试剂、粉状试剂、干片试剂等。
运输方便、保存期长;
组份均一性较差,瓶间差较大(分装过程中的称量误差和复溶时加入水量的误差都导致瓶间的不均一性)。
水质的优劣对试剂的稳定性和测定结果的可靠性有相当大的影响。
②液体试剂:
稳定性高,组份高度均一,瓶间差小,测定重复性好,使用方便。
无需加入任何辅助试剂及蒸馏水,避免了外源性水质对试剂的影响,性能较稳定,测定结果较为准确。
保存时间较短,不便于运输。
2、试剂盒在使用时,除标准品外,只有一个试剂的,称为单一试剂;
如果有两个试剂,则称为双试剂。
①单一试剂,优点:
操作简单;
稳定性较差,抗干扰能力差。
②双试剂是目前的主要试剂形式,提高了抗干扰能力、试剂的稳定性和均一性。
干化学分析仪的检测原理
一、反射光度法:
5层膜结构
①渗透扩散层:
样品迅速均匀渗透,阻止颗粒成分和蛋白质等大分子向下渗透
②反射层:
白色不透明层,下侧涂布反射系数>
95%的物质如BaSO4,能隔离渗透扩散层中有色物质
③辅助试剂层:
去除血清中的内源性干扰物,如固定维生素C氧化酶以消除血清中维生素C对H2O2的还原作用
④试剂层:
即反应层,固定了该检测项目所需的试剂
⑤支持层:
透明塑料基片,允许反射光完全透过,而样品浓度与反射光强度成反比
试剂层和支持层之间可加一吸水层加快样品和试剂的渗透速度。
二、差示电位法:
常用于无机离子K+、Na+、Cl-等的检测
也是5层结构:
离子选择敏感膜、参比层、氯化银层、银层和支持层
电极:
样品电极、参比电极
测定方式:
取一定量血清加到样品电极的加样槽中,再取等量参比液加入参比电极的加样槽中,通过电位计来测定这两个电极的差示电位。
1、理论K值:
若某酶活性测定没有可用的校准品,则酶活性计算公式由酶活性的国际单位定义推算得出,理论K值=
2、实测K值(实际K值):
理论K值受样品和试剂的加量准确度、比色杯光径准确度,尤其是ε的影响。
ε在波长和温度等不同时有所不同。
试剂说明书的ε可能与实际所用分析仪所测不同。
因而有必要获得用户所用分析仪的实际ε,再计算K值此为实测K值。
3、校准K值:
酶校准液在分析仪中测定后可自动计算得出校准K值,校准K值=(酶活性U/L)s/(ΔA/min)s
次波长
【使用目的】:
①消除噪音干扰。
噪音:
从光源到比色杯、单色器、检测器整个光路均可产生,因双波长同时检测,两种波长检测产生的噪音基本上相同;
②减少杂散光影响;
③减少样品本身光吸收的干扰。
如溶血、黄疸和脂浊等干扰可部分消除
【常用方法】
1、根据待测溶液对吸光谱的吸收曲线,选择最大吸收峰对应的波长为主波长,吸收曲线下端较为平坦的某一波长为次波长。
2、选待测溶液最大吸收峰对应的波长为主波长,选等吸收点的对应的波长为次波长。
3、选溶液最大吸收峰的波长为主波长,选显色剂的最大吸收峰对应的波长为次波长。
【设置原则】:
①使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值。
②被测物在主、次波长处的光吸收值有较大差异。
③次波长一般大于主波长100nm,主要考虑脂浊问题。
④免疫比浊法测定时次波长的选择,则是距离主波长越远越好,以得到较高的灵敏度
1、弹性速率:
酶活性测定中,当酶活性太高,在读数时间内已不呈线性反应。
有些仪器具弹性速率功能,能选择读数时间前段仍呈线性的吸光度值计算结果,使酶活性测定的线性范围得以扩大。
2、弹性速率法:
具备了弹性速率法的仪器,可以提前并弹性地确定检测读数窗口期,检测出高酶活力的样品,使得可报告范围上限延伸,一般可延伸5倍左右。
对于低酶活力或低浓度分析物,可以延长检测的读数窗口时间,使结果具有更多的检测数据,增加最后检测结果的可靠性。
【优点】:
①显著减少了重新检测的频率。
②避免了高酶活力样品的错误数据,得到准确的病人结果。
③减少了试剂的消耗,并缩短了发报告的时间,消除了稀释样品的重做引入的误差。
自动生化分析仪性能评价
一、准确度和精密度
二、分析速度:
主要由取样周期决定
1、取样周期:
从样品针采集前一个样品开始到采集下一个样品开始所需的时间
取样周期决定了分析仪的工作速度;
加试剂周期与取样周期相应
2、反应盘圈数和取样针数
三、实用性
1、通道(channel)数量:
与分析仪所能容纳的试剂瓶数有关
2、反应杯数量:
反应杯数量多,容许同时处于取样、反应检测和清洗状态的反应杯数量便多,分析效率可提高
3、一次能容纳的样品数量 ——样品盘模式:
即批处理样品量,分析仪对每批样品进行测定的前后均有一个启动过程和停止过程
4、试剂瓶容量:
检测频率高的项目等需总试剂量大
5、总反应时间:
目前主流分析仪的总反应时间为8.5~10min,个别15~22min
6、吸光度检测范围:
对微弱光线的检测能力,即能检测吸光度的最高值及其准确度决定检测上限。
检测灵敏度:
能辨别待测物最小浓度差的能力
7、检测成本:
反应杯类型和寿命决定其耗费;
最小取样量影响试剂用量;
最小反应杯液量可决定样品和试剂用量
8、通道开放程度:
开放通道指用户可自由修改的测定分析程序,可使用户方便地选择试剂品牌。
某些品牌的分析仪开放通道数仅10个,目的是要求用户使用配套试剂,因此用户选用试剂明显受到限制
9、检测原理:
除可见紫外吸收光谱分析外,是否具有电化学、荧光等监测器,可决定该分析仪能开展检测项目的类型和数量
10、软件功能:
灵活性、方便性和数据存储能力等
11、其他:
用水量、消耗品、样品管要求、保养要求、急诊检验能力、复查功能等。
售后服务和维修
固定时间法:
在时间-吸光度曲线上选择的两个读数点,既非反应初始吸光度亦非终点吸光度,其差值用于结果计算。
固定时间法可解决某些化学反应的非特异性问题
【项目】:
1、苦味酸法测定肌酐
①反应最初30s,血清中快反应干扰物(如维生素C、丙酮酸、乙酰乙酸等)能与碱性苦味酸反应。
②在第二个30s,碱性苦味酸主要与肌酐反应,且此段时间-吸光度曲线的线性较好(故也可用连续监测法测定肌酐)。
③在80s~120s及其以后,碱性苦味酸可与蛋白质以及其它慢反应干扰物反应。
故选用30s~80s这段固定时间为测定时间
2、溴甲酚绿法测定血清清蛋白
溴甲酚绿(BCG)在pH4.20的环境中,在有非离子去垢剂(Brij-35)存在时,可与清蛋白(albumin,Alb)结合形成蓝绿色复合物,
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