动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告.docx
- 文档编号:17377187
- 上传时间:2023-04-24
- 格式:DOCX
- 页数:9
- 大小:70.79KB
动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告.docx
《动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告.docx(9页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告
动物肝脏中DNA的提取及检测
一、前言
脱氧核糖核酸
脱氧核糖核酸〔DNA,为英文Deoxyribonucleic acid的缩写〕,又称去氧核糖核酸,是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分,同时也是组成基因的材料。
有时也被称为“遗传微粒〞,原因是在繁殖过程中,父代会把它们自己DNA的一局部复制传递到子代中,从而完成性状的传播。
DNA是高分子聚合物,DNA溶液为高分子溶液,具有很高的粘度,可被甲基绿染成绿色。
DNA对紫外线〔260nm〕有吸收作用,利用这一特性,可以对DNA进行含量测定。
当核酸变性时,吸光度升高,称为增色效应;当变性核酸重新复性时,吸光度又会恢复到原来的水平。
较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性,即DNA双链碱基间的氢键断裂,双螺旋结构解开—也称为DNA的解螺旋。
在细胞内,DNA能与蛋白质结合形成染色体,整组染色体那么统称为染色体组。
对于人类而言,正常的体细中含有46条染色体。
染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制,细胞分裂间期又可划分为:
G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。
对于真核生物,如动物、植物及真菌而言,染色体主要存在于细胞核内;而对于原核生物,如细菌而言,那么主要存在于细胞质中的拟核内。
染色体上的染色质蛋白,如组织蛋白,能够将DNA进行组织并压缩,以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用,进而调节基因的转录。
脱氧核糖核酸的结构
DNA的结构:
DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。
DNA是一种长链聚合物,组成单位为四种脱氧核苷酸,即腺嘌呤脱氧核苷酸〔dAMP脱氧腺苷〕、胸腺嘧啶脱氧核苷酸〔dTMP脱氧胸苷〕、胞嘧啶脱氧核苷酸〔dCMP脱氧胞苷〕、鸟嘌呤脱氧核苷酸〔dGMP脱氧鸟苷〕。
而脱氧核糖〔五碳糖〕与磷酸分子借由酯键相连,组成其长链骨架,排列在外侧,四种碱基排列在内侧。
每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连,这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列,可组成遗传密码,指导蛋白质的合成。
读取密码的过程称为转录,是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA〔信使RNA〕的核酸分子。
DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3’,5’-磷酸二酯键相连构成的长链。
大多数DNA含有两条这样的长链,也有的DNA为单链,如大肠杆菌噬菌体φX174、G4、M13等。
DNA有环形DNA和链状DNA之分。
在某些类型的DNA中,5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶,其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶特别丰富。
在某些噬菌体中,5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。
40年代后期,查加夫〔E.Chargaff〕发现不同物种DNA的碱基组成不同,但其中的腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数〔A=T〕,鸟嘌呤数等于胞嘧啶数〔G=C〕,因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和,一般用几个层次描绘DNA的结构。
浓盐法从动物组织中提取DNA
核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白〔DNP/RNP〕的形式存在,其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液,但在0.14M的盐溶液中溶解度很低,而RNP那么可溶于低盐溶液,因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。
将抽提得到的DNP用SDS处理可将其别离DNA和蛋白质,用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清,参加冷乙醇即可将其呈纤维状析出。
肝脏细胞
肝脏是由肝细胞组成,肝细胞极小,肉眼看不到,必须通过显微镜才能看到。
人肝约有25亿个肝细胞,5000个肝细胞组成一个肝小叶,因此人肝的肝小叶总数约有50万个。
肝细胞为多角形,直径约为20-30/加(微米),有6-8个面,不同的生理条件下大小有差异,如饥饿时肝细胞体积变大。
每个肝细胞外表可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。
肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构:
如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。
二、实验目的
1.掌握浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术
三、实验原理
核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白〔DNP/RNP〕的形式存在,其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液,但在0.14M的盐溶液中溶解度很低,而RNP那么可溶于低盐溶液,因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。
将抽提得到的DNP用SDS处理可将其别离DNA和蛋白质,用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清,参加冷乙醇即可将其呈纤维状析出。
四、实验器材和材料试剂
实验器材:
①匀浆器
②量筒
③离心机
④离心管
⑤试管
⑥吸管
⑦恒温水浴锅
实验材料:
①猪肝
实验试剂:
①0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液〔pH6.8〕
②95%乙醇〔A.R.〕
③NaCl固体〔A.R.〕
④5%SDS溶液〔5gSDS定容至100ml〕
⑤V(氯仿):
V〔异戊醇〕20:
1的混合液
五、实验操作
1.称量
①称取一定质量的猪肝,参加2倍肝重的0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液并用匀浆器磨碎〔已完成〕。
2.提取DNA
①量取肝糜4ml于10毫升离心管,在4000r/min下离心10min,沉淀中再参加8ml缓冲液于4000r/min离心5min;
②弃上清,取沉淀;
③将沉淀用10ml柠檬酸钠缓冲液完全洗入干净的小烧杯、参加5ml氯仿-异戊醇混合液、1mlSDS,振荡30min〔保鲜膜封口〕;
④缓慢参加固体NaCl〔约0.9g〕,使其最终浓度为1mol/L;
⑤将溶液分装到2个10毫升离心管中,在4000r/min离心5min,取上清水相;
⑥在上述水相溶液中分别加等体积冷95%乙醇,边加边用玻棒慢慢朝一个方向搅动,将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇,即得DNA粗品;
⑦用8ml蒸馏水溶解DNA粗品于10ml离心管中。
3.标准曲线的绘制
按下表参加各种试剂,混匀,于60℃恒温水浴锅45min,冷却后,在595nm波长下于分光光度计比色测定,以吸光度对DNA浓度作图,制作标准曲线。
0
1
2
3
4
5
标准DNA溶液/ml
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水/ml
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
二苯胺试剂/ml
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
A595nm
4.样品的测定
将DNA粗品定容至25ml容量瓶,再取DNA样液1.0ml,参加蒸馏水1.0ml,混匀。
然后准确参加二苯胺试剂4.0ml,混匀,于60℃恒温水浴锅45min,冷却后,595nm波长下于分光光度计比色测定,根据所测的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量〔ug〕。
5.计算100g猪肝中DNA含量
w=m1/m2×100%
w:
DNA的质量分数〔%〕
m1:
样液中测得的DNA的质量〔ug〕
m2:
样液中所含样品的质量〔ug〕
六、实验数据处理
1.标准曲线
0
1
2
3
4
5
标准DNA溶液/ml
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水/ml
2.0
1.6
1.2
0.8
0.4
0
二苯胺试剂/ml
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
A595nm
0
0.039
0.09
0.146
0.197
0.249
DNA含量/ug
0
80
160
240
320
400
2.实验结果处理
猪肝质量为2.04g
DNA提取液体积为12.53ml
序号
1
2
3
A595nm
0.102
0.102
0.101
平均A595nm
0.102
样液中DNA含量/ug
171.4
样液中样品质量/g
0.1628
根据公式
w=m1/m2×100%
得:
w=0.1053%
那么100g猪肝中DNA含量为:
w×100=0.1053g
七、思考题
1.实验中的乙醇、SDS、氯仿-异戊醇、NaCl、柠檬酸钠分别有什么作用?
答:
①柠檬酸的钠盐在实验中既充当DNA酶的抑制剂,也是pH缓冲溶液;
②SDS是外表活性剂,可以让蛋白质与DNA分开;
③氯仿是有机溶剂,可以使蛋白质聚集沉淀,便于别离出去;
④异戊醇是消泡剂,可以减少泡沫的发生;
⑤氯仿-异戊醇的作用是使蛋白质变性、膜溶解;
⑥NaCl固体溶解使得试液成为高浓度的盐溶液,在这样的环境中DNA核蛋白能溶解,RNA核蛋白那么溶解度很低,可以利用这一性质别离两种核酸。
八、实验考前须知
1.DNA主要集中在细胞核中,因此,通常选用细胞核含量比例大的生活组织作为提取制备DNA的材料,小牛胸腺组织中细胞核比例较大,因而DNA含量丰富,同时其脱氧核苷酸酶活性较低,制备过程中DNA被降解的可能性相对较低,所以是制备DNA的良好材料,但其来源较困难,脾脏或肝脏易获得,也是实验室制备DNA常用的材料,本实验用新鲜肝脏作为实验材料。
2.为了防止大分子核酸在提取过程中被降解,须采取以下措施:
整个过程必须在低温下进行,可参加某些物质抑制核酸酶的活性,如柠檬酸钠、EDTA、SDS等,EDTA是抑制核酸酶的活性最好的抑制剂。
3.从核蛋白中脱去蛋白质的方法很多,经常采用的有:
氯仿-异丙醇法、苯酚法、去垢剂法等,他们均能使蛋白质变性和核蛋白解聚,并释放出核酸。
4.使用离心机时,对称放置的离心管必须用天平调平衡。
5.防止剧烈振荡,如研磨过程、搅拌过程等。
九、实验结果误差分析及讨论
经过对本次实验结果进行分析,得出100g猪肝中DNA含量大约为0.1053g的结论,在上网查阅相关资料后发现:
猪肝中DNA含量与本次试验实际操作测量得出的结果大致相互吻合。
由此可知,本次试验结果是相比照拟成功的,较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量,并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术,根本到达了本次实验的目的。
但是本次实验结果只是粗略测量,并未到达精确测量猪肝中DNA的含量,且实验数据较理论值偏低,这是由于某些误差导致,在实验过程中些许因素可能会导致实验结果数据有偏差,经分析得出以下几点:
①在称取猪肝后参加柠檬酸钠缓冲液进行研磨的过程中,由于猪肝组织外表较滑不易磨碎,且研磨至最后依旧有小局部猪肝组织块残留,因此可能导致猪肝中DNA提取不充分,致使实验数据较理论值偏低;
②研磨过程中,可能由于操作不当,导致局部液体溅出,因此可能使得提取液中局部DNA损失,导致实验数据偏低;
③在粗提取DNA操作中,频繁地将DNA提取液转移至各个仪器内,可能有极小局部DNA提取液未倒净,残留在仪器壁上损耗掉,导致实验误差;
④在使用移液枪的过程中,可能因为操作不当或移液枪经常错误使用,出现仪器误差,导致吸取的DNA样液不精确,出现实验误差;
⑤在水相中参加乙醇析出DNA时,不是所有DNA均析出,有小局部依旧融在溶液,导致提取出的DNA含量偏低;
⑥标准曲线制作过程中出现些许误差;
总的来讲,本次试验结果是相比照拟成功的,较为粗略地测量出猪肝中DNA的含量,并且较为熟练地掌握了浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术,根本到达了本次实验的目的。
在今后的实验中会着重注意实验操作的严谨性,严格按照实验前拟定完全的实验步骤进行,保证将实验操作过程中可能出现的误差概率降到最低,尽可能到达预期的实验效果,完成自我的学习及锻炼过程。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 动物 肝脏 DNA 提取 检测 实验 报告
![提示](https://static.bdocx.com/images/bang_tan.gif)