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1引言
近年来,食品安全已成为社会共同关注的公共卫生问题,而兽药残留成为食品安全监管的重要问题。
兽药残留如克伦特罗(clenbuterol,CL)、氯霉素(chloramphenicol,CAP)和雌二醇(17βestradiol,E2)的滥用和食用可导致多种健康损害[1~6]。
加强兽药残留检测分析是监管和控制兽药残留的重要手段。
因此,简单、快速和灵敏的微痕量检测技术的研究和创新尤为重要。
目前,酶联免疫吸附测定法(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)[7,8]是兽药残留的主要检测方法之一具有简单、快速、灵敏度高和特异性强等诸多优点[9]。
悬浮芯片技术是一种多功能的液相芯片分析平台,既具有固态片膜芯片的高通量特性,又具有操作简便、重复性好、灵敏度高等优点。
目前,对该技术的研究多集中于大分子蛋白质和核酸的检测[10~12],并未见应用悬浮芯片同时检测多种兽药CAP、CL和E2的报道。
本研究采用悬浮芯片法和常规ELISA法对3种兽药进行同时检测,并在灵敏度、特异性、检出限等方面进行比较。
2实验部分
2.1仪器和试剂
BioPlex悬浮系统,Model680型酶标仪(美国BioRad公司);
MALDITOFMSREFLEXⅢ型质谱仪(德国Bruker公司),DU530型紫外可见分光光度计(美国Beckman公司);
6930型冷冻离心机(日本Kubota公司);
MS3型旋涡混匀器(德国IKA公司),YM10过滤柱(孔径1.2μm,美国Millipore公司),Costar96孔酶标板(美国Corning公司);
日立S4500型扫描电镜(日本Hitachi公司)。
3种不同编码的荧光微球(beads,Φ=5.6μm)和蛋白氨基偶联试剂盒(包括激活缓冲液和储备缓冲液)购自美国BioRad公司;
CAP单克隆抗体和E2单克隆抗体(美国Biodesign公司);
CL单克隆抗体(英国Abcam公司);
3种单抗的生物素化由本实验室完成;
CAP、CL、E2、EDC、SulfoNHS、沙丁胺醇、莱克多巴胺、N,N二甲基甲酰胺(DMF)、邻苯二胺(OPD)和E2BSA结合物(美国Sigma公司);
链霉亲和素藻红蛋白(Straptavidinphycoerythrin,SAPE,美国Invitrogen公司);
BSA(德国Roche公司);
CAPBSA和CLBSA为本实验室合成。
其它试剂均为国产分析纯。
2.2实验方法
2.2.1悬浮芯片检测微球的制备
参照试剂盒说明书,取3种荧光微球(1.25×
107个/mL),磷酸盐缓冲液(PBS)重悬后,加入到激活缓冲液中,并立即加入新鲜配制的偶联试剂EDC和SulfoNHS(浓度均为50g/L),室温下搅拌20min使其活化;
活化后,分别加入3种兽药的BSA结合物5μg,并用PBS缓冲液(pH7.4)定容至500μL,室温下中速旋涡振荡混匀2h,14000g离心4min,弃去上清液,封闭,清洗,加入储备缓冲液,4℃储存。
上机进行偶联确证,以便用于下一步测试。
2.2.23种兽药的悬浮芯片多元分析标准曲线的测定
实验采用间接竞争法,在96孔反应板的每个反应孔中分别加入优化后的3种靶标物对应的生物素化单抗5、1和16ng,分别将CAP、CL和E2的标准品(以下涉及到3种兽药均按此顺序)按照5×
、5×
和3×
梯度分别稀释成7个梯度加入。
将3种荧光微球等比例混合,每孔加入3种荧光微球各2000个,并用PBS补足至50μL/孔,同时再各准备一个不加标准品的阳性对照孔。
37℃中速漩涡振荡2h,使荧光微球上的兽药BSA结合物与溶液中相应的标准品共同竞争生物素化的单抗,然后加入1∶100的SAPE50mL/孔,37℃中速振荡反应30min。
悬浮芯片读取每孔100个荧光微球,获得中位荧光强度值(MFI)。
以各种靶标标准品的浓度为X轴,以检测得到的MFIs为Y轴,绘制3种兽药小分子的悬浮芯片检测标准曲线。
2.2.33种兽药的常规ELISA标准曲线的测定
采用间接竞争法[13~15],在酶标板上包被小分子兽药的BSA结合物,以方阵滴定法筛选和优化3种兽药常规ELISA的包被原量(分别是2、0.2和0.25μg)和单抗工作浓度(稀释度分别为1∶80000、1∶20000和1∶80000),确定反应条件后,选择3种兽药标准品的浓度,绘制各自的标准曲线。
2.2.4两种方法对3种兽药残留的特异性测试
准备3组沙丁胺醇、莱克多巴胺、庆大霉素和红霉素测试品,终浓度达到50、1250和31250ng/L,每个浓度平行做3个样,同时准备一个阳性对照样,悬浮芯片读数并与阳性对照样比较。
以交叉反应率(CR%)测试常规ELISA检测的特异性。
2.2.53种兽药盲样的检测比较
准备3个浓度的3种兽药盲样,交由测试者进行检测,每个盲样平行测试3次。
根据得到的标准曲线计算盲样的浓度,并与实际浓度进行比对。
3结果与讨论
3.1悬浮芯片法对3种兽药检测标准曲线的测定
按优化的比例加入相应的抗体和SAPE,使反应充分进行,可省去真正的悬浮芯片反应所需的抽滤步骤。
因此,检测更加简单快速。
在优化条件下,绘制标准曲线方程(见图1和表1)。
由于每次检测取100个荧光微球,每个荧光微球都有1个独立的检测值,也即每个样品(包括标准品)被重复测试了100次,样本量有足够的代表性。
由于E2难溶于水,加入少量DMF可增加其溶解度,实验发现,抗体活性并未受影响。
CAP、CL和E2悬浮芯片的检测区间分别为50~6.25×
105ng/L,56~7.81×
105ng/L和1×
103~7.29×
105ng/L;
它们的检出限分别为50、56和1000ng/L,检测范围跨2~4个数量级。
在这些范围内,可对这3种兽药同时进行快速的定量测定,全部检测过程只需约2.5h。
检测标准曲线的这些指标和荧光微球上的抗原结合物的偶联量、抗体的亲和力、单抗的生物素化程度都有密切关系。
3.2ELISA法对3种兽药检测标准曲线的测定
按照棋盘滴定所获得的最佳抗原结合物包被量和最适抗体稀释度,对CAP、CL和E2残留进行标准曲线的测定和绘制,结果如图2所示。
标准曲线方程、检出限和检测区间等各参数见表1。
比较悬浮芯片法和常规ELISA法可见:
在CAP的检测中,常规ELISA法的检测区间略比悬浮芯片法稍宽,但不存在绝对的优势;
而在CL和E2的检测中,悬浮芯片法的检出限明显低于常规ELISA法,检测区间比ELISA法宽,这在实际检测中占有较大优势。
悬浮芯片法主要应用于多元靶标物的分析检测,而常规ELISA每次只能检测一个目标物,在多元分析中处于劣势。
表1悬浮芯片法和ELISA法检测3种兽药残留的比较(略)
3.3悬浮芯片法和常规ELISA法在检测技术上的比较
悬浮芯片法使用的检测原理同常规ELISA法一样,同为间接竞争法,所用试剂略有不同。
但在检测的灵敏度和检测区间上悬浮芯片法明显优于常规ELISA法。
两种方法存在性能差异的主要原因如下:
(1)悬浮芯片抗原以化学键进行偶联,而ELISA法利用一种物理性的非特异性吸附,其连接的牢固程度和稳定性比悬浮芯片的抗原偶联方式差很多。
(2)悬浮芯片激光检测器的分辨率明显高于ELISA法采用的普通酶标仪,检测更加灵敏。
(3)悬浮芯片技术使用主要试剂是生物素亲和素,其亲和力高达1015L/mol[16,17],比抗体亲和力高10000倍以上。
悬浮芯片技术信号放大更灵敏,更稳定,受环境干扰较小。
(4)悬浮芯片的抗原抗体反应在液相中进行,有效地保证了试剂的活性;
而且检测微球的比表面积远大于酶标板的底部,使反应更加充分;
而ELISA法反应在固相中进行。
(5)悬浮芯片的标准曲线是多元参数的Logistic回归曲线,检测范围宽;
而常规ELISA法多用直线方程,使用曲线方程在一定程度上可增加其检测范围。
3.4两种方法检测的特异性测定
由表2可知,不同浓度下的沙丁胺醇莱克多巴胺的MFI和阴性对照组无显著性差异,P&
gt;
0.05;
加入不同浓度庆大霉素和红霉素对检测无明显干扰,P&
0.05。
因此,悬浮芯片检测的特异性良好,与其它药物无明显交叉反应。
同时,用ELISA对表2中药物的CR进行测定,CR均&
lt;
5%。
两种方法的特异性均良好,这与反应所用单抗的特异性有直接关系。
表2悬浮芯片检测不同浓度多种化学物质加入所获得的MFI(略)
3.5盲样的测定
测试结果和实际浓度值的比对见表3。
由表3可见,悬浮芯片检测浓度值与实际浓度偏差为8.09%~17.03%,可认为偏差相对较小。
由于多种靶标物盲样的浓度低于ELISA的检出限,并未能对其进行检测。
在其检测区间内,ELISA与实际浓度偏差为9.19%~17.74%,偏差也相对较小。
悬浮芯片法对盲样测定的检测区间较宽,与ELISA法相比,有较大的优势。
表33种兽药残留盲样的检测(略)
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