讨论牛黄清心丸中黄曲霉毒素的检测Word文档下载推荐.docx

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　　以AFB1为例，其原理是使样品中的AFB1首先与胶体金颗粒表面的抗AFB1单克隆抗体反应，如果样品中AFB1的含量超过限量值，胶体金的抗体位点将不再有剩余，当胶体金颗粒层析经过检测线时，胶体金颗粒将不会停留在该线的所在位置，继续上行时与质控线上喷涂的羊抗鼠IgG反应，呈现出胶体金的红色条带。

如果样品中不含AFB1或AFB1含量低于限值，胶体金表面的抗体将与检测线上的化合物反应呈现出红色条带，质控线也呈现红色条带。

GICA快速检测黄曲霉毒素已在食品和中药材中广泛应用。

该法使用简单方便，非常适合现场快速检测黄曲霉毒素的残留量。

本实验选用70%甲醇溶液提取样品中的黄曲霉毒素，采用GICA法进行检测，通过图像分析定量检测样品中黄曲霉毒素的含量。

为了防止复杂基质的干扰，建议对GICA法检出阳性结果的样品，再经过免疫亲和柱-高效液相色谱法（IAC-HPLC法）进行分析确证。

　　1材料与方法

　　1.1仪器

　　Waterse2695分析型高效液相色谱仪，包括Waters2489DAD检测器（美国Waters公司）;

光化学衍生器（美国AURA公司，反应线圈15m，灯管254nm）。

CloversilC18反相色谱柱（4.6mm×

150mm，5μm）;

IAC-SEP黄曲霉毒素总量免疫亲和柱;

iCheck食品安全定量快检仪;

iCheck总黄曲霉毒素定量快检试剂盒（产品号:

CS101-J;

批号:

AF08200801）:

iCheck黄曲霉毒素快检卡（25套），黄曲霉稀释缓冲液（5mL）和黄曲霉快检二维码;

iCheckAFB1定量快检试剂盒（产品号:

CS103-J;

批号:

iCheckAFB1定量快检卡（25套），均购自北京中检维康技术有限公司。

　　1.2试剂

　　甲醇、乙腈（美国Fisher公司，色谱纯）;

黄曲霉毒素混合标准品（北京中检维康技术有限公司）。

样品处理及溶液配制中使用的超纯水由Mini-Q超纯水处理系统制备（美国Millipore公司）。

实验中抽取测试样品的信息。

　　1.3溶液配制

　　1.3.1混合对照溶液精密吸取黄曲霉毒素混合

　　标准品（黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2标示质量浓度分别为1.0、0.3、1.0和0.3μg·

mL-1）100μL至10mL量瓶中，用流动相定容至刻度，得到含黄曲霉毒素B1和G1为10ng·

mL-1，黄曲霉毒素B2和G2为3ng·

mL-1的溶液，即得。

　　1.3.2磷酸盐缓冲溶液称取氯化钠8.0g，磷酸

　　氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，氯化钾0.2g，用纯水990mL溶解，然后用浓盐酸调节pH至7.0，再纯水稀释至1000mL，即得。

　　1.3.3吐温/磷酸盐缓冲溶液将吐温-201.0mL加入到“1.3.2”项下配制的磷酸盐缓冲溶液中，混匀制成0.1%的吐温/磷酸盐缓冲溶液。

　　1.3.4供试品溶液水丸用研钵粉碎，蜜丸剪碎成小块，称取粉碎或小块样品5.0g于50mL离心管，待用。

在上述称有样品的50mL离心管中加入70%甲醇溶液25.0mL，剧烈振荡3min至完全溶解，用定性滤纸过滤，即得GICA法用供试品溶液。

在上述称有样品的50mL离心管中加入氯化钠1.0g，加入70%甲醇溶液25.0mL，高速搅拌2min，量取上清液10mL置于20mL量瓶中，用水稀释至刻度，用0.45μm滤膜过滤，即得IAC-HPLC法用供试品溶液。

　　1.4检测方法

　　1.4.1GICA法从iCheck

　　总黄曲霉毒素定量快检试剂盒或iCheckAFB1定量快检试剂盒中取出相应定量快检卡和黄曲霉毒素稀释缓冲液，平衡至室温。

将iCheck食品安全定量快检仪自带的零点校正片插入定量快检仪测定室，进行“零点校正”;

将相应批次的快检卡二维码输入到iCheck食品安全定量快检仪中，获取校准曲线。

将定量快检卡外包装打开，取出相应微孔固定于微孔架上，快检卡放置于37℃恒温器上。

取黄曲霉毒素稀释缓冲液120μL于相应微孔中，加入“1.3.4”项下配制的GICA法用供试品溶液30μL，用移液器吸打5次混匀，取100μL加入到快检卡样品孔中。

37℃反应10min后，立即将快检卡放入定量快检仪中，点击“检测分析”读数，即为样品实际浓度。

　　1.4.2IAC-HPLC法使用

　　“1.3.3”项下配制的吐温/磷酸盐缓冲溶液将免疫亲和柱上杂质除去，精密量取“1.3.4”项下配制的IAC-HPLC法用供试品溶液25mL，以流速2mL·

min-1通过免疫亲合柱，用5mL蒸馏水洗脱，并用空气压出柱中残留蒸馏水，用1.5mL甲醇洗脱，甲醇洗脱液置2mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀待HPLC检测。

色谱条件:

采用CloversilC18色谱柱（5μm，4.6mm×

150mm），以甲醇-水（45∶55）为流动相，流速0.8mL·

min-1，检测器为荧光检测器，激发波长λex=360nm，发射波长λem=440nm，进样量20μL，光化学衍生化系统为光化学衍生器。

使用上述IAC-HPLC方法，对供试品溶液进行测定。

　　2结果与讨论

　　2.1GICA方法学验证

　　抽取3个批次不同剂型不同标准的样品进行方法学验证:

分别从1、4和9号厂家随机抽1批次样品，编号为A、B和C，其中C为水丸。

将A、B和C3个批次样品按“1.3.4”项下配制方法制成GICA法用供试品溶液。

使用标准加入法，在供试品溶液中加入黄曲霉毒素标准品至终浓度分别为0、3.125、6.25、12.5、25.0μg·

按“1.4.1”项下GICA方法进行检测，每批次样品平行重复3次，结果见表2。

A、C无黄曲霉毒素检出，而B中黄曲霉毒素总量和AFB1均检出（最低检出限3μg·

kg-1）。

A和C回收率在73.0%～105.0%之间，符合关于痕量分析回收率要求范围（70%～110%）[11]。

B样品回收率为44.6%～92.2%，部分低于60%，说明样品基质干扰较大，不适合用GICA法检测。

　　2.2IAC-HPLC法验证

　　按照“1.3.4”项下方法制备IAC-HPLC法用供试品溶液，按“1.4.2”项IAC-HPLC条件测定A、B和C3批次样品中黄曲霉毒素的含量。

黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的最低检出限分别为0.2、0.1、0.3和0.3μg·

使用IAC-HPLC法对3批次样品进行检测，所有结果均小于黄曲霉毒素的最低检出限（表3）。

与表2结果进行比对可知，使用GICA法检测B样品的加入回收率较低，且本底有黄曲霉毒素检出，而使用IAC-HPLC法验证时并未检出黄曲霉毒素，推断GICA法在检测B样品时可能存在假阳性结果。

在A和C样品检测时，IAC-HPLC方法和GICA方法均未检出黄曲霉毒素，结果表明在现有分析条件下，未发现假阳性。

　　2.3实验结果

　　2.3.1GICA检测结果

　　使用GICA方法分析38批次样品。

实验首先选用黄曲霉毒素总量试剂盒进行，若有总黄曲霉毒素检出（检出限≥3μg·

kg-1），则使用AFB1试剂盒对检测结果进行分析整理，见表4。

所有厂家黄曲霉毒素限量均符合中国药典2010年版一部规定，合格率为100%。

其中，3个厂家的5批次样品总黄曲霉毒素和AFB1均有检出，检出率为13.16%。

　　2.3.2IAC-HPLC验证结果

　　为了验证GICA法的准确性，实验中选择了厂家提供的六神曲（炒）对照药材和成药共9份样品进行IAC-HPLC检测。

六神曲（炒）药材2批次:

Ⅰ为5号厂家，Ⅱ为10号厂家;

AFB1检出的大蜜丸5批次:

Ⅲ为1号厂家，Ⅳ和Ⅴ为4号厂家2个批次，Ⅵ和Ⅶ为10号厂家2个批次;

随机选取未检出黄曲霉毒素的样品2批次作为阴性对照:

Ⅷ为1号厂家，Ⅸ为6号厂家。

检测结果见表5。

由IAC-HPLC法检测结果可知，六神曲（炒）药材（Ⅰ和Ⅱ）均有黄曲霉毒素检出，其中Ⅰ中AFB1含量为0.6μg·

kg-1，而对应的5号厂家的成药中未检出黄曲霉毒素（GICA法检出限3.0μg·

kg-1）。

10号厂家提供的六神曲（炒）药材（Ⅱ）和成药（Ⅵ和Ⅶ）均有黄曲霉毒素检出:

Ⅱ中AFB1为2.1μg·

kg-1，AFB2为0.3μg·

kg-1;

Ⅵ中AFB1为1.3μg·

值得注意的是，Ⅶ样品的黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2均有检出，见表5。

样品Ⅲ、Ⅵ和V用GICA法均有黄曲霉毒素检出，但使用IAC-HPLC法检测并未检出，这与方法学验证中4号厂家样品的验证结果一致，应为假阳性结果。

　　3结论

　　牛黄清心丸（局方）有29味药材组成，成分复杂，基质干扰较大。

由验证实验可以看出，GICA法可以用于牛黄清心丸（局方）中黄曲霉毒素的检测。

在验证实验中，A、C2个样品的加标回收率符合痕量检测要求，而B样品蜜丸发硬现象明显，可能是由于炼蜜的质量较差，从而导致B样品基质影响较大，有假阳性结果，须再经过IAC-HPLC法验证。

对38批次抽样的牛黄清心丸（局方）样品进行检测，有5批次有黄曲霉毒素检出，检出率为13.2%，且均为蜜丸。

在前期处理剪碎蜜丸时，这5批蜜丸性状与其他样品有一定区别，譬如蜜丸手感比较粗糙无细腻滋润感，硬度偏硬，其中4号和10号厂家的蜡丸表面有明显裂纹。

由实验结果可知，蜜丸制作工艺直接影响GICA法的结果，但对IAC-HPLC法影响不大。

所以在对复杂样品的检测中，建议可用GICA法和IAC-HPLC法2种方法结合验证，从而保证检测结果的准确性。