实时荧光定量PCR技术的研究进展及应用Word格式文档下载.docx

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MGB提高了探针的TM值,从而使它能够分辨1个碱基的差别:

完全配对,有荧光信号；

一个碱基不匹配,则没有信号；

而且连在MGB分子后的是非荧光物质的淬灭基团,因此这种探针具备更好的淬灭效果且无背景荧光、荧光标记灵活、提高荧光信号的信噪比、提高退火温度、探针短、提高SNP识别率等优点。

从而具备了更加广泛的应用前景。

（3）分子信标

分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，环部大小为15—35bp，能与靶DNA序列互补，茎部由GC含量较高的与靶DNA无序列同源性的互补序列构成，探针的5'

端与3'

端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。

当分子信标处于自由状态时，发夹结构的2个末端靠近，使荧光报告基团与淬灭荧光基团靠近，产生荧光共振能量转移（FRET）效应，荧光信号被淬灭；

因此，检测不到荧光信号[6]。

当有靶序列存在时，分子信标与靶序列结合，使分子信标的发夹结构打开呈线型，荧光报告基团与淬灭基团彼此在空间上产生足够的距离，此时荧光报告基团不能被淬灭，荧光检测仪器可检测到荧光。

随着每次扩增产物的积累，荧光强度增加，可反映出每次扩增末扩增产物积累的量。

分子信标法的特点是探针可循环利用，适用于检测点突变，特异性更明显。

但探针标记较复杂，并且要求其游离在溶液中时探针能无选择性折叠，当茎结构的热力学温度过高时还会影响探针与靶序列杂交。

（4）双杂交探针

双杂交探针技术是Roche公司开发的一种PCR定量技术，使用2个杂交探针，能提高特异性。

该技术是将2条探针中的1条在5'

端标记荧光，1条在3'

端标记荧光，其中一个为受体荧光基团，另一个为供体荧光基团，2个探针可与模板同1条链相邻的序列杂交。

在自由状态时，供体荧光基团的发射光谱覆盖受体荧光基团的激发光谱；

因此，只能检测到供体荧光基团发出的荧光。

在PCR退火阶段中2条探针与目的基因特异性结合，首尾连接，使供体和受体荧光距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移，使受体荧光基团发出荧光。

由于荧光共振能量转移探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，而非累积信号。

该方法的特点是淬灭效率高，但由于2个探针结合于模板上；

因此，会影响扩增效率，而且需要合成2个较长的探针，合成成本相对较高。

（5）Universalprobelibrary-LNA（lockednucleicAcids）

新近Roche公司研发并建立了人类和鼠的通用探针库,其探针是由锁定核酸组成。

他们通过分析人的转录组中所有不同的可能的8至9碱基序列,按照他们在转录组中出现的频率分类,找出最普便的8至9碱基序列模式制备成通用探针;

每一个探针可以与7000个转录子杂交。

这种探针的特异性由探针和引物共同实现。

LNA是一种双RNA聚合的类似物,其2p-位的氧原子与核糖4p-碳原子形成亚甲基的桥键,并分别在5p和3p标记上荧光报告基团和淬灭基团；

LNA单体掺入寡核苷序列可以增加形成体的Tm值,其稳定性比PNA高（PNAS2000,97:

5633-5638）1因LNA与DNA杂交较DNA与DNA、DNA与RNA甚至PNA与DNA杂交有更高的亲和性,故这种探针稳定性最好；

而且探针实现了设计迅速简单、低成本的水解探针特点。

一般上其公司网站后,输入基因序列号,就能订制,无需检测引物二聚体和非特异性片段。

因此LNA技术实现了高熔点和高特异性结合特点；

可以用于所有的荧光定量PCR仪。

（6）Simple探针

最近Roche公司生产一种简单探针,这种探针只在5'

端标有报告荧光,在报告荧光和5'

端之间连接一种称作“linker”的结构,只有在变性阶段,探针与目标序列互补结合时,引起“linker”结构发生改变,从而报告荧光基团的荧光得以显现。

这种探针的好处是不用淬灭基团,从而无背景荧光。

1.2.2双链DNA（dsDNA）结合染料

目前用于实时PCR的dsDNA结合染料,主要有SYBRGreenI和LCGreenTMI[7]。

（1）SYBRGreenI

是一种非饱和菁类荧光素,可以嵌合于DNA双链结构的小沟中。

其处于游离状态时,检测不到荧光信号,当结合dsDNA后荧光强度明显增强,即被荧光探测系统检测到,荧光强度的增加与初始模板量相关,可以进行定量DNA分析,已有应用于临床诊断和科学研究中的报道。

SYBRGreen染料法与探针法相比,其优势在于检测方法简便,同时降低了检测成本。

但是,由于该染料能够结合任何dsDNA分子,因此不能保证PCR的特异性。

可以通过优化PCR的反应条件,减少或去除非特异性产物和引物二聚体的产生,另外,也可以借助融解曲线分析法来区分非特异性产物和引物二聚体而进行定性诊断。

（2）LCGreenTMI

是最新出现的一种dsDNA结合染料,与SYBRGreenI相比,该染料是一种饱和结合染料,能够完全结合dsDNA分子,可直接加入PCR反应体系中,高浓度的LCGreenTMI不会抑制PCR反应。

已有文献报道在PCR反应体系中加入LCGreenTMI,使用一对引物,一个不作标记的探针,结合常规融解曲线或仅使用一对引物,PCR结束后通过分析融解曲线的形状和融解温度（Tm值）的大小,对纯合子和杂合子以及寡核苷酸序列多态性（SNP）进行鉴别。

LCGreenTMI染料法简便、快速、精确性高,预期将会有很好的应用前景。

1.3实时荧光定量PCR技术的发展

PCR技术发明以来,研究人员一直致力于用其进行核酸精确定量。

1991年Holland等[8]首次运用不可延伸的寡核苷酸杂交探针与模板结合,然后利用DNA聚合酶的5'

→3'

核酸外切酶活性将探针切断,使探针的能量传递结构被破坏发出荧光来定量PCR产物。

1992年Higuchi等[9,10]在PCR反应管中加入EB,反应进行过程中,PCR产物增加,EB与DNA双链结合发出荧光强度也逐渐增加.他们通过连续照相动态观察荧光强度的变化,并以此定量PCR产物的多少,成为最早的实时定量PCR。

1996年Heid[11]等首先报道了TaqmanPCR的原理及方法。

同年,美国AppliedBiosystems公司推出商用实时定量PCR（TaqmanPCR）系列。

之后,人们又设计出不同的荧光探针,如分子信标技术（molecularbeacon）[12]、LightcyclerPCR[13,14]等。

随着研究的不断进展,研究人员不仅定量DNA分子,还定量RNA分子,从而进一步定量基因的表达[15]。

1.4实时荧光定量PCR的定量方法

实时荧光定量PCR的定量方法有2种，即绝对定量法和相对定量法[16]。

绝对定量法是用已知的标准曲线来推算未知的样本量；

相对定量法是在一定样品中靶序列相对于另一参照序列量的变化，由于每个模板Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始DNA浓度的标准品即可绘制出标准曲线。

1.4.1绝对定量法

绝对定量法指的是用已知的标准曲线来推算未知样本的量，此方法要预先知道标准品的浓度。

将标准品稀释成不同浓度并作为模板进行PCR反应，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标绘制出标准曲线。

对未知样品进行定量时根据未知样品的Ct值，即可从标准曲线中推出样品的起始拷贝数。

1.4.2相对定量法

（1）比较标准曲线的相对定量法

相对定量法指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本量的变化。

由于该方法中量的表达是相对于某个参照物而言的；

因此，相对定量法的标准曲线比较容易制备，对于所用的标准品只需知道其稀释度即可。

在整个试验中，待测样本靶序列的量来自标准曲线，最后必须除以参照物的量，其他的样本为参照物量的n倍。

在试验中为了准确加入反应体系的RNA或DNA，通常在反应中扩增1个内源管家基因作为参照基因，由于管家基因在各种组织中的恒定表达，所以可用来作为标准，比较来源不同的样本目的基因表达量的差异。

管理基因是用于比较目的基因拷贝数，根据内参照补偿待测样本核酸抽提过程中造成的目的基因损失，反应体系内是否存在扩增抑制因素及参照物标准化等[17]。

（2）比较Ct值的相对定量法

该方法是同时扩增待测靶基因片段和内参照基因片段。

这2个扩增反应可以在2个反应管中分别进行，也可以在同1个反应管中进行，测得两者的Ct值之差即ΔCt。

该方法不需要标准曲线，与标准曲线法不同之处在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加1倍的产物，以PCR反应的指数期得到Ct值来估算起始模板的量，一个循环（Ct=1）相当于起始模板数的2倍。

此方法节省试剂，操作简便，但由于是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移会影响对实际拷贝数的估计；

因此，如何优化反应体系，使得目的基因和内参基因的扩增效率相等是该方法的难点。

2．实时荧光定量PCR技术的应用.

2.1医学研究领域的运用

应用实时荧光定量PCR检测病原DNA不仅可以定性,还可以检测出病原量的多少,为临床诊断提供了强有力的依据。

现在实时荧光定量PCR已经应用于许多病原体的检测,比如乙型肝炎病毒DNA[18]、尖锐湿疣皮损中HPVD-NA[19]、与鼻咽癌关系密切的EB病毒（Epstein-Banvirus）[20]、猪内生逆转录酶病毒[21]。

Andersen等[22]用定量PCR的方法测定了结直肠癌淋巴结的癌胚抗原（CEA）mRNA的表达量,可作为诊断癌症微转移的重要依据。

Cassinat等[23]应用RQ-PCR对t（15;

17）NB4白血病细胞进行了研究,其敏感性达10-6。

Pongers-Willemse等[24]首先应用RQ-PCR对4例前B细胞ALL中IgH/TCR重排进行了研究,他们针对每个病例设计一个与连接区互补的等位基因特异性寡核苷酸（ASO）探针和各自特异性的一对引物,比较了RQ-PCR与斑点杂交和液相杂交检测的敏感性。

结果发现其敏感性与斑点杂交相似（10-3~10-5）,但低于液相杂交。

刘敬忠等报道使用dsDNA结合染料SYBRGreenI，结合融解曲线分析对A-地中海贫血纯合子、杂合子作出诊断[25]。

使用双色荧光标记探针,结合不同的引物设计，可以实现对某些先天性疾病的定量检测。

赵卫东等[26]通过荧光定量的方法对各细胞株的转录因子T-boxex-pressioninTcells（T-bet）、GATA3的表达水平进行检测,建立了肿瘤细胞株转录因子基因表达的荧光定量PCR检测方法,较常规PCR方法更为简便、快速、准确,有很好的应用前景。

2.2食品研究运用

实时荧光定量PCR技术可以对食品中致病菌进行检测。

李光伟[27]等采用沙门菌fimY基因序列，设计特异引物和探针，建立了检测食品中沙门菌的FQ-PCR方法。

胡建华等根据Grenbank公布的志贺菌ipaH基因的保守序列设计特异性引物，筛选合适的DNA模板制备方法吗，以SABHGreen染料监控荧光变化的FQ-PCR与常规PCR结合,检测培养液和牛奶阳性样品中的志贺菌[28]。

FQ-PCR技术除了在微生物检测中应用广泛，也是食品微生物研究中不可缺少的工具，是作为微生物生理代谢、菌群分布、菌株鉴定等的研究工具。

同时PCR技术是检测转基因食品最方便快捷的方法，基于转基因特异DNA片段的FQ-PCR筛选方法已被一些国家作为相关食品法规的标准检测方法。

日本和美国等13个实验室联合采用FQ-PCR方法对5种转基因玉米和1种转基因大豆进行了定量研究。

结果表明这种方法可以应用于转基因作物标识制度的实际检测[29]。

2.3植物研究上的运用

传统的病原菌检测方法依赖于症状观察、孢子或菌落计数等手段。

与传统方法相比，实时定量PCR技术具有快速、灵敏、特异等优点，不受植物症状的限制，能区分细微差异。

目前该技术在植物病原菌检测中得到越来越广泛的应用。

如伍永明等[30]根据西瓜细菌性果斑病菌（Acidovoraxavenaesubsp.citrulli）与相关细菌16SrDNA序列差异，设计出对西瓜细菌性果斑病菌具有稳定点突变特异性探针Aac-probe，利用该探针对23种供试菌株进行了实时荧光PCR检测试验。

植物抗病性及其机制研究一直是当今植物病理学和植物抗病育种研究工作中的热点和焦点问题。

而抗病基因的研究是植物抗病性及其机制研究的基础，运用荧光定量PCR技术可检测转入抗病基因的植株中病毒的积累[31]，从而比较抗病植株与感病植株之间的病毒复制和积累的差异，为抗病基因抑制病毒的复制和运动提供强有力的分子证据。

3．实时荧光定量PCR的展望

实时荧光定量PCR技术自1996面世以来,短短的几年就被广泛应用到生物学各个领域,涉及到的范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量,核酸多态性分析,基因突变分析等多个领域。

但随着该技术应用的领域范围不断扩大延伸，研究的层次不断深入，它也开始显现出不足:

（1）降低探针制备的成本或发掘新的荧光染料；

（2）进一步提高分析的灵敏度及实验重复性；

（3）样品制备简单化,程序化和机械化以节约时间降低成本。

相信,实时荧光定量PCR将以其独特的优势在分子生物学、生物学和医学的基础研究和应用研究方面发挥更多更大的作用。

另外,基因分析的定量化和均相化是未来基因诊断的发展趋势,目前在该领域的研究刚刚开始,仍有许多问题需要解决,如分析灵敏度及重复性问题、自动化仪器和试剂成本、样品处理及多基因同时分析等问题。

生物芯片技术与荧光探针定量技术的结合将有助于上述问题的解决[32],届时将大大推动该技术在生命科学领域的应用普及,特别是临床诊断领域的推广。

随着科学技术与科学知识的增长，实时荧光定量PCR技术将继续被改进，新的问题被攻克，从而建立更新、更便捷、更完善的PCR体系，并应用到更广、更深的科学领域。

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