抗生素微生物检定法Word格式.docx

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检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140~160℃干热灭菌2小时后备用。

陶瓦圆盖：

应平，无凹凸现象。

不锈钢小管：

外径±

，内径±

，高±

，重量差异不超过±

25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。

（4） 

小钢管放置器：

四孔和六孔各一台。

（5） 

游标卡尺：

精密度。

（6） 

滴管：

管口应细长平滑，不得有缺口。

3. 

试验材料

培养基及其制备方法

以下培养基、缓冲液制备时，均以115℃灭菌30分钟。

培养基 

Ⅰ

胨 

5g 

磷酸氢二钾 

3g 

水 

1000ml

牛肉浸出粉 

琼脂 

15~20g

除琼脂外，混合上述成分，调节PH使比最终的PH值略高~，加入琼脂，加热溶化后滤过（用纸浆减压滤过或纱布棉花滤过），调节PH值使灭菌后为~或~，分装，灭菌。

培养基 

Ⅱ

6g 

酵母浸出粉 

葡萄糖 

1g 

除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节PH使比最终的PH值略高~，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为~或~，分装，灭菌。

Ⅲ

氯化钠 

1g

酵母浸出粉 

磷酸二氢钾 

除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为~，分装，灭菌。

Ⅳ

葡萄糖 

琼脂 

15~20g

除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节PH使其比最终的PH值略高~，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为~，分装，灭菌，趁热斜放使凝固成斜面。

Ⅴ

6g 

2g 

除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节PH使其比最终的PH值略高~，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为~，分装，灭菌。

Ⅵ

蛋白胨 

牛肉浸出粉 

酵母膏 

除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节ＰＨ值使灭菌后为，分装，灭菌。

营养琼脂培养基

10g 

15~20g 

5g

肉浸液 

1000ml（牛肉浸出粉3g,加水1000ml，配成溶液代替）

除琼脂外，混合上述成分，调节PH使比最终的PH值略高～，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节PH值使灭菌后为～，分装，灭菌，趁热斜放使凝固成斜面。

改良马丁琼脂培养基

硫酸镁 

15～20g 

除葡萄糖和琼脂外，混合上述成分，微温溶解，调节PH值约为，加入琼脂，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖溶解后，摇匀，调节PH值使灭菌后为±

，分装，灭菌，趁热斜放使凝固成斜面。

培养基可以采用相同成分的干燥培养基代替，临用时，照使用说明配制和灭菌，备用。

注意事项：

①制备培养基的原材料，特别是胨、牛肉浸膏和琼脂等对抑菌圈的大小与边缘的清晰度有影响，故应预先进行试验，挑选使用。

②不得在操作抗生素的实验室内配制培养基。

配制培养基所用的器皿应与接触抗生素的器皿严格分开，以免污染抗生素。

③培养基中的琼脂用量要随气候冷暖不同而增减。

一般夏季用琼脂的量比冬季多，其用量多少以培养基的硬度适宜为度。

④培养基在加热煮沸后所蒸发的水分必须用蒸馏水补足。

⑤培养基灭菌后，应放于37℃培养箱中培养24～48小时,证明无菌后方可使用。

使用期限约为1个月，不宜保存过久，以免营养价值降低。

⑥制成的培养基倒入双碟内凝固后应透明，不得有沉淀。

缓冲液

磷酸盐缓冲液（）：

取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml,滤过，

分装，灭菌。

曲磷酸氢二钠与磷酸二氢钾,加水使成1000ml，

滤过，分装，灭菌。

取磷酸氢二钾与磷酸二氢钾，加水使成1000ml，

[附注]配制缓冲液所用化学试剂的规格应为分析纯试剂。

（3）试验用菌种：

试验用菌种对被测定的抗生素应具有高度的敏感性，在一般培养基上能生长繁殖，易于保存，不应变异或变异性小，无致病性，具有敏锐的生化培养特性，能适合多种抗生素的检定，最好是芽胞菌，因芽胞菌制备成悬液易于保存，不易变异，使用时间长。

①试验用菌种的保存：

卫生部药品生物制品检定所提供的菌种为冷冻干燥菌种，可保存在5℃的冰箱内。

以无菌操作启开冻干菌种，接种在普通琼脂斜面上，置37℃培养箱中培养20～22小时。

取出放至室温后，放入5℃冰箱中保存，即为试验用菌种。

试验用菌种每月传代一次，每季度平板分离一次。

②菌种的接种方法：

从冰箱中取出菌种1支，放至室温。

另取新鲜制备的普通琼脂斜面1支（如琼脂斜面已干燥无凝结水者，则不可使用），注明菌名、接种日期，与菌种斜面一同放于预先用1‰新洁尔灭溶液擦拭过，并用紫外线灯照射30分钟后的工作台上（或超净工作台内）。

操作人员用新洁尔灭溶液洗手，然后按无菌操作要求开始接种。

先将菌种斜面和待接种的培养基斜面试管口上的棉花塞通过酒精灯火焰稍稍扭动一下，以免接种时不易拔出棉塞。

用左手握住菌种斜面和待接种的培养基斜面，将试管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，在火焰上将接种环烧红约30秒钟，然后将全部金属棒通过火焰往返3次，用右手无名指及小指同时将菌种斜面和待接种的培养基斜面试管口的棉塞拔出，并将两支试管口在火焰上通过一下，立即将接种环伸入菌种斜面管内，先在近管壁的琼脂培养基表面上靠一下，使稍冷却，再移至菌苔上刮取少量菌苔，迅速将接种棒取出，并立即伸入到待接种的培养基斜面管内，由下至上在培养基斜面上轻轻曲折移动1次，取出接种棒，立即在火焰旁将原来的棉塞塞上，然后将接种棒上的残余细菌在火焰上烧灼，烧灼时应先将接种环离沾菌处的远端烧灼，使其传热至沾菌处，待菌苔已枯焦、炭化后，才能直接烧灼，切不可直接猛火烧灼沾菌处，以防细菌溅出。

接种完毕后，将细菌管置37℃培养箱内培养22～24小时（霉菌管一般置26～27℃培养箱内培养7天）。

取出放冷至室温后，放入5℃冰箱中保存。

③试验用菌液的制备和保存

枯草芽孢杆菌悬液 

取枯草芽胞杆菌[CMCC（B）63501或CVCC717]的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。

用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。

（取枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]试验用菌种斜面1支，按无菌操作要求加入灭菌水2ml，将菌苔洗下，摇匀，取出1ml接种于盛有30ml普通琼脂培养基的100ml三角瓶中，旋转三角瓶使全部琼脂培养基表面被菌液浸润，多余的菌液用吸管吸出弃入5%石炭酸消毒液中。

将已接种的三角瓶置35～37℃的培养箱中培养7～10天，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml洗下芽孢，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得。

置5℃冰箱中保存，可使用6个月。

）

短小芽孢杆菌悬液 

取短小芽孢杆菌[CMCC（B）63202或CVCC709]的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。

金黄色葡萄球菌悬液 

取金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003或CVCC1882]的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。

临用时，用灭菌水或%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

（取金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]试验用菌种斜面1支，用接种棒取培养物接种至10ml培养基Ⅲ中，接种时在靠近培养基液面的试管壁上摩擦，使菌苔均匀混悬于液体培养基中，在35～37℃培养箱中培养16～18小时，取出，应成均匀的悬液，无菌膜及凝集沉淀，此菌液仅供当日使用。

藤黄微球菌（藤黄八叠球菌）悬液 

取藤黄微球菌[CMCC（B）28001或CVCC1600]德营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。

（取藤黄八叠球菌[CMCC（B）28001]试验菌种斜面1支，加入2ml培养基Ⅲ，将菌苔洗下，摇匀，取出1ml接种于盛有30ml普通琼脂培养基的100ml三角瓶中，旋转三角瓶使全部琼脂培养基表面被菌液浸润，多余的菌液用吸管吸出弃入5%石炭酸消毒液中，将已接种的三角瓶置26～27℃培养箱中培养24小时，用5ml培养基Ⅲ将菌苔洗下制成均匀的悬液。

此悬液在5℃冰箱中保存可使用1个月。

大肠杆菌悬液 

取大肠杆菌[CMCC（B）44103或CVCC2801]的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。

临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。

双碟的制备：

取直径约90mm、高16～17mm的平底双碟，用灭菌大口吸管

分别注入加热融化的培养基20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。

另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入规定的试验菌悬液适量（能得到清晰的抑菌圈为度。

二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm），充分摇匀，用灭菌大口吸管在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。

放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径±

，外径±

）4个（二剂量法）或6个（三剂量法），用陶瓦圆盖覆盖备用。

抗生素微生物检定试验设计表

抗生素类别

试验菌

培养基

灭菌缓冲液

PH值

抗生素浓度范围

单位/ml

培养条件

编号

温度/℃

时间/小时

链霉素

枯草芽孢杆菌[CMCCB（B）63501或CVCC717]

Ⅰ

～

35～37

14～16

卡那霉素

吉他霉素

Ⅱ①

16～18

安普霉素

盐霉素

短小芽孢杆菌[CMCC（B）63202或CVCC709]

Ⅳ

庆大霉素

红霉素

新霉素

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003或CVCC1882]

Ⅱ

②

青霉素③

四环素

藤黄微球菌[CMCC（B）28001或CVCC1600]

土霉素

金霉素

多西环素

杆菌肽

林可霉素

泰乐菌素

大观菌素

大肠杆菌[CMCC（B）44103或CVCC2801]

Ⅴ

① 

加%葡萄糖。

② 

此缓冲液含3%氯化钠。

③ 

系指普鲁卡因青霉素注射液。

补充：

丁胺卡那霉素

枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]

巴龙霉素

卷曲霉素

碘苄青霉素

去甲万古霉素

Ⅷ

头孢噻肟钠

枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]63

Ⅶ

头孢羟氨苄

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]

脱氧土霉素

藤黄八叠球菌[CMCC（B）28001]

氯霉素

克林霉素

粘霉素

大肠杆菌[CMCC（B）44103]

Ⅵ

614～2344

[附注]

抑菌圈大小预测试验方法：

取双碟6个，分为3组，每组2个，分别加入已融化的琼脂培养基20ml，用陶瓦圆盖覆盖，待凝固后，作为底层培养基置37℃培养箱中保温。

另取已融化的琼脂培养基分装于3支大试管中，每支分装20ml。

将大试管置恒温水浴中放冷至表1中规定各试验菌的控制温度，分别加入不同量的菌液，制成3种不同浓度的菌层培养基，摇匀，分别吸取3种浓度的菌层培养基各5ml，均匀地摊布在3组底层培养基上，每组双碟用一种浓度的菌层培养基。

然后按一剂量法、二剂量法或三剂量法用所欲测定抗生素的标准品溶液测定。

测量各组双碟抑菌圈的直径，选择抑菌圈直径合适（一剂量法标准品溶液的中心浓度所产生的抑菌圈直径应为15～18mm；

二剂量法标准品溶液的高剂量所产生的抑菌圈直径应为18～24mm；

三剂量法标准品溶液的中剂量所产生的抑菌圈直径应为15～18mm）的菌层浓度进行效价测定。

表1 

菌层培养基的控制温度

试验用菌种 

菌层培养基温度℃

芽孢悬液

60

大肠杆菌菌液

48

金黄色葡萄球菌菌液

48～50

藤黄八叠球菌菌液

啤酒酵母菌悬液

影响效价测定的因素

1.试验菌种：

当试验菌种中含有对抗生素敏感度不同的两种或两种以上的菌株时，由于各菌株的最低抑菌浓度不同，在形成抑菌圈时可能出现双圈及边缘模糊不清，影响测量抑菌圈的准确度。

因此，应定期将试验菌种进行平板分离，经涂片镜检后，挑选典型的单个菌落作为工作用菌种。

陈旧的试验菌培养物也会使抑菌圈边缘模糊，故试验时应用新鲜制备的试验菌液。

2.培养基：

培养基的质量对抑菌圈的大小和清晰度都有影响，故对配制培养基用的几种主要原材料如胨、牛肉膏、酵母膏及琼脂等都应通过预试验选择适宜的品种使用。

琼脂的使用量须随季节不同加以调整，使培养基的硬度合适，太软小钢管容易下陷，太硬容易造成抗生素溶液从小钢管底部漏出，可使抑菌圈破裂。

3.双碟的制备：

铺双碟底层培养基时，培养基的温度不宜过高，一般将融化后的培养基在室温冷至约70℃时加入双碟中为宜，否则加双碟盖后，底层培养基上会出现冷凝水。

当铺菌层培养基时，由于冷凝水的局部冷却和稀释作用，可使菌层培养基凝固后表面不平。

菌层培养基一定要铺均匀，这是决定抗生素效价测定的关键。

故要求铺菌层时一定要与铺底层时双碟的位置、方向相一致。

制备菌层时，培养基的温度不要过高，受热时间也不宜过长，特别是一些对热敏感的试验菌更要注意。

否则，可使试验菌部分或全部被杀死，导致抑菌圈破裂或甚至无抑菌圈形成。

因此，一定要按规定控制菌层培养基的温度。

在双碟培养基上放置小钢管的距离要合适。

当距离太小而抑菌圈又太大时，则相邻两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中抗生素的浓度增大，形成互相影响的卵圆形或椭圆形抑菌圈。

在滴加抗生素溶液至小钢管时，若毛细滴管口不圆整或有小缺口，或管内有气泡，均可使抗生素溶液从管口溅出；

若加液太满，溶液会从小钢管口溢出；

小钢管底部不平，溶液会从底部漏出。

以上原因均会造成抑菌圈不圆整或破裂成桃形。

防止的办法是滴管口要圆整，管口不能太细，管内不能有气泡，加液时滴管口离校钢管的距离不能太高，小钢管两端面要平。

4.双碟的培养温度和时间：

培养箱的温度要均匀，每组双碟要放在同一层盘内，在培养过程中，不要开启培养箱，以免影响培养箱内的温度。

双碟的培养时间也与抑菌圈的清晰度有关，如用藤黄八叠球菌作试验菌种测定土霉素、四环素等效价时，在37℃培养16小时后，又是抑菌圈边缘不清晰，可继续培养一段时间，抑菌圈边缘的菌群继续生长并产生色素，则可使抑菌圈逐渐变清晰。

5.抗生素污染：

无抑菌圈形成的原因，大多由于抗生素污染所致。

因此，在进行抗生素效价测定时，要严防抗生素污染。

防止的办法是将配置和稀释抗生素溶液所用的容器与制备培养基所用的容器严格分开，切不可将抗生素溶液撒于地面，以免抗生素附着在微小尘埃上随风飘落在双碟琼脂培养基上，而造成抑菌圈破裂或无抑菌圈形成。

6.标准品：

抗生素微生物检定发的实验设计师采用标准品与供试品对比试验的平行线原理。

因此，要求标准品与供试品必须是同质的抗生素。

如标准品与供试品所含的活性物质不同，则标准品和供试品德两条剂量反应线不成平行直线关系，就不能按平行线原理供试计算效价。

各种抗生素都有它同质的标准品，决不能用这一型抗生素组分制备的标准品，去测定另一型抗生素的供试品。