药代动力学实验指导定稿版Word格式.docx

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故胃肠道中的药物浓度（CGI）远大于血中药物浓度（C），则上式可简化为：

上式表明药物被动转运（简单扩散）透过细胞膜的速度与吸收部位药物浓度的一次方成正比，表明被动转运速度符合表观一级速度过程。

若以消化液中药量（Xa）的变化速度（

）表示透过速度，则：

式中，ka为药物的表观一级吸收速度常数。

对上式积分后两边取对数：

式中，Xa为t时间消化液中药量；

X0为零时间消化液中药量。

以lgXa对t作图可得一直线，由此直线斜率即可求出药物的吸收速度常数，并可计算吸收半衰期：

本实验以磺胺嘧啶为模型药物，进行大鼠在体小肠吸收试验。

三、仪器与材料

仪器：

蠕动泵、紫外-可见分光光度计、恒温水浴、离心机、注射器、眼科剪刀、眼科镊子、手术刀片等。

材料：

0.1%亚硝酸钠、0.5%氨基磺酸铵、0.1%二盐酸萘乙二胺溶液、1mol/L盐酸溶液、0.2mol/L氢氧化钠溶液、10mg/ml戊巴比妥钠溶液、生理盐水等。

四、实验内容

（一）试剂的配制

1．Krebs-Ringer试剂（pH7.4）称取氯化钠7.8g，氯化钾0.35g，氯化钙0.37g，碳酸氢钠1.37g，磷酸二氢钠0.32g，氯化镁0.02g，葡萄糖1.4g，加蒸馏水定容至1000ml。

2．供试液精密称取磺胺嘧啶（SD）20mg，酚红20mg，加少量蒸馏水混悬，加入1%碳酸钠溶液使溶解，再用Krebs-Ringer试剂定容至1000ml，摇匀。

3．酚红液精密称取酚红20mg，加少量蒸馏水混悬，加入1%碳酸钠溶液使溶解，再用Krebs-Ringer试剂定容至1000ml，摇匀。

（二）实验步骤

1．蠕动泵流速的调节打开蠕动泵电源，选择所需工作的方向，按动快、慢档开关，调节流速为5ml/min和2.5ml/min。

2．恒温水浴调节将水浴温度调节为37℃±

0.5℃。

3．供试液的准备取80ml供试液加入循环装置的烧瓶中，见图19-1，将烧瓶置恒温水浴中预热至37℃±

4．生理盐水的准备取生理盐水适量，预热至37℃备用。

5．大鼠麻醉取实验前禁食一夜、体重约200g的雄性大鼠一只，称重；

腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为40mg/kg），麻醉后背位固定于固定台上。

6．小肠插管沿腹中线打开腹腔（约3cm）。

自十二指肠上部及回肠下部各剪开一个小口，插入直径约0.3cm的玻璃管，用线扎紧。

7．洗涤肠管用注射器将37℃的生理盐水缓缓注入肠管，洗净肠管内容物。

8．做成回路将肠管两端的玻璃管按图19-1所示与胶管连接，作成回路，开动蠕动泵，流速为5ml/min。

9．取样以5ml/min的流速循环10min后，将流速调至2.5ml/min，立即自供试液烧瓶中取样两份（1ml和0.5ml各一份），分别作为SD和酚红零时间样品，另向烧瓶中补加2ml酚红溶液；

其后每隔15min按同法取样并补加酚红液，取样至120min（共9次），停止循环。

图19-1

大鼠在体小肠回流实验装置

1.蠕动泵；

2.温度计；

3.水浴；

4.循环液；

5.大鼠

（三）含量测定

1．标准曲线的制备

（1）制备SD标准曲线吸取SD供试液（20μg/ml）2、4、6、8、10ml分别置10ml量瓶中，用Krebs-Ringer试剂定容。

再分别吸取上液1ml置10ml具塞试管中，加1mol/L盐酸溶液5ml，摇匀；

加0.1%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置3min；

加0.5%氨基磺酸铵1ml，摇匀，放置3min；

再加入0.1%二盐酸萘乙二胺溶液2ml，摇匀，放置20min。

于紫外-可见分光光度计，在波长550nm处测定吸收度。

以吸收度对浓度回归，得到DS标准曲线方程。

（2）制备酚红标准曲线精密称取酚红25mg置250ml量瓶中，加Krebs-Ringer试剂定容；

再吸取1、2、3、4、5、6ml置10ml量瓶中，用Krebs-Ringer试剂定容。

各吸取上液0.5ml置10ml具塞试管中，加入0.2mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀。

于紫外-可见分光光度计，在波长555nm处测定吸收度。

以吸收度对浓度回归，得到酚红标准曲线方程。

2．样品测定

（1）SD的测定取样品1ml置10ml具塞试管中，加入1mol/L盐酸溶液5ml，摇匀；

以下按“制备SD标准曲线”项下的方法，自“加0.1%亚硝酸钠溶液1ml……”起，依法测定吸收度。

将吸收度代入标准曲线回归方程，计算出SD浓度，并记录于表19-1。

（2）酚红的测定取样品0.5ml置10ml具塞试管中，加入0.2mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀。

将吸收度代入标准曲线回归方程，计算出酚红浓度，并记录于表19-1。

（四）注释

1．小肠吸收过程中，药物被吸收的同时水分也被吸收，导致供试液体积不断减少，所以不能用直接测定药物浓度的方法计算剩余药量。

由于酚红不能被小肠吸收，因此可向供试液中加入定量的酚红，在一定间隔时间测定药物浓度的同时，也测定酚红的浓度，由酚红浓度先计算出不同时间供试液的体积，再根据测定药物的浓度，就可以得出不同时间小肠中剩余的药量或被吸收的药量。

2．插管时应注意方向，在十二指肠端向下插，回肠端向上插，以构成回路。

3．由于是在体实验，为真实反映体内环境对药物吸收的影响，不需要对肠系膜进行分离，操作时还应注意避免剪破血管。

4．由于小肠很细，小肠两端插管后再洗涤容易堵塞，加大流速可导致玻璃管滑出消化道而漏液。

防止的方法是先将十二指肠端插管，回肠端找好后先用线扎紧（方便以后找切口位置），然后在扎线处切个小口，生理盐水从十二指肠插管处注入，待洗涤干净后，再于回肠端切口处插管。

5．开始回流后，可用棉花覆盖大鼠腹部保暖，以防实验结束前动物死亡，丢失数据。

6．SD的测定中，加入氨基磺酸铵后要充分振摇至无气泡发生。

7．SD浓度测定中空白对照液的制法：

取酚红液1ml置10ml具塞试管中，加1mol/L盐酸溶液1ml，摇匀，以下操作按“制备SD标准曲线”方法。

8．酚红浓度测定中空白对照液为0.2mol/LNaOH。

五、实验结果

1．计算SD和酚红的标准曲线回归方程和相关系数。

2．根据SD和酚红的标准曲线，分别计算出规定时间样品的SD和酚红浓度，记录于表19-1中。

并按表中公式计算循环液体积及剩余药量；

式中Cn表示第n次取样时SD的浓度，

表示第n次取样时酚红的浓度。

表19-1

SD小肠吸收实验数据处理

取样时间

（min）

SD

吸收度

SD浓度

（μg/ml）

酚红

酚红浓度

循环液体积

（ml）

剩余药量

（μg）

循环前

A0

C0

V0=80

X0=V0·

C0

A1

C1

X1=V1·

C1

15

A2

C2

X2=V2·

C2+1.5C1

30

A3

C3

X3=V3·

C3+1.5（C1+C2）

…

tn

An

Cn

3．以剩余药量的对数对相应的时间作图，可得一直线，由直线斜率可求得ka与t1/2（a）值。

实验二药物的组织分布实验

一、实验目的

1．以磺胺噻唑钠为模型药物，掌握药物组织分布实验的基本方法。

2．掌握生物样品的收集及前处理方法。

二、实验原理

药物在体内的分布是指药物经吸收进入体循环后，通过血液和各组织的膜屏障转运至各组织的动态过程。

药物分布取决于组织的血流量、药物对脂膜的扩散速度及药物与蛋白质的结合程度。

药物要分布到药理作用靶部位才能发挥药效。

但如果药物在某组织出现蓄积则可能产生毒性作用，所以药物的分布可为药效学和安全性评价提供重要信息。

通过组织分布研究，可以了解试验药物在实验动物体内的分布规律、主要蓄积组织或器官、蓄积程度等。

组织分布实验通常通过给药后，于一定时间取出各组织或器官，经前处理后，用适宜的方法测定其中药物的含量。

磺胺噻唑钠为对氨基苯类化合物，在酸性溶液中可使苯环上的氨基（-NH2）离子化生成铵类化合物（-NH3+），进而与亚硝酸钠起重氮反应，产生重氮盐。

此重氮盐可在酸性溶液中与显色剂胺类化合物（N-1-萘乙二胺）起偶联反应，形成紫红色的偶氮化合物。

利用该呈色反应，采用分光光度法可测定出给药后不同时间不同组织中磺胺类药物的浓度。

仪器：

紫外-可见分光光度计，组织匀浆器，离心机，离心管等。

10%磺胺噻唑钠（ST）注射液，20%三氯醋酸溶液，0.5%亚硝酸钠溶液，0.05%二盐酸萘乙二胺等。

（一）标准曲线的制备

取大鼠3只，断颈处死，收集血液至肝素化离心管中，并立即取出肝脏、肾脏及脑组织，用生理盐水冲洗干净后立即用滤纸吸干，精确称量组织重量，按1:

6加生理盐水（脑组织按1:

3）置玻璃匀浆器中进行研磨，研磨后将匀浆液倒入离心管中，以3000r/min离心10min，取上清液1ml按1:

1加20%三氯醋酸沉淀蛋白，3000r/min离心10min，取上清液待用，血液经3000r/min离心10min后取上层血浆待测。

精密吸取沉淀蛋白后不同组织的上清液2ml各6份于干净试管中，加入磺胺噻唑钠标准溶液使肝脏、肾脏组织液中药物浓度为0.1、0.25、0.5、1、5、10μg/ml，脑组织液中药物浓度为0.05、0.1、0.25、0.5、1.5μg/ml，再各加入0.5%亚硝酸钠溶液0.05ml，混合，静置3min后，各加入0.5%氨基磺酸铵溶液1ml，摇匀2min后加显色剂（0.05%二盐酸萘乙二胺）2ml，摇匀，5min后于紫外-可见分光光度计，在540nm处测定吸收度；

空白对照以2ml蒸馏水替代组织上清液，其他操作同样品处理。

（二）组织分布实验

取大鼠4只称重，按100mg/kg的剂量尾静脉注射10%磺胺噻唑钠注射液，于给药后5、20、60、120min时，处死大鼠，收集血液至肝素化离心管中，并立即取出肝脏、肾脏及脑组织，用生理盐水冲洗干净后立即用滤纸吸干，精确称量组织重量，余下操作除不加标准液外，其他同标准曲线制备项下处理后，测定不同时间、不同组织中的药物吸收度，代入相应标准曲线，计算不同时间内各组织中ST的浓度。

（三）注释

1．生物样品中含有大量的蛋白质，它们能与药物结合，影响药物的含量测定。

特别是使用HPLC法时易损伤色谱柱，因此测定前必须先沉淀蛋白使药物游离后再作进一步处理。

可通过加入与水混溶的有机溶剂、中性盐或强酸等方法沉淀蛋白。

2．本试验也可用家兔为实验动物，但标准曲线的浓度范围须由预试验确定。

本实验主要给出肝脏、肾脏及脑组织中ST浓度的标准曲线浓度范围，仅供参考；

心脏及血液的浓度范围可根据预试验确定。

（一）实验记录与数据处理

1．分别计算各组织中ST的标准曲线回归方程和相关系数。

2．根据标准曲线方程，分别计算出各组织中样品的浓度及药量，并记录于表19-2。

表19-2各组织中药量

组织

时间（min）

A

浓度C（μg/ml）

组织中药物量（μg/g）

肝

5

20

60

120

肾

脑

心脏

血液

实验三血药浓度法测定静注给药的药动学参数

1．掌握用血药浓度法测定药物动力学参数的基本方法。

2．掌握两室模型药物静注给药的药动学参数测定方法，求算氨茶碱药动学参数。

氨茶碱静脉注射后，其体内血药浓度-时间曲线呈两室模型曲线特征。

若药物在体内呈两室模型分布，药物消除仅发生在中室，并符合表观一级动力学过程，则静脉注射给药后血药浓度经时变化公式为：

氨茶碱静注后，定时测定血药浓度。

并由血药浓度-时间数据按两室模型拟合出α、β、A与B值，然后再进一步求算药动学隔室模型参数。

紫外分光光度计，旋涡混合器，离心机，具塞试管，注射器，刀片等。

氨茶碱注射液，5%葡萄糖注射液，0.1mol/L盐酸溶液，0.1mol/L氢氧化钠溶液，氯仿-异丙醇（95:

5）溶液，75%乙醇等。

以0.1mol/L氢氧化钠溶液配制10μg/ml的氨茶碱标准储备液。

精密吸取标准储备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置具塞试管中，并加蒸馏水至1ml，各加入空白兔血清0.5ml，配成相当于血清药物浓度2、4、8、12、16、20μg/ml的标准样液。

在试管中加入0.1mol/L盐酸溶液0.2mL，于旋涡混合器上混匀后，再加入氯仿-异丙醇（95:

5）溶液5.0ml，密塞，振摇混合，以2500r/min离心20min。

精密吸取下层液4.0ml置另一具塞试管中，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液4.0ml，振摇混合，以2500r/min离心10min。

取上清液3～3.5ml，于紫外分光光度计上，以2ml蒸馏水加4ml0.1mol/L氢氧化钠溶液作参比，在274nm和298nm波长处分别测定吸收度（A274和A298），计算出ΔA（A274-A298）。

以ΔA为纵坐标，C（血药浓度，μg/ml）为横坐标绘制标准曲线并求出标准曲线回归方程，备用。

（二）给药与取样

选取体重2.5～3kg的健康家兔，实验前禁食一夜。

将氨茶碱注射液先用5%葡萄糖注射液稀释5～10倍，按15mg/kg的剂量，由兔耳静脉快速推注（要求在2min内注射完毕）。

给药后于0.25、0.5、1、2、3、4、6、8h取兔耳静脉血约2ml，置试管中。

（三）血清中氨茶碱浓度的测定

将血样以2500r/min离心20min后，使血清分离，吸取0.5ml血清样品，置具塞试管中，加蒸馏水1.0ml，混匀。

以下按“标准曲线的制备”项下的方法，自“在试管中加入0.1mol/L盐酸溶液0.2ml……”起，依法测定吸收度。

将

值代入标准曲线回归方程，求出血清中氨茶碱浓度，并记录于表19-3。

1．氨茶碱为茶碱与乙二胺的复盐，易溶于水，几乎不溶于乙醇与乙醚。

氨茶碱在体液中分离出茶碱，在酸性条件下，可用有机溶剂从血清中提取茶碱，并同时沉淀血清蛋白；

再用碱液把茶碱从有机溶剂中提出进行浓度测定。

2．氨茶碱血药浓度测定方法采用紫外双波长法，即分别于λ274和λ298处测定碱性提取液的吸收度（A），其中A274为茶碱和本底（包括代谢产物、溶剂及血清中有关成分）的吸收度，而A298仅为本底的吸收度，故茶碱的吸收度ΔA=A274-A298。

该法省去了以空白血清作对照品，尤其对于临床血药浓度监测不易采取病人空白血样时，具有实用价值。

3．用氯仿-异丙醇溶液提取血清中茶碱时，在旋涡混合器上混合的时间不宜过长，否则样品与有机溶剂会发生乳化现象，将影响分离提取效果以及测定结果。

4．兔耳取血法用固定架固定家兔，将兔耳静脉处脱毛，用酒精棉球擦洗，并用手弹打耳根部，使局部充血。

用5～8号针头，在离耳根约1cm处，向耳尖方向刺入静脉约1cm左右，拔出后滴血收集；

也可用手术刀片尖端在静脉血管处轻划一小口，让其自然滴血。

取血毕，用干棉球压住出血口数分钟即可止血。

下一次取血时，可用针尖或刀片尖端轻轻挑开伤口，让其自然滴血。

在天气较冷时，家兔耳缘取血有困难，可用红外灯照射兔耳部帮助其升温充血。

5．本实验也适用于测定氨茶碱片剂口服给药的药动学参数。

但利用家兔测定两室模型药物口服给药的药动学参数时，在取样点及时间间隔的安排上较难把握，故氨茶碱口服给药常按单室模型拟合药动学参数，往往可得到较满意的效果。

1．计算标准曲线回归方程及相关系数。

2．氨茶碱血药浓度数据及其计算，记录于表19-3。

表19-3血药浓度测定数据

t（h）

0.25

0.5

1

2

3

4

6

8

A274

A298

ΔA

C（μg/ml）

lgC

（二）氨茶碱药物动力学参数的求算

1．作C～t图与lgC～t图。

2．应用“残数法”求算混杂参数α、β、A与B值（具体方法详见第九章）。

（1）根据lgC～t曲线，划分“分布相”与“消除相”；

（2）由“消除相”血药浓度数据，求回归直线方程，并求出β与B值；

（3）由上述消除直线方程求出外推线浓度并计算残数浓度（Cr），记录于表19-4；

（4）由“分布相”残数浓度数据，求回归直线方程，并求出α与A值。

表19-4血药浓度与残数浓度数据表

外推线浓度（μg/ml）

Cr（μg/ml）

lgCr

3．求算药动学隔室模型参数（具体方法详见第九章）。

（1）计算药动学隔室模型参数k21、k10与k12；

（2）计算中室与总体表观分布容积（VC与V）；

（3）计算生物半衰期t1/2（β）；

（4）分别按公式法和梯形面积法计算血药浓度-时间曲线下面积（AUC）；

（5）将药物动力学参数记录于表19-5。

表19-5氨茶碱静注后的药物动力学参数

A（μg/ml）

VC（L）

B（μg/ml）

k12（h-1）

α（h-1）

k21（h-1）

β（h-1）

k10（h-1）

t1/2（β）（h）

AUC（μg·

h/ml）积分法

V（L）

h/ml）梯形面积法

实验四血药浓度法测定口服给药的药动学参数与生物利用度

1．掌握用血药浓度法测定制剂生物利用度的方法。

2．掌握单室模型药物血管外给药的药物动力学参数测定方法。

生物利用度是指药物吸收进入体循环的程度与速度。

生物利用度是评价药物制剂体内质量的重要指标。

在制剂的研制以及临床用药时经常测定制剂的绝对或相对生物利用度。

绝对生物利用度的测定是以静脉注射剂作为标准参比制剂；

而相对生物利用度常采用采用市场认可、吸收较好且临床有效的制剂作为标准参比制剂。

在评价生物利用度的参数中，绝对生物利用度常用血药浓度-时间曲线下面积（AUC）或尿药排泄总量（

）的相对比值（F）来反映吸收程度；

相对生物利用度则常用AUC或

的相对比值（Fr）来反映吸收程度，用血药浓度达峰时间tmax、峰浓度Cmax或ka值来反映吸收的相对速度。

测定药物制剂的生物利用度目前多采用血药浓度法与尿药浓度法。

由于测定血药浓度可获得瞬时数据，故采用血药浓度法测定生物利用度较为理想。

本实验以对乙酰氨基酚为模型药物，测定其在家兔体内的药物动力学参数与相对生物利用度。

紫外分光光度计，离心机，具塞刻度试管等。

材料：

对乙酰氨基酚片剂（0.5g），对乙酰氨基酚注射液（1ml：

0.075g或2ml：

0.25g），0.12mol/L氢氧化钡溶液，2%硫酸锌溶液等。

1．配制标准储备液精密称取对乙酰氨基酚标准品250mg，置500ml量瓶中，以蒸馏水溶解后，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀；

再精密吸取上述溶液10ml，置50ml量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，即得100μg/ml的对乙酰氨基酚标准储备液。

2．制备标准曲线精密吸取上述标准储备液1、2、4、6、8、10ml分别置10ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，再各取1ml置10ml具塞刻度试管中，各加入空白兔血清0.5ml，配成相当于对乙酰氨基酚血清药物浓度20、40、80、120、160、200μg/ml的标准样液；

在试管中加入0.12mol/L氢氧化钡溶液3.5ml，摇匀，放置2min，再加入2%硫酸锌溶液3.5ml，即出现明显乳状浑浊，加蒸馏水至10ml，摇匀，以2500r/min离心10min；

取上清液3.5～4ml（如有些样品仍浑浊可过滤），以蒸馏水1ml加0.5ml空白兔血清按同法操作所得样品为参比，于紫外分光光度计，在245nm波长处测定标准样液吸收度（A）。

以A为纵坐标，C（血药浓度，μg/ml）为横坐标绘制标准曲线并求出标准曲线回归方程，备用。

选取体重2.5～3.0kg的健康家兔，实验前禁食一夜；

给药前，先由兔耳静脉取空白血约2ml，置试管中；

然后给家兔口服对乙酰氨基酚（0.5g）一片，用20ml水送服，或口服相同剂量的对乙酰氨基酚溶液。

给药后于0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0h取兔耳静脉血约2ml，置试管中。

（三）血清中对乙酰氨基酚的测定

将所取血样置37℃水浴中保温1h，取出，以3000r/min离心10min，取血清0.5ml，置10ml具塞刻度试管中，以下按“制备标准曲线”项下的方法，自“在试管中加入0.12mol/L氢氧化钡溶液3.5ml……”起操作，并以空白血清按同样操作所得样