黄连总生物碱提取工艺的优化研究Word格式文档下载.docx
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NanyangInstituteofTechnology
生物工程专业贾建军
[摘要]本论文主要对黄连总生物碱的提取工艺条件进行优化研究。
首先,通过单因素试验研究提取时间、乙醇浓度、提取温度、料液比等因素对黄连总生物碱得率的影响,然后进行析因试验筛选出对黄连总生物碱得率影响显著的因子,再通过Box-Behnken
试验对提取条件进行优化。
结果显示黄连总生物碱的最佳提取条件为:
提取时间120
min,乙醇浓度60%,提取温度8「C,料液比1:
41。
在最佳提取条件下黄连总生物碱得率可达73.21mg/g,与预测值73.44mg/g—致,证明试验结果准确可靠,可为黄连总生物碱的提取工艺研究提供参考。
[关键词]黄连总生物碱;
提取工艺;
响应面分析
BiologicalengineeringMajorJiaJianjun
Abstract:
ThispaperistooptimizetheextractionconditionsoftotalalkaloidsfromCoptischinensis.First,singlefactorexperimentsweredonetoexaminetheimpactofethanolconcentration,extratingtime,extractingtemperature,ratioofsolidtoliquidandothereffectontheextractionofCoptischinensisalkaloids.Thenfactorialexperimentsweredonetofilteroutthesignificantfactors.Finally,Box-Behnkenexperimentsweredonetooptimizetheextractionconditions.TheoptimalextractionconditionsoftotalalkaloidsfromCoptischinensisareobtainedasfollows:
ethanolconcentration60%,extractiontime120min,extractiontemperature81°
Candthematerialliquidratioof1:
41.Thetotalcoptisalkaloidsyieldcouldreach73.21mg/gundertheoptimumtechnologicalconditions,whichissimilarwiththepredicted73.44mg/g.Itprovedthatthetestresultsareaccurate,reliableandcouldprovidetherefereneefortheextractionoftotalalkaloidsfromCoptischinensis.
Keywords:
totalalkaloidofCoptisChinensis;
extractioncondition;
responsesurfacemethodology
1绪论
1.1黄连生物碱的研究现状
1.1.1黄连的自然分布和特性
1.1.2黄连的主要化学成分
1.2黄连生物碱的药理活性
1.3黄连生物碱的应用现状
1.4黄连生物碱的提取技术的研究现状及进展
1.5总生物碱含量的分析测定方法
1.6响应面分析法简述
1.7本论文的选题依据及研究内容
1.7.1本论文的选题依据
1.7.2本论文研究的主要内容
2黄连总生物碱的提取工艺优化研究
2.1材料
2.1.1原料
2.1.2试剂
2.1.3仪器设备
2.2方法
2.2.1黄连总生物碱的提取
2.2.2黄连总生物碱的检测
2.2.3盐酸小檗碱标准曲线的绘制.......
2.2.4黄连总生物碱得率的计算
2.2.5单因素试验
2.2.6析因试验设计
2.2.7响应面分析试验设计
2.2.8最佳工艺条件的验证实验
2.3结果及分析
2.3.1盐酸小檗碱标准曲线的绘制及结果
2.3.2
10
2.3.3
2.3.4
2.3.5
2.3.6
2.3.7
单因素试验结果分析析因试验及结果响应面结果及分析响应曲面图分析黄连总生物碱提取工艺最优值的预测最佳工艺条件的验证实验
11
13
14
16
18
19
3结论与展望.....
3.1主要结论
3.2展望.......
参考文献
致谢
20
22
24
1绪论
生物碱是一类碱性含氮有机化合物并广泛存在于自然界中,普遍含有复杂的
环状结构,通常以盐或游离态两种形式存在,有显著的抗肿瘤、抗菌、抗过敏、抗炎症等药理活性,是一种重要的中草药有效成分,具有极为重要的药用价值和保健功能[1]。
近年来,生物碱类化合物一直成为国内外研究的热点。
1.1黄连生物碱的研究现状
1.1.1黄连的自然分布和特性
黄连通常是指毛莨科植物味连、雅连或云连的干燥根茎,主要含异喹啉类生物碱,具有泻火解毒、清热燥湿的功效,对胃肠溃疡也有显著疗效。
作为一种常用中药材,最早的记载见于《神农本草经》,因其根茎呈黄色连珠状,所以称之为“黄连”,根据其形状的不同又可分为味连、云连和雅连,其中味连大多聚集成簇且形状弯曲似鸡爪,习惯上称之为“鸡爪连”,主产于中国四川、重庆、贵州、湖北、陕西等省,云连多弯曲呈钩状,形如“蝎尾”,多为细小的单枝,主产于中国云南省,雅连多呈微弯曲的圆柱形,形似“蚕状”的单枝,主产地为
中国四川省⑵。
黄连是一种大宗名贵中药材,因此具备相当的开发潜力,其开发利用备受关注。
1.1.2黄连的主要化学成分
黄连的化学研究表明[3、4],其主要药理成分除异喹啉类生物碱外,还含有木兰花碱、黄柏酮、黄柏内酯、阿魏酸和多种微量元素,其中异喹啉类生物碱主要包括小檗碱、黄连碱、甲基黄连碱、掌叶防己碱、非洲防己碱和药根碱。
季铵型生物碱小檗碱的含量最高,约为8%〜10%,是其主要成分,具有抗菌、抗肿瘤和抗心律失常等生物活性。
其他异喹啉类生物碱,如黄连碱、药根碱和掌叶防己碱等,也具有降血糖、抗菌、抗肿瘤、保护胃黏膜等活性。
1.2黄连生物碱的药理活性
(1)抗肿瘤、抗癌作用
黄连生物碱多具有显著的抗肿瘤和抗癌作用,但由于其结构复杂、作用机制繁杂且作用位点较多,因而对某些病症缺乏选择性和针对性,又由于尚不清楚一些生物碱的作用机制,因此进一步分离、纯化、筛选生物碱,加强深层次针对性的病理、药理和毒性研究,对于新药的研发与应用具有重要的现实意义。
试验
证明[5、6],黄连生物碱具有抑制人结肠癌细胞中环氧合酶、肿瘤坏死因子、人肝细胞中激活蛋白酶、DNA拓扑异构酶I、n活性及食道癌细胞生长繁殖的作用。
(2)抗焦虑作用
Kromhout[7]等人的一系列实验证明浓度为40卩g/ml的黄连丁醇提取物,可阻断生物合成儿茶酚胺。
经柱层析分离纯化后的提取物,Frn和Frm中均含有异喹啉类生物碱,如小檗碱和巴马汀碱。
浓度为40卩g/ml的Frm能使嗜铬细胞瘤
(PC12)细胞中多巴胺的合成减少77%,其半数抑制量(IC50)为195卩g/m。
这说明这些异喹啉类生物碱能够抑制PC12细胞中的酪氨酸羟化酶活性而阻止儿茶酚胺合成,因此具有抗焦虑作用。
(3)抗氧化和自由基清除作用
来自于阳光、紫外线、化学反应、物理辐射和新陈代谢的自由基会引起人
机体的多种病理损害,如细胞的老化、癌症的发生以及动脉粥样硬化、血栓的形成等。
黄连生物碱对小鼠红细胞溶血和脂质过氧化过程具有显著的抑制作用,并
且具有极强的自由基清除活性。
YANGDM[8]等考察了中国和地中海沿岸20种传统药材的抗氧化活性,发现浓度为100卩g/ml时的黄连提取液对自由基的清除性能高于其它植物。
(4)保护胃粘膜的作用
黄连中的黄连碱具有显著的保护胃粘膜作用,而所含有的其它异喹啉类生物碱,如黄连素、氧化黄连素、巴马汀碱则对胃粘膜损伤不具有保护作用。
韦记青[9]等人研究表明小檗碱有利于肠道的收缩幅度的增加,黄柏酮则能使张力和振幅
都有所增加,而黄柏内酯则使肠管弛缓。
黄柏的甲醇提取物对大鼠胃肠溃疡具有明显抑制作用,并且强于小檗碱及黄连碱。
(5)抑制碱性磷酸化酶作用
盐酸小檗碱对碱性磷酸酶的抑制作用与浓度呈正相关,其在浓度为0.1-6mol/L时抑制作用较强,此范围内的线性公式为Y=4310X+56255(r=0.97)。
因此,测定血液中小檗碱的浓度可根据小檗碱对碱性磷酸酶的抑制作用这一原理,同样这一原理也可用于控制黄连的质量标准[9]0
1.3黄连生物碱的应用现状
由于黄连生物碱的这些生物活性使对其的研究进人了一个新的阶段,不仅促
进了黄连生物碱类化合物研究、开发利用,也促使其在医药、化妆品、食品等工业中有广泛的应用。
(1)黄连生物碱在食品工业中的应用
1天然甜味剂
柚皮苷属二氢黄连生物碱,经过加氢处理可以转变为二氢查尔酮,具有甜味,因此可为糖尿病人食用且不引起血糖的升高,是具有保健作用的良好食品甜味添加剂替代产品。
2天然抗氧化剂
由于黄连生物碱均具有较强的抗氧化能力。
其中以巴马亭的抗氧化效果最为显著,又由于其具有更多的生理活性,且无毒副作用,因此可以作为抗氧化剂在食品工业中广泛的应用。
3天然色素
黄连生物碱多呈黄色,同时又由于其良好的溶解性,既能溶解于水等极性溶剂,又能溶解于多种非极性溶剂,所以可以根据不同的需要来选择适宜的黄连生物碱作为食品工业的着色剂。
(2)黄连生物碱在医药工业中的应用
随着分离纯化提取技术的发展,一些微量黄连生物碱被不断发现,生理活性被不断的研究,开发了数种含有黄连生物碱类物质的产品。
在医药方面,根据其在抗肿瘤、抗菌、抗癌等方面的药理作用,很多以黄连生物碱为主要成分的药物已经上市推广。
1用于抗癌抗肿瘤药物
以黄连提取物为主要成分的一些药物在国内外先后研制开发,对于癌症肿瘤
等疾病均有良好的疗效。
利用黄连生物碱开发的药剂可用于治疗各种良性恶性肿瘤的预防与治疗。
2用于抗菌药物
黄连生物碱均具有明显的抗菌活性。
其中小檗碱具有最大的抑菌活性,黄连碱和巴马亭碱次之,且对革兰氏阳性菌的抑制活性相对于酵母菌大。
因此黄连生物碱广泛地应用于抑制革兰氏阳性菌的药物。
(3)黄连生物碱类化合物在化妆品行业中的应用
医学美容事业的课题之一便是消除脂褐素(老年斑)。
黑色素细胞的密度和黑色素的量等因素决定了皮肤肤色的深浅,而黑色素的生成与酪氨酸酶活性有直接关系。
所以,抗自由基氧化的同时抑制酪氨酸酶的活性对于去斑增白具有重要作用,黄连生物碱恰好适宜,因此广泛应用于美容化妆品中。
另外黄连生物碱在化妆品中还可用作天然防晒剂、增白剂、皮肤调理剂[13、10]0
所以植物体
生物碱又称为植物碱,通常是指生物体内存在的一类含氮碱性有机化合物,在植物体内通常以游离态或与无机酸有机酸结合成的盐的形式存在,粉末可以直接用水、稀酸、有机溶剂或有机溶剂水溶液等冷浸、渗漉或回流提取生物碱。
黄连生物碱的主要提取方法有:
稀酸提取技术、回流提取技术、超声波辅助技术、微波辅助提取技术等。
(1)稀酸提取法
稀酸提取法的原理是利用小檗碱的无机酸盐溶解度大于其有机酸盐和游离态单体的性质,将植物体在硫酸酸化条件下提取。
如宁娜[11]等以黄连须根边角料为原料,采用冷浸提取、盐酸盐析和重结晶等过程,得到的小檗碱和药根碱,纯度可达到95%以上。
胡保平[12]等研究了提取纯化黄连中小檗碱的工艺,详细考察了实验过程所涉及到的各种因素,较为系统完善的优化了盐析法提取纯化小檗碱的工艺,为近一步实现工业化打下基础。
(2)回流提取法
水、乙醇等低沸点提取剂是回流提取常用的提取剂,加热不但有利于提取而
且使提取剂不断汽化,提取剂经冷凝,再回到提取器中继续进行浸提,直至有效成分回流提取完全。
徐蓉如等以乙醇为提取剂回流提取总生物碱,采用紫外分光光度法测定提取液中总生物碱的含量,并以此优化提取工艺,优化得到的工艺生物碱的提取效率高,稳定性好,总生物碱平均含量为15.06%。
(3)超声辅助提取法
超声辅助提取是在溶质颗粒与溶剂之间产生声波空化作用,致使溶液内气泡的形成、膨胀和破裂,从而更加充分的使样品颗粒分散,增加溶质颗粒与溶剂间的接触面积,提高生物活性成分从固体颗粒转移到液体提取剂的传质速率。
如黄罗生[13]等采用正交设计法对超声波提取小檗碱进行研究,小檗碱得率达8.38%。
(4)微波辅助提取法
微波具有良好的穿透能力,能够透过细胞壁直达植物的腺细胞和维管束,又由于其较强的加热作用使细胞内的游离水加热沸腾,使细胞内部压力逐渐增大,当超过细胞壁的承受能力,将致使细胞破裂,细胞内的物质自由流出传递至周围的提取剂中溶解。
从而有利于有效成分的浸出。
1.5总生物碱含量的分析测定方法
目前,生物碱的分析检测主要包括比色法、碘量法和高效液相色谱法。
(1)比色法
1间接比色法
标准物质采用盐酸小檗碱,依次加入1ml—定浓度标准品溶液,5ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(PH=4.5),2ml溴甲酚绿指示液,摇匀,室温下静置10min,用分光光度记在最大吸收波长下检测,一般在416nm处有最大吸收峰[14]。
2直接比色法
将不同浓度的标准品溶液在紫外可见光谱区进行测定,确定最大吸收波长,绘制标准曲线测定总生物碱含量,最大吸收峰一般为350nm[14]。
(2)碘量法
对照品采用盐酸小檗碱,按《中国药典》中盐酸小檗碱项下国标方法测定总生物碱含量,测定过程应注意准确多次滴定[15]。
(3)高效液相色谱法
提取液中的总生物碱含量采用高效液相色谱法测定时,通常以盐酸小檗碱为单一对照品,也可用一定比例的盐酸小檗碱、盐酸药根碱和盐酸黄连碱三种物质共同作为对照品[16'
17'
18]0
以上三类方法中,HPL法较为精确,但对提取物的纯度有较高的要求。
黄连生物碱因其分子结构的不同,而对不同波段的光具有不同的吸收度,又因最大吸光值相差不大,所以对提取物的总生物碱进行整体评价可用直接测定法,对测种生物碱的具体结构可采用间接测定法,测定方法不同,结果会有所差异。
因此对于测定提取液总生物碱含量,应根据不同目的,选择恰当的方法进行[19]0
1.6响应面分析法简述
响应曲面设计方法(ResponseSurfaceMethodology,RSM)这种回归分析方法可用于研究几种因素间交互作用。
通过一定的试验设计方法和试验数据,采用响
应面分析法将多因子试验中因子与指标的相互关系拟合多元二次回归方程,依此
对函数的响应面和等高线进行分析,研究因子与响应面之间以及因子与因子之间的相互关系。
其可以在较短的时间内通过少量的试验对所选的试验参数进行全面研究,通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数,解决多变量问题的一种统计
方法[20'
21、22]0
响应面分析法可作为最优化方法,可将体系的响应作为一个或多个因素的函数,以图像形式将这种函数关系显示出来,通过直观观察来选择试验设计中的最优化条件。
克服了正交设计只能处理离散的水平值,而存在无法对各因素的连续作用具体的最优值缺陷,且求得的回归方程的精度高。
本研究选择Minitab15数
据分析软件对试验安排进行设计及对试验结果进行分析,确定优化后的试验结果。
1.7本论文的选题依据及研究内容
1.7.1本论文的选题依据
通过化学合成的产品有一定的毒副作用,而且在生产过程中会产生不必要的污染。
化学合成产品在化妆品、医药、食品领域的安全性也越来越备受人们的关注。
由于人们逐渐增强的追求绿色健康、回归自然的生活的观念,因此天然产物
逐渐受到人们的青睐与厚爱。
我国具有丰富的动植物资源,从动植物中提取的天然生物碱无毒安全,可用于食品、医药、化妆品等领域,这符合人们对于绿色健康的生活追求,将有很大的应用前景。
研究表明,黄连根茎含多种生物碱,主要成分为小檗碱,其次为黄连碱、甲基黄连碱、药根碱、非洲防己碱。
也含黄柏酮、黄柏内酯、阿魏酸等。
生物碱是黄连在生长过程中产生的次生代谢产物,通常以游离态或化合态的形式存在,不仅数量种类繁多,而且结构类型复杂多样,表现出多种多样的药理活性,具有抗炎抑菌、抗氧化、延缓衰老抗肿瘤以及增强免疫能力等药理作用。
近年来,世界上掀起了植物药开发的热潮,植物药以其天然低毒的特点倍受青睐,而生物碱类化合物更是以其广谱的药理作用备受世人瞩目。
本题目主要是对黄连生物碱的提取工艺条件进行优化,为黄连生物碱的开发和利用提供科学依据。
1.7.2本论文研究的主要内容
本文以市售黄连为原料提取生物碱,首先分别进行单因素试验,考查不同的提取溶剂、提取溶剂浓度、提取时间、提取温度、提取次数、料液比对黄连总生物碱得率的影响;
然后在单因素试验的基础上进行析因试验,筛选出显著性因
子;
最后结合单因素试验和析因试验确定Box-Benhnken响应面设计试验的因素
与水平[22]。
以黄连总生物碱得率为响应值,通过响应面分析及等高线分析对提取条件进行优化,在较优条件下进行提取,以提高黄连总生物碱的提取率,进而达到降低成本改进生产工艺的目的,为新药的开发提供新的参考资料,为黄连资源的有效利用提供理论依据。
2黄连总生物碱的提取工艺优化研究
2.1材料
2.1.1原料
黄连购自校医院,清洗干净,去除杂质,放在烘箱中80C进行烘干。
烘干
后在粉碎机中粉碎放入干燥洁净的密封袋中,密封保存。
2.1.2试剂
表2-1主要试剂
Table2-1Mainreagents
材料与试剂
级别
产地
氢氧化钠
分析纯
天津化学试剂厂
甲醇
乙酸乙酯
AR
天津市科密欧化学试剂有限公司
正丁醇
浓硫酸
浓盐酸
无水乙醇
蒸馏水
实验室自制
2.1.3仪器设备
表2-2试验仪器
Table2-2Experimentalinstrument
名称
型号
生产厂家
电子天平
BS-210S
北京塞多利斯天平有限公司
自动纯水蒸馏器
SZ-96
上海亚荣生化仪器厂
电热恒温干燥箱
CS101-A
北京市永光明医疗仪器厂
循环水式多用真空泵
SHB-ffi
郑州杜甫仪器厂
可见光分光光度计
UV-1100
上海精密仪器厂
恒温水浴锅
HH-S
巩义设备有限公司
旋转蒸发仪
RE-52AAB
双人单面净化工作台
SW-CJ-1CU
苏州净化设备有限公司
恒温振荡器
PYX-DHS-50X65-S
上海跃进医疗器械厂
2.2方法
2.2.1黄连总生物碱的提取
黄连生物碱溶解性因结构及存在状态的不同有很大差异,一般游离态缓溶于冷水(1:
20)和冷乙醇(1:
100),在热乙醇和热水中溶解度较大,难溶或不溶于氯仿、丙酮、乙醚和苯等有机溶剂。
其盐在冷水中溶解度较小,例如:
盐酸盐微溶于冷水(1:
500)、硫酸盐缓溶于冷水(1:
100),但在热水和热乙醇中溶解度较大。
考虑到乙醇更易浓缩且对黄连生物碱溶解性合适,因此选择乙醇加热恒温条件下震荡提取[23]0
2.2.2黄连总生物碱的检测
黄连生物碱均属异喹啉类季胺碱,其分子内含有相同的基团使各种黄连生物碱在350nm的紫外光下均有最大吸收峰,因此可以根据粗提取液在350nm下吸
光度的不同对照盐酸小檗碱标准曲线,确定浸提液中总生物碱的浓度,进而计算
出黄连总生物碱的得率[20]0
2.2.3盐酸小檗碱标准曲线的绘制
精密称取102C干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品2.81mg,于50mL容量瓶中
以蒸馏水摇匀定容,得浓度为0.0562mg/mL的盐酸小檗碱对照品溶液。
分别吸取盐酸小檗碱对照品溶液0,0.4,0.6,0.8,1.0,1.5,2.0,2.4,2.8,3.2,3.6mL于10mL量瓶中,以0.05moL/L硫酸水溶液定容至刻度,350nm测吸光度值。
以溶液浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,得回归方程y=0.0653x+0.0856
r=0.998(n=10),线性范围2.248-20.232ug/mL2」。
2.2.4黄连总生物碱得率的计算
根据黄连总生物碱含量标准曲线得出的回归方程y=0.0653x+0.0856,计算
提取液中的黄连总生物碱含量。
黄连总生物碱得率计算公式如下:
y0.0856
t=1000v
0.0653
t提取液中的黄连总生物碱含量(mg)
y――黄连总生物碱测定中提取物的吸光度
v――黄连提取液的体积(mL)
丫=丄
m
丫一一黄连总生物碱得率(mg/g)
t提取液中黄连总生物碱含量(mg)
m黄连粉末的质量(g)
225单因素试验
(1)不同提取溶剂对黄连总生物碱得率的影响
分别准确称取1.0g经过预处理的黄连粉末,控制料液比为1:
30,提取温度70C,提取时间1h,,提取1次,在不同的提取剂(蒸馏水,甲醇,70%乙醇,乙酸乙酯和正丁醇)条件下提取,测定提取液吸光值,并计算黄连总生物碱得率。
(2)乙醇浓度对黄连总生物碱得率的影响
分别准确称取1
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