载体构建流程v3Word格式文档下载.docx
- 文档编号:17386123
- 上传时间:2022-12-01
- 格式:DOCX
- 页数:10
- 大小:118.85KB
载体构建流程v3Word格式文档下载.docx
《载体构建流程v3Word格式文档下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《载体构建流程v3Word格式文档下载.docx(10页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。
Ⅰ型切点不固定,Ⅲ型其切割位点在识别位点之外,只有Ⅱ型其特异性切点位置可以控制和预测,可以产生固定的DNA片段,基因工程中所用的限制酶均为Ⅱ型限制酶。
这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异性核苷酸序列的能力,能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA双链,形成一定长度和顺序的DNA片段。
选择合适的限制酶对重组的环状质粒进行酶切,将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,用已知相对分子量的线状DNA(DNA分子量标志)及未经酶切的重组环状质粒为对照,可以对重组环状质粒中的目的DNA分子进行初步鉴定
以下所有实验,进行前请认真阅读试剂使用说明书。
一.RNA反转录cDNA
实验原理:
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。
首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
实验材料:
试剂盒:
TakaraPrimeScript®
RTreagentKit
实验步骤:
实验所用枪头,EP管,水等全部使用RNasefree耗材,或者提前使用DEPC处理。
处理方式:
按照1/1000比例向无菌水中加入DEPC,将所需耗材在含DEPC的水中浸泡过夜;
次日早晨高压灭菌处理。
提前调水浴锅至42℃;
按下列组份配制RT反应液(反应液配制请在冰上进行)。
5×
PrimeScript®
Buffer(forRealTime)2μl
PrimeScript®
RTEnzymeMixI0.5μl
OligodTPrimer(50μM)0.5μl
Random6mers(100μM)0.5μl
TotalRNA360ng
RNaseFreedH2Oupto10μl
total10μl
轻柔吹打均匀;
室温放置10min;
42℃水浴锅中放置1h;
冰中冷却2min;
注意事项:
上述反应可根据条件在PCR仪中进行。
当需要使用的基因编码的RNA二级结构较为复杂时,反转录前,将RNA溶液于65°
C加热5分钟后迅速置于冰中,利用这种办法可以减弱二级结构的影响,提高逆转录反应效率。
二.目的基因扩增:
引物设计原则:
a)特异性:
在cDNA中能且只能扩增出目的序列,不会扩增出其他序列;
(通过blast检验)
b)在引物5’端添加酶切位点及3个保护碱基;
c)酶切位点使用所选载体中有的位点,尽量避免使用载体中相邻的位点,尽量避免使用平末端位点;
所选位点在扩增目的片段中不能出现,可以使用primerpremier对序列中的酶切位点进行分析。
d)设计引物时建议同时设计合成两对或两对以上引物,以免一对引物扩增失败时,再合成第二对引物浪费时间。
三.PCR反应:
PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
①模板DNA的变性:
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②模板DNA与引物的退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
(Plateau)。
到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
dNTP,PCRbuffer,DNA聚合酶,上游引物,下游引物,纯水,模板。
操作步骤:
拿到新合成的引物后,按照引物说明书离心,溶解引物至100Mm。
使用时稀释至10mM。
将(Tm-5)℃作为退火温度进行PCR反应并对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
如果存在非特异条带,一般会设置退火温度梯度,摸索最适退火温度。
(Tm-5)℃不是一个普适的规律,最好不要太依赖。
4k以下的片段使用KODPlusDNA聚合酶,4k以上选择KODFXDNA聚合酶,按说明书操作即可;
如果4k以下的片断用KODPlus扩增效果不佳,可以换用KODFX。
四.PCR产物回收:
在高盐状态下,纯化树脂专一性地吸附DNA;
而在低盐或水溶液状态下,DNA被洗脱下来。
OMEGAcycle-purekit,OMEGAgelextractionkit
取5微升PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定,如果产物为单一条带,且大小符合预期,直接进行PCR产物回收。
如果存在非特异条带,可以考虑进行胶回收,或者继续优化PCR反应条件。
配制1%琼脂糖凝胶:
称取一克琼脂糖,加入100mlTAE溶液中,煮沸至凝胶完全溶解。
待温度降至60°
C左右时(刚好不烫手)加入10μl4Sgreen,摇匀,将凝胶溶液倒入槽内,冷凝后备用。
将反转录样品与LoadingBuffer混匀,加入凝胶孔内,最右端加Marker,固定电压180V,跑20分钟左右。
此时调水浴锅60°
C.
参考意见:
500bp以下的片段使用2%琼脂糖凝胶;
500bp以上使用1%琼脂糖凝胶。
标准并不绝对,可以根据个人经验进行调整。
在紫外灯下切下相应大小的DNA片段,加入EP管内,按照0.1g凝胶加入100μl的比例加入bufferxp,放入60°
C水浴锅中至胶完全融化。
这段时间组装收集管与吸附柱,并在吸附柱上做好标记。
紫外照射时间不宜过长,避免DNA形成TT二聚体。
用大枪将EP管内溶液吹匀,吸入吸附柱中,12000rpm离心1min;
倒掉收集管中废液,向吸附柱中加入300μlbufferXP,最高速离心1min,倒掉收集管中废液,向吸附柱中加入700μlwashbuffer,最高速离心1min;
重复上一步骤。
最高速空转2min;
取出吸附柱,放入新离心管中,70℃加热2min,待乙醇挥发;
向吸附柱中加入50μl超纯水,70℃加热2min,12000rpm离心1min,离心管内液体即所需回收的DNA溶液。
五.PCR产物与载体的酶切
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:
Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类。
Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成:
一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列;
另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA的基础。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:
5'
-G↓AATTC-3'
),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA段(如SmaⅠ:
-CCC↓GGG-3'
);
有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA段称粘性未端,如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
…G↓AATTC…3'
→5'
…GAATTC…3'
3'
…CTTAA↑G…5'
→3'
…CTTAAG…5'
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。
大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。
当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。
如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。
若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。
若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
也可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚/氯仿抽提,加0.1倍体积3mol/LNaAc和2倍体积无水乙醇,混匀后置-70℃低温冰箱30分钟,离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
使用takaraquickcut限制酶或常规限制酶,酶切体系及条件见相应酶的说明书。
Buffer5μlBuffer5μl
酶11μl酶11μl
酶21μl酶21μl
载体1μg外源片段1μg
水补至50μl水补至50μl
温度根据所用不同酶确定,反应时间一般10min。
双酶切时,两种限制酶反应温度不一致时,可以采用两种方法解决:
1.向体系中加入两种限制酶,先在低温下进行反应,再用较高温度下进行反应
2.先加入一种限制酶,使用相应反应温度进行反应,再加入第二种酶,使用第二种酶的温度进行反应
双酶切时,两种限制酶反应buffer不一致时,可以采用两种方法解决:
1.进行两次酶切,两次酶切之间回收PCR产物;
2.先使用盐离子浓度较低的buffer进行第一次酶切,然后加入相应的限制酶和盐离子,继续进行第二次酶切。
六.连接:
DNA连接酶催化相邻的核酸分子间3'
-羟基和5'
-磷酸基形成磷酸二酯键.
当两条单链的寡核苷酸与同一条靶序列完全互补配对时,DNA连接酶可催化一条寡核苷酸3'
-羟基末端和另一条寡核苷酸5'
-磷酸末端通过磷酸二酯键连接;
如果一条寡核苷酸3'
-羟基末端的碱基出现了突变错配,DNA连接酶就连接不上,不催化磷酸二酯键形成.
NEBDNAligase
体系中外源片段与载体的分子数比例控制在1:
1~1:
10之间。
对于长约5K的载体,一般加入100ng,对于长度为nKb的外源片段,加入(20n~200n)ng。
体系中其余成分参考相应酶的说明书。
七.转化:
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于0℃,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。
将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达,然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。
小枪,小枪头,大枪,大枪头,1.5mlEP管,固体LB培养基,无抗性的液体LB培养基
超净台内放入小枪,小枪头,大枪,大枪头,1.5mlEP管,固体LB培养基,无抗性的液体LB培养基,紫外照射超净台30min,同时调水浴锅至42℃,同时制冰。
以下操作如无特别说明,建议均在冰上进行;
从-80℃冰箱内取出感受态细菌,冰上融化(可以室温融化或在手中捂化,不推荐),融化后立即将感受态分装至EP管中,每管约30-50μl,置于冰上;
吸取5-10μl转化体系,放入感受态中轻柔吹打数次混匀,做好标记;
将EP管置于冰上30min;
将EP管置于42℃水浴锅中加热90s,期间尽量不要扰动EP管;
取出EP管,置于冰上2min;
向EP管中加入400~800μl无抗性LB液态培养基,摇床内100rpm,37℃摇45min;
将EP管内培养基倒到固体LB培养基上,晃动培养基,使菌液在平皿表面分布均匀;
也可采用涂布法和划线法。
三种方法各有优势,个人比较习惯第一种方法;
固体培养基有抗性,抗性的选择根据质粒情况而定;
培养箱内37℃倒置培养过夜;
12-16h后,即可看到固体培养基表面长出单个菌落。
TOP10十个小时
八.挑取单克隆摇菌
超净台内放入小枪,小枪头,移液管(可选),大枪,大枪头,大试管,试管架,有抗性的液体LB培养基,紫外照射超净台30min;
向大试管中加入含相应抗性的LB液体培养基适量
一般4ml或其整数倍。
取培养过夜的LB固体培养基,用小枪头挑取单个菌落,将枪头投入大试管中,做好标记,盖好盖子;
挑取时宜选中等大小的菌落,太大太小均不宜挑取;
有时一个大菌落周围会有几个小菌落围绕大菌落而生,此时优先选择这种大菌落,一定不能挑取周围的小菌落;
37℃摇床内振荡过夜,转速220转/min。
一个板子上挑取8-10个克隆。
注意事项:
Amp在37摄氏度下过夜培养后失效,不能再用。
九.质粒提取(翻译omega质粒提取试剂盒说明书)
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,当加入中和液后,质粒DNA分子能够迅速复性,呈溶解状态,离心时留在上清中;
蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状,离心时可沉淀下来。
取振荡过夜的菌液,分装至4ml离心管中,做好标记;
一定一定要做好标记!
室温下,10000g离心1min;
向4ml离心管中加入250μlsolutionI,吹打均匀,将菌液转移至1.5ml离心管中,吹打均匀。
可以在1.5ml离心管中插入牙签,在votex上涡旋振荡
一定要使细菌重悬均匀;
向离心管中加入250μlsolutionII,轻柔颠倒EP管6-8次,使菌液变澄清裂解时间控制在5min以内;
不可剧烈吹打涡旋等;
向离心管中加入350μlsolutionIII,迅速颠倒混匀;
一定要迅速、彻底混匀;
加入solutionIII后立即混匀,防止出现局部沉淀;
室温下13200rpm(最高转速)离心10min;
此段时间将吸附柱插入收集管,做好标记;
吸取离心后的上清液,加入吸附柱中;
动作要轻柔,不要吸起沉淀;
如果上清液中出现沉淀
室温下10000g离心1min,倒掉收集管中液体,将吸附柱放回收集管中;
向吸附柱中加入500μlBufferHB,室温下10000g离心1min,倒掉收集管中液体,将吸附柱放回收集管中;
向吸附柱中加入700μlWashBuffer,室温下10000g离心1min,倒掉收集管中液体,将吸附柱放回收集管中;
重复上步操作;
此步骤不可省略;
取出吸附柱放入干净的EP管中,敞盖70℃加热2min;
向吸附柱中加入60μlElutionBuffer(具体体积根据质粒可能的产量调整),闭盖70℃加热2min;
室温下10000g离心1min;
测量质粒浓度与A260/A280值,标记于管壁,-20℃保存。
浓度超过1000ng/微升时,将质粒溶液稀释后再测。
调零溶液建议使用溶解DNA的溶液
提取质粒后,取约2微升进行电泳鉴定,观察有无细菌基因组DNA污染。
一十.鉴定:
鉴定一般采取酶切的方式。
用构建载体时所用限制酶对提取的质粒进行酶切,电泳。
如果载体构建成功,电泳结果会显示两条带,一条与空载体大小相同,另一条与插入片段大小相同。
操作与前述相同
可以在插入片断上和载体上分别选择酶切位点进行酶切。
鉴定插入片断正确的质粒,再次转化摇菌,得到的菌液加入50%甘油,1ml分装,-80摄氏度保存。
每个载体可以保留5-6管菌种。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 载体 构建 流程 v3