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使植物育种的过程变得更为快速和精确。
♦转基因食品:
利用基因工程技术改良的动物、植物和微生物所制造或生产的食品、食品原料及食品添加剂。
♦转基因食品的检测技术根据检测的直接对象可分为:
(1)利用导入外源基因所表达的特殊性状直接鉴定;
(2)针对导入外源基因表达的蛋白质的鉴定方法;
(3)以导入外源基因的特定DNA序列为检测对象的检测技术。
♦其中目前用的比较多的是PCR技术、ELISA技术(酶联免疫法)和生物芯片技术三种。
PCR检测技术
♦基本原理:
根据食品中待检的外源基因核酸序列设计合适引物,经PCR反应使待检靶标DNA序列得以扩增放大,最后经凝胶电泳分析靶标PCR产物的有无,从而对食品中是否含有靶标基因序列成分进行判定。
♦优点:
PCR检测技术灵敏度高,检测迅速,适用于加工过的转基因食品。
♦缺点:
PCR检测技术操作程序繁琐,需要对样品DNA进行提取。
会出现假阳性(污染)、假阴性(引物)。
ELISA检测技术
建立在抗体抗原免疫学反应的基础之上。
高度特异性,并且检测仪器简单,操作对人员要求不高,同时可降低检测成本。
检测范围窄
易出现假阴性结果
基因芯片检测技术
将目前通用的报告基因、抗性基因、启动子和终止子的特异片段固定于玻片上制成检测芯片,将从待检样品中提取的DNA扩增、标记后与芯片进行杂交,杂交信号由扫描仪扫描后再经计算机软件进行分析判断。
快速、高通量
费用比较昂贵、重复多次使用会降低敏感性
第二章基因工程与食品产业
1.基因研究的发展过程
1.1基因学说的创立
1.2基因与DNA分子
2.基因工程的概念及主要内容
2.1基因工程的概念
基因工程也就是DNA重组技术,是用人工的方法把不同生物的遗传物质(基因)分离出来,在体外进行剪切、拼接、重组,形成重组体,然后再把重组体引入宿主细胞中得以高效表达,最终获得人们所需要的基因产物。
2.2基因工程的主要内容
概括起来,基因工程的操作过程一般分4个步骤,如图,第一步,获得目的基因并制备载体(质粒、病毒或噬菌体);
第二步,把获得的目的基因与制备好的载体用DNA连接酶连接组成重组体;
第三步,把重组体引入宿主细胞;
第四步,筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体或个体。
3.工具酶和基因载体
3.1基因工程的工具酶
(1)限制性内切酶
限制性内切酶的定义:
是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开,产生具有3‘-OH基团和5’-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。
至今发现的限制性内切酶有三种类型,各具特性,基因工程操作中真正有用的是II型酶。
II型限制性内切酶的命名
命名原则一般是以酶源生物的属名和种名前1、2个字母以及株(型)代号来命名。
如果从同一种生物中先后分离到多种限制性内切酶,则依次用罗马数字表示。
举例:
EcoRI中的Eco表示从大肠杆菌(Escherichiacoli)中分离出来的,R代表大肠杆菌的R株,I表示从中分离出的第一种限制性内切酶。
从流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)菌株d中分离出来的第三种限制酶,被命名为HindIII。
II型限制性内切酶的识别序列:
限制性内切酶在双链DNA上能够识别的核苷酸序列被称为识别序列。
多数限制酶的识别序列由6个核苷酸对组成。
少数限制酶的识别序列由4个或5个核苷酸对组成,或者由多于6个核苷酸对组成。
限制性内切酶识别序列的共同规律:
呈回文结构,即序列被正读和反读是一样的。
II型限制性内切酶的酶切位点:
DNA在限制性内切酶的作用下,使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置被称为酶切位点,可用↓表示。
限制酶在DNA上的酶切位点一般是在识别序列内部,如G↓GATCC、AT↓CGAT等。
少数在两侧,如↓GATC、CATG↓等。
(2)DNA连接酶
DNA连接酶:
能将两段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶。
该酶催化DNA相邻的5‘磷酸基团和3’羟基末端之间形成磷酸二酯键,将DNA单链缺口封合起来。
DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA骨架上的缺口,而不能封闭裂口。
粘性末端DNA片段的连接:
具粘性末端的DNA片段的连接比较容易,也比较常用。
但是,在连接反应混合物中,具有粘性末端的载体DNA分子会发生自我环化作用,并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合的环形结构。
这样,就会使只含有载体分子的转化子克隆的“本底”比例大幅上升,最终给重组DNA分子的筛选工作带来麻烦。
用碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子,以移去其末端的5’磷酸基团,可以克服这一缺点。
平末端DNA片段的连接:
1)同聚物加尾法:
利用互补的同聚物序列之间的退火作用完成的连接。
其核心部分是,利用末端脱氧核苷酸转移酶(能够在无模板链的情况下,将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3‘-OH基团上)转移核苷酸的特殊功能。
2)接头连接法:
DNA接头,是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端,另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。
(3)DNA聚合酶
DNA聚合酶:
具有催化DNA体外合成反应作用的酶称为DNA聚合酶。
这类酶的特点在于,能够把脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端,催化核苷酸的聚合作用。
DNA聚合酶作用时大多都需要模板,合成产物的序列与模板互补。
3.2基因工程载体
理想的基因工程载体应具备的特征:
(1)具有复制起点,能携带外源DNA片段进入受体细胞,进行稳定的DNA自我/同步复制
(2)具有标记基因
(3)具有若干限制酶的单一识别位点
(4)具有较高的外源DNA的载装能力
3.2.1质粒载体
3.2.1.1质粒的一般生物学特性
环形双链的质粒DNA分具有三种不同的构型:
共价闭合环形DNA;
开环DNA;
线形DNA。
质粒DNA的复制类型:
根据寄主细胞所含拷贝数的多少,可将质粒分成两个不同的复制型:
一种是低拷贝数的质粒(1-3份拷贝),称为“严密型”复制控制的质粒;
另一种是高拷贝数的质粒(10-60份拷贝),称为“松弛型”复制控制的质粒。
拷贝数的常用定义:
生长在标准的培养基条件下,每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。
一种质粒究竟是属于严密型还是松弛型并非绝对的,还受到寄主的控制。
例如,R1质粒大肠杆菌寄主(严密型)、奇异变型杆菌寄主(松弛型)。
3.2.1.2质粒载体的构建及重要的质粒载体
为改进转化子筛选技术,有必要用人工的方法构建一种既带有多种抗药性的选择记号,又具有低分子量、高拷贝等优点的新的质粒载体。
如pBR322质粒载体
3.2.2噬菌体类载体
若要构建一个基因文库,往往需要克隆更大一些的DNA片段。
为满足这一要求,人们把噬菌体发展成为一种克隆载体。
噬菌体高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞;
自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,因而噬菌体能被开发成基因工程的有用载体。
噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体。
其基因组中有部分基因为非必要基因,被外源基因取代后,并不影响其生命功能。
这是赖以发展作为基因克隆载体的一种重要特性。
噬菌体载体的主要类型:
噬菌体包装的上下限:
50.5-37kb。
构建噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除和切除掉非必要的区段。
构建出的派生载体,可归纳成两种类型:
一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,称为插入型载体;
另一种具有成对的克隆位点,在这两个位点之间的DNA区段可被外源插入的DNA片段所取代,称为取代型载体。
柯斯质粒载体:
是一类由人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的质粒载体。
柯斯质粒载体的特点:
具有λ噬菌体高效转导的特性、具有质粒载体自我复制的特性、具有高容量的克隆能力。
四、基因工程的基本技术
4.1目的基因的获得
目的基因:
在基因工程设计和操作中,被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因。
获得目的基因的途径
获得目的基因有多种方法,目前采用的方法主要有限制性内切酶酶切直接分离法、PCR扩增法和化学合成法、cDNA基因克隆等。
cDNA基因文库构建步骤:
第一步:
分离细胞总RNA,然后从中纯化出主要含mRNA的分部;
第二步:
合成第一链cDNA;
第三步:
将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子;
第四步:
将合成的双链cDNA重组到质粒载体上,导入大肠杆菌寄主细胞增殖。
4.2重组DNA向受体的转化
(1)受体细胞
受体细胞也叫宿主细胞,从实验技术上讲是能摄取外源DNA,并使其稳定维持的细胞;
从实验目的上讲是有应用价值或理论研究价值的细胞。
(2)重组DNA导入受体细胞的途径
转化:
通过生物学,物理学和化学等方法使外源裸露的DNA进入受体细胞,并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
1)直接转化法
有的微生物细胞在不加任何处理的情况下,就能直接摄取外源DNA。
2)化合物诱导转化法
用二价阳离子处理某些受体细胞,可以使其成为感受态细胞,即处于能摄取外源DNA分子的生理状态的细胞。
这是实验室中常用于微生物的一种转化方法。
3)接合转化法
接合转化是通过供体细胞同受体细胞间的直接接触而传递外源DNA的方法。
通过接合而转移DNA的能力是由接合质粒提供的。
首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中,然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合,促使两者发生接合转化作用,将重组质粒导入受体细胞。
此方法主要用于微生物细胞的基因转化。
4)电穿孔转化法
也称为电转化,即在受体细胞上施加短暂、高压的电流脉冲,使质膜形成纳米大小的微孔,DNA能直接通过这些微孔,或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布而进入细胞质中。
该法具有简便、快速、效率高等优点,可用于真核细胞和原核细胞的外源DNA的直接导入。
5)超声波处理转化法
超声波处理细胞时可击穿细胞膜并形成过膜通道,使外源DNA进入细胞。
此法的转化率较高,并且对细胞损伤较小,有利于细胞的存活。
主要用于微生物细胞的基因转化。
6)激光微束穿孔转化法
激光是一种很强的相干单色电磁射线,利用激光微束照射受体细胞,可导致细胞膜的可逆性穿孔。
基本做法是,在荧光显微镜下找出合适的细胞,然后用激光光源代替荧光光源进行照射,导致细胞膜穿孔,处于细胞周围的外源DNA随之进行细胞。
此法操作简便快捷,转化率高,无宿主限制。
可对线粒体和叶绿体等细胞器进行基因操作。
7)体内注射转化法
利用显微注射仪把外源DNA直接注入受体细胞的转基因方法。
此法操作较为繁琐耗时,但其转化率很高,可用于动植物的外源DNA的转化。
8)脂质体介导转化法
脂质体法是根据生物膜的结构和功能特征,用磷脂等脂类化学物质合成的双层膜囊将DNA包裹成球状,导入原生质体或细胞,以实现遗传转化的目的。
此法的优点是可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用、降低对细胞的毒害效应、适应的动植物种类广泛、重复性好。
9)磷酸钙-DNA共沉淀法
核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时,可使DNA附在细胞表面,导致细胞非特异性内吞。
具体作法大致是:
先将需要被导入的DNA溶解在钙盐溶液中,然后在不停地搅拌下逐滴加到磷酸盐溶液中,形成磷酸钙微结晶与DNA的共沉淀物。
再将这种共沉淀物与受体细胞混合、保温,DNA可以进入细胞核内,并整合到寄主染色体上。
10)根癌土壤农杆菌Ti质粒介导的转化法
根癌农杆菌是使受感染植物形成冠瘿瘤的病原因子。
根癌农杆菌中含有一种大的Ti质粒,其中具有一组控制植物激素基因。
构建有效的植物转化系统:
载体为Ti质粒,宿主为根癌农杆菌,通过根癌农杆菌感染受体植物,将Ti质粒上的目的基因转入植物细胞。
此法简单易行,受体范围广。
目前绝大多数双子叶植物转基因技术都是通过该技术完成的。
11)基因枪转化法
利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时,将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随金属颗粒进入细胞的转化方法。
此法简单快速,可直接处理植物组织,实验步骤比较简单易行,具有相当广泛的应用范围。
12)花粉管通道转化法
基本操作过程:
植物授粉过程中,将外源DNA涂在柱头上,使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊,转化还不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。
此法操作简便,成本低,适合普及应用等优点,具有一定的应用前景。
4.3重组子的筛选与鉴定
(1)重组子的筛选
①根据载体表型特征筛选重组子
基因工程中使用的所有载体分子,都带有一个可选择的遗传标记或表型特征。
这种遗传选择法,使我们能够将重组的DNA分子同非重组的亲本载体分子区别开来。
抗药性记号的插入失活作用便是属于这种依据载体编码的遗传特性选择重组子的典型方法。
②根据插入序列的表型特征筛选重组子
基本原理:
转化进来的外源DNA编码的基因,如果能够对寄主菌株所具有的突变发生体内抑制或互补效应,就能使被转化的寄主细胞表现出对外源基因编码的表型特征。
③根据报告基因筛选重组子
由于受体细胞内报告基因的表达,出现新的遗传性状,以此识别重组体。
报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因,是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。
(2)重组子的鉴定
①根据重组DNA分子特征鉴定重组子:
重组DNA分子大小、重组DNA分子限制性内切酶酶切图谱、PCR扩增片段、DNA杂交法、DNA核苷酸序列。
②根据目的基因转录产物(mRNA)鉴定重组子
从外源基因转录的产物mRNA水平鉴定重组子主要采用的是Northern杂交法。
其过程与Southern杂交类似,不同的是用DNA探针检测RNA分子。
基本方法:
从重组子中提取总RNA,用亲和层析原理纯化出mRNA,经电泳,将电泳凝胶中的RNA转移到供杂交的膜上,用DNA探针杂交,出现阳性杂交带的重组子就是外源基因能有效转录的重组子。
③根据目的基因翻译产物鉴定重组子
原理:
如果能检测到重组子中目的基因的翻译产物,表明该重组子是含有目的基因的重组子。
方法:
凝胶电泳检测法、免疫学检测法和生物学活性检测法等。
4.4反义基因技术
(1)反义基因的基本概念
反义RNA:
是与靶RNA序列互补、并能专一地结合而影响靶RNA活性的一种RNA分子,通过这种途径,能在基因转录后调控基因的表达活性。
(2)反义基因技术的原理
反义RNA技术:
把一段DNA序列以反义方向插入到合适的启动子和终止子之间,转录产生反义RNA,与有意义的mRNA通过碱基互补,形成反义RNA/mRNA杂交分子,从而抑制或封闭mRNA正常的翻译和表达,达到特异性抑制或向下调解靶基因的表达效果。
把此基因构建体转化到受体细胞中去,就可获得特定基因表达受阻而其他不相关基因的表达不受影响的转基因生物。
第三章细胞工程与食品产业
1.细胞工程的基本原理
1.1细胞工程的概念及研究范畴
概念:
应用细胞生物学方法,借助工程学的试验方法或技术,在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性,以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。
研究范畴:
广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术,狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。
根据研究对象不同,细胞工程可分为动物细胞工程、植物细胞工程和微生物细胞工程。
1.2细胞全能性:
每个活细胞都具有该物种的新陈代谢、应激性和自体复制等生命基本属性,在合适的离体培养条件下,可以展现这些特征属性。
1.3细胞工程的基本操作
1.3.1无菌操作技术
污染是离体培养中的一大障碍、杜绝污染源是细胞培养的前提和关键
1.3.2细胞培养技术
细胞培养:
是指在动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。
细胞培养一般步骤:
首先,要取材和除菌。
用一定的化学试剂对材料进行严格的表面清洗、消毒。
有时还要借助某些特定的酶,对材料进行预处理,以期得到分散生长的细胞。
其次,根据各类细胞的特点,配制细胞培养基,对培养基进行灭菌或除菌。
采用无菌操作技术,将生物材料接种于培养基中。
最后,将接种后的培养基放入培养室或培养箱中,提供各类细胞生长所需的最佳培养条件。
当细胞达到一定生物量时应及时收获或传代。
1.3.3细胞融合技术
细胞融合:
是指不同的细胞在离体条件下接触,用无性的方法使其成为一体而产生杂种细胞的技术。
植物细胞和微生物细胞因有细胞壁不能直接用于融合,须经酶法除去细胞壁而得原生质体而后再进行融合,又称原生质体融合。
2.植物细胞培养技术
2.1植物细胞培养的意义
植物体本身具有很强的生物合成能力。
与栽培植物相比,利用植物细胞培养生产有用物质优点:
①离体培养细胞在人工控制的环境条件下进行,因而不受地理、气候以及包括病虫害在内的各种环境变化的影响。
②减少占用大量土地以及栽培植物的管理。
③细胞生长可以自动化控制,代谢过程可以进行合理的调节,提高生产效率,并可得到稳定的产品质量。
④细胞培养的生产系统较规范化,可根据市场供销情况有计划地调控。
植物细胞体系建立的一般程序为:
整体植株-植物组织或器官-表面消毒-外植体-在固体培养基上诱发愈伤组织-愈伤组织继代培养-悬浮培养。
2.2植物细胞培养基
植物细胞的培养基通常包括无机盐、碳源、氮源、生长调节剂等。
2.3植物细胞培养方法
悬浮细胞培养:
把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行的无菌培养。
悬浮培养优点:
增加培养细胞与培养液的接触面,改善营养供应;
在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害;
振荡培养可以适当改善气体的交换。
植物细胞悬浮培养与微生物液体培养的差异:
对剪切力敏感:
植物细胞的个体大,细胞壁僵脆且具有大的液泡,这些特性决定了其对剪切力十分敏感。
过高的剪切力可使细胞受到机械损伤,细胞体积变小,细胞形态和聚集状态改变;
或使细胞自溶,胞内化合物释放;
也可能导致细胞的活性丧失。
结团:
绝大多数植物细胞在悬浮培养时是结成直径小至100μm,大至几毫米的小团。
其主要原因是细胞分裂后不能很好地分开,另外生长后期分泌的多糖类物质也有助于结团。
过大的细胞团容易下沉,造成混合困难,而且还影响传质,使中心的营养和供氧不足,影响产物的合成能力。
需光照:
光对某些代谢产物的合成有重要的影响。
一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足的基本条件:
一是悬浮培养物分散性良好,细胞团较小;
二是均一性好,细胞形状和细胞团大小大致相同,悬浮系外观为大小均一的小颗粒;
三是生长迅速,悬浮细胞的量一般2-3天甚至更短时间便可增加一倍。
建立良好悬浮细胞系的技术关键:
(1)选择合适的基因型和外植体:
由外植体直接诱导的愈伤一般是不适合悬浮培养的,需要通过一定的途径进行筛选、改良,获得适合悬浮培养的愈伤,其影响因素有:
1)基因型:
适合悬浮培养的基因型在连续的继代培养过程中表现出好的适应性,在震荡培养两个月后,细胞团逐渐变小,均匀,生长旺盛。
而不适合悬浮培养的基因型在连续的继代培养过程中,细胞团大而致密,生长速度慢,生长状态不均匀。
2)外植体:
合适的外植体诱导产生疏松易碎愈伤组织。
(2)继代挑选技术:
诱导出的初代愈伤组织一般可分为三种:
I为质地坚硬、块状的胚性愈伤组织。
II为质地疏松、易分散、不分泌粘液的颗粒状胚性愈伤。
III为柔软、水渍、形状不规则、颜色淡白的非胚性愈伤。
其中II是适合悬浮培养的愈伤。
(3)选择合适的培养基:
愈伤组织培养基有时不适合作为悬浮细胞培养基,这时需在基本培养基的基础上重新选择培养基。
(4)培养基灭菌:
用于细胞悬浮培养的培养基通常用微孔滤膜过滤。
(5)悬浮细胞的同步化:
常用的方法有三种:
①采用尼龙网或不锈钢网过滤去掉大块愈伤组织或大细胞团,然后收集小细胞团进行继代培养;
②在每次进行继代培养时将培养物摇匀,静止片刻,将上层液体培养基与其中的小细胞团倒入另一无菌三角瓶内,弃去大细胞团和位于瓶底部的愈伤组织块,加入新鲜培养基进行继代培养;
③将培养物摇匀,静止片刻,用吸管吸取培养基中部培养物(此处细胞团小而均一,胞质浓厚),加入另一无菌三角瓶中,然后添加无菌新鲜培养基。
2.3.1植物细胞悬浮培养方法
植物细胞悬浮培养方法主要有分批培养法、半连续培养法、连续培养法。
(1)分批培养法
分批培养法:
在新鲜的培养基中加入少量的细胞,在培养过程中既不从培养系统中放出培养液,也不从外界向培养系统中补加培养基的一种培养细胞的方法。
特点:
培养基的基质浓度是随培养时间而下降,细胞浓度和产物浓度则随培养时间的增加而增加。
(2)半连续培养法
半连续培养法:
在反应器中投料和接种培养一段时间后,将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法。
此法可减少接种次数,简化操作过程。
工业生产中常采用。
(3)连续培养法
连续培养法:
在培养过程中,不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基,使培养物不断得到养分补充并保持其恒定体积的培养。
1)特点
①连续培养由于不断加入新鲜培养基,保证了养分的充分供应,不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。
②连续培养可在培养期间使细胞长久地保持在对数生长期中,细胞增殖速度快。
③连续培养适用于大规模工业化生产。
2)连续培养的种类
根据在连续培养过程
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