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Pro在此反应中直接生成黄色化合物。
在570nm(蓝紫色)或440nm(黄色)定量测定(0.5-50μg/ml)
4、颜色反应
双缩脲反应:
2分子尿素(即脲)在NaOH、CuSO4溶液中加热反应得蓝紫色化合物,凡化合物中含有2个或以上肽键结构者都有此反应
考马斯亮蓝G-250:
本身为红色,与蛋白质反应呈蓝色。
与蛋白的亲和力强,灵敏度高1-1000μg/ml。
5、氨基酸蛋白质等电点概念及特点
氨基酸等电点:
当氨基酸溶液在某一定pH值时,使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等,成为两性/兼性离子,在电场中既不向阳极也不向阴极移动,此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelctricpoint)。
氨基酸pI的特点:
1.净电荷数等于零,在电场中不移动;
2.此时氨基酸的溶解度最小。
6、蛋白质结构层次、化学键
一级结构:
共价/初级结构,指AA在肽链中的排列顺序及AA连接成肽链的的共价键。
肽键是主要连接键,还包括二硫键。
二级结构:
指Pr分子中多肽链本身/主链借助氢键的折叠元件。
主要是有规则的α-螺旋、β-折叠结构元件,还有β-转角、无规卷曲等。
氢键维持其稳定性。
超二级结构:
在蛋白质中经常看到由若干个相邻的二级结构原件组合在一起,彼此相互作用,行程种类不多,有规则稳定的二级结构组合或二级结构串,成为超二级结构。
结构域:
含有数百个氨基酸残基的多肽链经常折叠成两个稳定的,相对独立的球状实体称为结构域。
三级结构:
指多肽链借助非共价键盘绕折叠成复杂的特定走向的空间结构,包括肽链中一切原子(包括侧链)的空间排列方式,即一条多肽链的完整三维结构.
四级结构:
指具有三级结构的亚基借助非共价键彼此缔合成大分子蛋白质。
化学键
7、
(1)蛋白质紫外吸收
AA的紫外吸收:
在可见光范围内无光吸收,在近紫外区含苯环AA有光的吸收;
蛋白质由于含有这些含苯环的氨基酸,所以也有紫外吸收能力,一般最大吸收在280nm波长处。
组成Pr的AA中Trp(280nm)、Tyr(275nm)、Phe(257nm)对紫外光有一定的吸收(分子中含有苯环的共轭双键造成的),且都在280nm附近。
(2)核酸的紫外吸收
嘌呤碱和嘧啶碱都含有共轭双键体系,在260nm有最高吸收峰;
可作为核酸变性和复性的指标:
当核酸变性或降解时光吸收值显著增加(增色效应),但核酸复性后,光吸收值又回复到原有水平(减色效应)。
8、蛋白质变性复性
蛋白质变性:
在某些物理或化学因素的作用下,蛋白质严格的空间结构(二三四级的高级结构)被破坏(其实质是非共价键受到破坏,不涉及肽键的断裂),引起蛋白质若干理化性质改变并导致其生物功能的丢失,称为蛋白质的变性。
变性蛋白质的空间结构由折叠态变为伸展态。
蛋白质复性:
除去变性因素,无活性伸展的蛋白质进入有利于折叠的最适环境里,则伸展的肽链就会自动折叠成天然的折叠肽,并恢复全部活性。
引起蛋白质变性的因素有:
①物理因素:
高温/加热、高压、紫外线、超声波等
②化学因素:
强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等
常见变性剂:
尿素、盐酸胍、SDS
蛋白质变性的原理:
1、热变性,分子内能增加
2、pH改变破坏蛋白质颗粒之间的静电作用
3、表面活性剂破坏蛋白质分子内疏水作用抢夺、破坏蛋白质内部的氢键
变性蛋白质立体/空间结构受到破坏,肽链伸展开。
可逆变性:
在适当条件下,蛋白质构象由变性状态恢复到天然状态(复性)
不可逆变性:
除去变性因素后,蛋白质构象不能由变性状态恢复到天然状态
二、酶
1、酶:
由活细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊蛋白质或核酸—由活细胞产生的生物催化剂。
2、分类(顺序不要错)
氧化还原酶:
(1)氧化酶类:
催化底物脱氢并氧化生成H2O2或H2O,如细胞色素c氧化酶催化底物脱氢并氧化生成水
(2)脱氢酶类:
催化直接从底物上脱氢的反应,如乳酸脱氢酶,琥珀酸脱氢酶等
转移酶:
催化基团转移反应,即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。
如谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。
水解酶:
催化底物的水解反应。
主要有淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及酯酶等
裂合酶:
裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子而形成双键的反应及其逆反应
主要包括醛缩酶、水合酶、脱氨酶等
延胡索酸水合酶催化的反应
异构酶:
异构酶催化各种同分异构体的相互转化,即底物分子内基团或原子的重排过程。
连接/合成酶:
连接酶(合成酶)能够催化C-C、C-O、C-N及C-S等键的形成,必须有ATP的参加
3、酶表的四个数字
4、米氏常数和米氏方程
把v=Vmax/2代入米氏方程
得:
km=[S]
Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度
5、竞争性、非竞争性、反竞争性抑制剂画图及其特点(见书本)
6、酶的活性中心:
酶分子中直接与底物结合,并和酶催化作用直接有关的部位
酶专一性:
酶对所作用的底物和所催化的反应具有严格的选择性,称为酶的专一性.
三:
维生素和辅酶
1、维生素的概念:
是维持生物生长发育和代谢所必需的一类微量的小分子有机物质。
2、水溶性维生素和辅酶(记住5-6种以上,包括功能)
维生素B1和硫胺素焦磷酸生物素/VB7
维生素B2和黄素辅酶叶酸/VB11和四氢叶酸
维生素PP/VB5和烟酰胺辅酶维生素B12及其辅酶
泛酸/VB3和辅酶A硫辛酸
维生素B6和磷酸吡哆醇、醛、胺维生素C
3、维生素缺乏症
四、核酸
1、结构组成:
2、重要化学键:
糖与碱基:
糖苷键核苷酸与核苷酸:
3,5磷酸二酯键
3、DNA二级结构要点及稳定因素
(1)主链:
脱氧核糖和磷酸基通过3′5′—磷酸二酯键连接成为螺旋的骨架,两条主链以反平行的方式组成右手螺旋;
主链处于螺旋外侧,这是由核糖和磷酸的亲水性所决定的;
核糖平面与螺旋轴平行,碱基则处于螺旋的内侧
(2)直径与螺距:
螺旋的直径为2nm;
螺距(双螺旋链中的任意一条链绕轴一周所升降的距离)为3.4nm,其中包含10个核苷酸,因此每两个相邻碱基平面的垂直距离(碱基堆积距离)0.34nm,相对于螺旋轴移动36°
。
(3)由于双螺旋结构要求有一个正常的螺旋形式,就必须按碱基互补的原则进行碱基配对;
嘌呤环和嘧啶环上的氨基和酮基是亲水的,配对的碱基之间能够形成氢键;
而嘌呤环和嘧啶环本身都是疏水的,因而同一条链中的相邻碱基能够形成一种碱基堆积力;
这两种力的协同作用就维持了双螺旋结构的稳定性
(4)两条主链和碱基并不充满双螺旋的空间,其表面形成两条凹槽,一条宽而深为大沟;
一条狭而浅为小沟。
特别是大沟,对于Pr识别DNA双螺旋结构上的特定信息是非常重要的。
因为只有在沟内,Pr才能“感觉”到不同碱基顺序,而在双螺旋的表面全是相同的磷酸和脱氧核糖的骨架,是没有什么信息可言的
稳定因素:
氢键、碱基堆积力,磷酸基上负电荷被屏蔽,碱基处于疏水环境
4、tRNA二级结构要点
单链、四叶草形、四臂四环(氨基酸臂,D臂,反密码子臂,TψC臂,D环,反密码子环,可变环,TψC环)
5、核酸物理性质
变性:
双螺旋区氢键断裂,空间结构破坏,形成单链无规则线团状,其实质为只涉及次级键(氢键)的破坏,增色效应但分子量不变
熔解温度:
DNA热变性是个突变过程,将紫外吸收的增加量达到最大增量一半时的温度称熔解温度。
核酸的复性:
变性核酸的互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程。
对于热变性的DNA在缓慢冷却的条件下可重新结合恢复双螺旋结构,称为退火
分子杂交:
在退火条件下,不同来源的DNA互补区形成DNA-DNA新链,或DNA单链和RNA链的互补区形成DNA-RNA杂合双链的过程。
生物氧化和糖代谢
1、糖酵解:
在无氧的条件下,葡萄糖或糖原分解成丙酮酸,并释放少量能量的过程称为糖的无氧分解。
这一过程与酵母菌使糖发酵的过程相似,又称为糖酵解,简称EMP途径。
生物氧化的概念:
物质在体内的氧化分解过程,主要是糖、脂、蛋白质等在体内分解时最终生成CO2和H2O并逐步释放能量的过程
氧化(电子传递体系)磷酸化:
伴随电子从NADH或FADH2呼吸链传递给氧形成水,同时有ADP磷酸化为ATP。
在线粒体内膜上进行。
光合磷酸化:
由光照引起的电子传递与磷酸化作用相偶联而生成ATP的过程。
2、电子传递链(ETC)/呼吸链(RC):
代谢物的氢原子被脱氢酶激活脱落后,经过一系列的传递体,最后传递给被激活的氧分子而生成水的全部体系。
与ATP的生成相偶联。
分为NADH呼吸链和FADH2呼吸链。
复合物2不能偶合生成ATP。
3、19步反应(注明酶,二氧化碳,ATP,呼吸链)
4、糖异生:
由非糖物质转变为葡萄糖或糖原的过程,称为(葡)糖异生作用
主要原料:
甘油,乳酸,氨基酸
调节酶:
果糖-1,6-二磷酸(酯)酶,葡萄糖-6-磷酸(酯)酶,PEP羧激酶,丙酮酸羧化酶。
针对丙酮酸的是丙酮酸羧化酶和PEP羧激酶
(葡)糖异生的部位:
主要在肝脏,其次是肾脏,主要在肝、肾细胞的线粒体及胞液(细胞质)
5、戊糖磷酸途径:
氧化阶段:
氧化阶段由葡萄糖-6-磷酸直接脱氢脱羧生成磷酸戊糖;
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是HMP限速酶,其活性决定葡萄糖-6-磷酸进入此途径的流量,此酶活性主要受NADP+/NADPH比例的调节,NADP+浓度稍高于NADPH即激活此途径,此酶尤其受NADPH强烈抑制,只有NADPH被生物合成消耗后,才能解除抑制。
NADP+为其辅酶。
最重要的生理意义:
HMP途径进行糖分解生成还原辅酶Ⅱ(NADPH)——是细胞产生还原力的主要途径,可以供给组织中合成代谢的需要,如脂肪酸长链的生物合成,固醇类化合物的生物合成。
6、糖原合成调节酶:
糖原合酶
7、糖原降解调节酶:
磷酸化酶
8、细胞质NADH再氧化:
胞液/胞质中的NADH的再氧化:
胞质/胞液内的NADH不能透过线粒体内膜进入线粒体基质氧化磷酸化,必须通过穿梭作用来解决其再氧化的问题。
(一)甘油-3-磷酸穿梭系统
主要存在于脑和骨骼肌中。
NADH通过此穿梭系统带一对氢原子进入线粒体,再经FADH呼吸链进行氧化磷酸化,故只能产生1.5分子ATP。
(二)苹果酸-天冬氨酸穿梭系统
主要存在于肝和心肌中。
胞液中NADH+H+的一对氢原子经此穿梭系统带入,再经NADH氧化呼吸链进行氧化磷酸化,故可生成2.5分子ATP。
脂代谢
1、脂肪酸β-氧化:
脂肪酸在体内氧化时在羧基端的β-碳原子上进行氧化,碳链逐次断裂,每次断下一个2碳单位以乙酰CoA释放——β-氧化。
2、酮体:
组成:
乙酰乙酸、β-羟丁酸、丙酮
肝脏合成,肝外组织分解
3、β-氧化和生物合成的区别
4、能量计算
脂肪酸β-氧化最终产物为乙酰CoA、NADH和FADH2。
Cn的脂肪酸进行β-氧化,需要(n/2-1)次循环才能完全分解为n/2个乙酰CoA,产生n/2-1个NADH和n/2-1个FADH2;
生成的乙酰CoA通过TCA彻底氧化并释放能量,NADH和FADH2则通过呼吸链生成ATP:
n/2×
10+(n/2-1)×
(2.5+1.5)-2
蛋白质和氨基酸代谢
1、转氨反应:
在转氨酶的催化下,α-氨基酸的氨基转移到α-酮酸的酮基碳原子上,结果原来的α-氨基酸生成相应的α-酮酸,而原来的α-酮酸则形成了相应的α-氨基酸,这种作用称为转氨基作用或氨基移换作用。
转氨酶辅酶都是磷酸吡哆醛
2、两种转氨酶反应式(PPT)
3、接受氨基的主要酮酸:
丙酮酸a-酮戊二酸草酰乙酸
4、尿素循环:
肝脏生成肾脏排出,合成1分子尿素需1CO2、2NH3(CN的来源)
5、尿素循环
◆主要器官:
肝脏胞液和线粒体中合成,肾脏排泄
◆原料:
合成1分子尿素需1CO2、2NH3(其中1分子来自于Asp)、3ATP的4个高能磷酸键
复制转录翻译(概念,方向,过程,酶)
1.复制:
DNA在复制时,两条链解开分别作为模板,在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链,以组成新的DNA分子。
方向:
5′→3′
过程:
半保留复制,半不连续复制
•在原核生物中目前发现DNA聚合酶有三种,分别命名为DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ),DNA聚合酶Ⅱ(polⅡ),DNA聚合酶Ⅲ(polⅢ),这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。
DNA聚合酶Ⅲ把新生链的第一个脱氧核苷酸加到引物的3′—OH上,开始新生链的合成过程。
DNA聚合酶Ⅰ利用5′→3′外切酶活性水解引物
•DNA聚合酶Ⅰ聚合活性填补缺口
参与DNA复制的主要是DNA聚合酶Ⅲ和DNA聚合酶Ⅰ
以3′→5′方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的,其子代链的聚合方向为5′→3′,这一条链被称为前导链。
后随链是不连续合成的,DNA在复制时,由后随链所形成的一些子代DNA不连续的短片段称为冈崎片段(Okazakifragment)。
2、转录:
转录是在DNA的指导下的RNA聚合酶的催化下,按照碱基配对的原则,以四种NTP为原料合成一条与模板DNA互补的RNA的过程。
RNA的转录从DNA模板的特定位点开始,并在一定的位点终止。
此转录区域为一个转录单位。
方向:
过程:
(连续性,单向性)识别、起始、延伸、终止
RNA聚合酶
3、翻译:
基因的遗传信息在转录过程中从DNA转移到mRNA,再由mRNA将这种遗传信息表达为蛋白质中氨基酸顺序的过程叫做翻译。
合成方向:
N→C端
合成体系:
20种氨基酸、mRNA、tRNA、核糖体、酶和因子、无机离子、ATP、GTP
N-C
消耗能量:
ATPGTP
起始:
(消耗ATP)
延伸:
进位(GTP)、成肽(不需要)、移位(GTP)
终止、释放
终止信号:
UAG、UAA、UGA
起始信号:
AUG
概念补充:
(1)电泳:
液体介质中带电的胶体微粒在外电场作用下相对液体的迁移现象。
(2)构象:
指在一定条件下,由于单键的旋转而产生的分子中各原子在空间的不同排布形象。
(3)两性离子:
当氨基酸溶液在某一定pH值时,使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等,成为两性/兼性离子
(4)多酶体系:
在完整细胞内的某一代谢过程中,由几个酶形成的反应链体系统。
(5)酶原激活:
没有活性的酶的前体称为酶原。
酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活——实质是酶活性部位形成或暴露的过程,包括一个或几个肽键的不可逆水解。
(6)同工酶:
能催化相同的化学反应,但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶
(7)多聚核糖体:
在蛋白质合成过程中,同一条mRNA分子能够同多个核糖体结合,同时合成若干条蛋白质多肽链,结合在同一条mRNA上的核糖体。
(8)米氏常数:
Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
(9)限速酶:
指整条代谢通路中,催化反应最慢的酶,它不但可以影响整条代谢的总速度,还可以改变代谢方向,是代谢途径的关键酶
(10)鸟氨酸循环:
在排尿动物体内由NH3合成尿素是在肝脏中通过一个循环机制完成的,称为尿素/鸟氨酸循环。
(11)诱导契合学说:
在两者结合的过程中,E或S分子或两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的,催化基团的位置正好在所催化底物键的断裂和即将生成键的合适位置。
简答
RNA转录过程:
①.起始位点的识别:
σ识别正确的启动位点(启动子——一段保守DNA序列位于基因上游,是RNA聚合酶结合并开始转录的位置,-35区、-10区、+1)并形成复合物,使局部DNA结构松散,打开17bp暴露出DNA模板链,有利于RNA聚合酶进入转录泡②.转录起始:
转录起始不需要引物,加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP。
第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点到合成几个核苷酸,σ亚基释放脱离核心酶。
③.链的延伸:
以NTP为原料和能量,DNA模板链为模板,靠核心酶催化,核苷酸间通过3´
5´
-磷酸二酯键形成核糖核酸链(RNA)④.转录终止:
终止子和ρ因子
终止子:
具有一段富含G-C的回文区域,转录生成的RNA链可形成发夹结构,影响RNA聚合酶的行进使转录终止
ρ因子:
当RNA聚合酶移动至终止子部位时,ρ因子与其结合使转录终止。
三羧酸循环的生物学功能:
(1)氧化供能(线粒体内/外NADH、FADH2)
(2)为生物合成提供了中间物,是三大营养素相互转变的联系枢纽
TCA不仅是糖代谢的重要途径,而且也是脂类化合物和蛋白质最终氧化成CO2和H2O重要途径,是三大营养素分解的最终代谢通路(3)TCA也是CO2的重要来源之一。
(47)DNA的复制过程:
拓扑异构酶与DNA双链结合,松弛超螺旋。
解链酶解开DNA双螺旋单链结合蛋白防止复螺旋引物酶合成引物。
1.DNA聚合酶Ⅲ把新生链的第一个脱氧核苷酸加到引物的3′—OH上,开始新生链的合成过程组成DNA的脱氧核糖核苷酸一个个连接起来。
终止:
遇到终止子停止复制DNA聚合酶Ⅰ利用5′→3′外切酶活性水解引物DNA聚合酶Ⅰ聚合活性填补缺口DNA连接酶连接缺口。
(48)蛋白质的变性作用:
(49)引起蛋白质变性的因素:
高温/加热、高压、紫外线、超声波等②化学因素:
强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等常见变性剂:
(50)化学渗透假说:
①传氢体和电子传递体间隔交替排列,特定位置,催化反应定向②传氢体有氢泵作用:
传氢体在线粒体内膜内侧接受从底物传来的2H将其中的2e传给其后的电子传递体,而将2H+泵出内膜③H+的跨膜梯度形成:
偶联了电子传递和氧化磷酸化作用④利用ATP合酶,H+发生逆向回流,跨膜(电化学)梯度消失,释放的自由能偶联ADP和Pi合成ATP
(51)蛋白质合成过程:
基因的遗传信息在转录过程中从DNA转移到mRNA,再由mRNA将这种遗传信息表达为蛋白质中氨基酸顺序的过程。
(52)维持一级结构作用力是肽键,二硫键。
维持二级结构作用力:
氢键;
维持三级结构:
二硫键、疏水作用、氢键、离子键、范德华力;
维持四级结构:
疏水作用(最主要)、氢键、离子键、范德华力、配位键。
(53)米氏方程:
V=Vmax·
[S]/(Km+[S])
(54)竞争性抑制作用:
抑制剂和底物竞争与酶结合表观Km增大但Vmax不变抑制作用可解除。
(55)非竞争性抑制作用:
底物和抑制剂同时与酶结合,但形成的EIS不能进一步转变为产物。
Vmax变小但Km不变抑制不能解除。
(56)反竞争性抑制作用:
抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成ESI复合物。
常见于多底物反应中Km和Vmax都变小,不能用增加底物浓度的方法来解除抑制。
(57)DNA二级结构的特点:
主链:
核糖平面与螺旋轴平行,碱基则处于螺旋的内侧。
直径与螺距:
碱基对:
由于双螺旋结构要求有一个正常的螺旋形式,就必须按碱基互补的原则进行碱基配对;
这两种力的协同作用就维持了双螺旋结构的稳定性。
大沟小沟:
两条主链和碱基并不充满双螺旋的空间,其表面形成两条凹槽,一条宽而深为大沟;
因为只有在沟内,Pr才能“感觉”到不同碱基顺序,而在双螺旋的表面全是相同的磷酸和脱氧核糖的骨架,是没有什么信息可言的。
(58)tRNA的二级结构特点:
单链三叶草叶形四臂四环:
1.氨基酸臂3′端有CCAOH的共有结构,与转运的Aa形成酯键;
2.D环有二氢尿嘧啶(D/DHU),氨酰-tRNA合成酶的结合位点;
3.反密码子环的反密码子与mRNA相互作用4.可变环上的核苷酸数目可以变动,决定tRNA分子大小;
5.TψC环含有T和ψ,与核糖体结合位点;
6.含有修饰碱基和不变核苷酸。
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