分子实验步骤Word文件下载.docx
- 文档编号:17372754
- 上传时间:2022-12-01
- 格式:DOCX
- 页数:15
- 大小:69.18KB
分子实验步骤Word文件下载.docx
《分子实验步骤Word文件下载.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《分子实验步骤Word文件下载.docx(15页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
loadingbuffer.
3、电泳:
恒压80V。
4、凝胶成像仪或紫外透射仪观察记录电泳结果。
三、扩增产物的回收
1.切胶、称胶重,每100mg胶加入700uL溶胶液,550C溶胶(一定要完全溶解)。
2.装柱,12000rpm离心30秒,去除废液。
3.漂洗:
500uL漂洗液,12000rpm,30秒漂洗一次,去除废液,重复漂洗一次。
4.12000rpm,2分钟,换成干净的无菌1.5mL小管。
5.向柱子的正中央加20uL洗脱buffer或无菌水,放置5分钟。
6.12000rpm,30秒。
7.向柱子的正中央加10uL洗脱buffer或无菌水,放置5分钟。
8.12000rpm,2分钟。
9.SYBR检测回收产物
质粒DNA的提取及其定性定量分析
一、质粒DNA的提取
1、接含pETBlue-2质粒的单菌落于4mL含羧苄(50ug/mL)和四环素(12.5ug/mL)的LB液体培养基中,370C,190rpm振荡培养过夜;
2、4000rpm、离心1min,弃去上层培养液收集所有菌体于一个小指管中;
3、150uL溶液I悬浮菌体(旋涡混匀),室温10min;
4、加入200uL溶液II(轻轻混匀!
裂解时间不超过5min),室温静置菌液裂解变清;
5、加入200uL溶液III(轻轻混匀!
),冰上静置15min质粒DNA复性
6、12000rpm,离心10min取上清
7、上清加等体积的酚:
氯仿:
异戊醇(旋涡混匀)
8、12000rpm,离心5min取上清
9、上清加等体积的氯仿:
10、12000rpm,离心5min
11、上清加2倍体积的无水乙醇(旋涡混匀),室温30min
12、12000rpm,离心10min
13、沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次(振荡混匀、离心)
14、12000rpm,离心5min
15、沉淀于超净台中风干
16、沉淀加入20uLRTE,600C水浴30分钟溶解
17、-200C保存
二、质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析
1%琼脂糖凝胶20mL(用1xTAE配)
1xTAE120mL
2uL质粒DNA+0.5uL10xloading
80伏恒压电泳
结果用凝胶成像仪分析照相
三、质粒DNA的紫外吸收分析
质粒DNA用TE缓冲液稀释200倍(总体积300ul),测定A260和A280.
限制性酶切和链接
一、质粒DNA和目的DNA的双酶切
酶切反应体系(20uL)
管号
核酸
10xbufferK
ddH2O
BamHI
HandIII
tube1
目的基因AKP
24uL
3uL
0uL
2uL
1uL
tube2
pETBlue-2
10uL
5uL
37℃保温3小时。
二、酶切产物的纯化和回收
1%琼脂糖凝胶25mL(用1xTAE配)
酶切DNA4ul+0.5uL10xloading
未酶切质粒DNA2ul+0.5uL10xloading
Maker5ul
接着进行扩增产物的回收,每100mg胶用700ul溶胶液来溶解,步骤同第一个实验中扩增产物的回收。
三、载体和AKP的连接
连接反应体系(20ul)
目的基因AKP
载体pETBlue-2
10xLigasebuffer
ddH2O
T4DNA连接酶
14ul
2ul
14℃水浴保温过夜
感受态细胞的制备、连接产物转化克隆菌株
一、感受态细胞的制备
1.预培养:
接NovaBlue单菌落到含12.5ug/mLTet的3mLLB培养基中,370C、190rpm振荡培养过夜
2.取0.4mL预培养菌液转移到含12.5ug/mLTet的40mLLB液体培养基的锥形瓶中,370C、250rpm振荡培养2.5-3小时(OD600=0.4-0.5)
3.将菌液转移到50mL离心管中,冰上放置10min
4.40C,4000rpm,离心10min
5.到出培养液,将管倒置使培养液流尽
6.菌体加入预冷的0.1mol/L的CaCl210mL,用5mL枪头轻轻吹散菌体细胞,冰浴30min
7.40C,4000rpm,离心5min,去上清
8.用冰预冷的0.1mol/L的CaCl22mL用枪轻吹悬浮细胞,冰上操作
9.分装细胞200uL/份,此为感受态细胞(也可于-700C或-200C冻存)
二、连接产物的转化
1、取200uL感受态细胞,加入连接产物10uL
取200uL感受态细胞,加入质粒DNA2uL(5-50ng)(阳性对照)
取200uL感受态细胞,加入2uL无菌水(阴性对照)
取200uL0.1mol/L的CaCl2,加入连接产物2uL(阴性对照)
用枪头混匀,冰上放置30min
2、420C水浴热激90秒
3、冰浴2分钟
4、每管加800uLLB液体培养基,370C慢摇1小时(150rpm)
5、将复苏菌液4000r/min离心1min,先吸去900uL上清,再将细胞吹散成细胞悬液,取50uL细胞悬液直接涂布在选择平板上,正置30分钟后倒置培养过夜(370C)
6、将白色单菌落(蓝斑周围的)接入4ml含抗生素(50ug/mlCarb和12.5ug/mlTet)的LB液体培养基中,震荡过夜。
重组子筛选
一、提取质粒
1、接白斑于4mL含羧苄(50ug/mL)和四环素(12.5ug/mL)的LB液体培养基中,370C,190rpm振荡培养过夜。
2、4000rpm、离心1min,弃去上层培养液收集所有菌体
3、150uL溶液I悬浮菌体(旋涡混匀),室温10min
4、加入200uL溶液II(现用现配轻轻混匀!
裂解时间不超过5min),室温静置菌液裂解变清
5、加入200uL溶液III(轻轻混匀!
6、12000rpm,离心10min取上清
7、上清加等体积的酚:
8、12000rpm,离心5min取上清
9、上清加等体积的氯仿:
二、重组质粒的酶切分析:
37℃酶解1-2小时
三、电泳分析重组质粒
1、1%琼脂糖20mL,含1uLGoldViewTM,80V
2、未酶切质粒
(用未重组的pETBlue-2作为Marker-M1)3uL质粒+0.5uL10xloadingbuffer
3、酶切质粒
(用标准DNA分子作为Marker-M2)9uL质粒+1uL10xloadingbuffer
重组质粒转化表达菌株
接TunerTM(DE3)placI单菌落到含34ug/mLCam的4mLLB培养基中,370C、190rpm振荡培养过夜
2.取0.4mL(400ul)预培养菌液转移到含34ug/mLCam的40mLLB液体培养基的锥形瓶中,370C、250rpm振荡培养2.5-3小时(OD600=0.4-0.5)
5.倒出培养液,将管倒置使培养液流尽
二、转化
感受态细胞200uL,加入2uL阳性重组质粒
感受态细胞200uL,加入2uLpETBlue-2
感受态细胞200uL,加入2uL无菌双蒸水(阴性对照)
0.1mol/LCaCl2溶液200uL,加入2uL阳性重组质粒(阴性对照)
用枪头混匀,冰上放置30min
420C水浴热激90秒
冰浴2分钟
加入800ulLB液体培养基,37oC,150rpm/min,30min。
取50ul细胞悬液直接涂布在含50ug/mLCarb和34ug/mLCam的平板上。
37oC12-16小时。
碱性磷酸酶的原核表达
1、预培养:
分别接一含pETBlue-2-AKP表达质粒和pETBlue-2的单菌落到3mL含50ug/mLCarb、34ug/mLCam和1%Glucose(葡萄糖)的LB液体培养基中,370C、190r/min振荡培养过夜;
2、将过夜培养的菌液0.5mL接种于35mL含50ug/mlCarb和34ug/mlCam的表达培养基中,370C、250rpm振荡培养3小时,至OD6000.6-0.8;
3、加入IPTG(终浓度:
50umol/L),继续在370C、250rpm振荡培养5小时;
4、40C,6000rpm离心10min,菌体沉淀在-200C冻存。
表达产物(AKP)的酶活性检测
一、细胞破碎
1.菌体加入15mL匀浆液
2.超声破碎(超声探头入水深度:
1.5Cm左右,液面高度最好有30mm以上,探头要居中,不要贴壁。
超声波是垂直纵波,插入太深不容易形成对流,影响破碎效率):
输出功率1200w,超声2秒,
间隔10秒,超声次数:
40次
3.细胞破碎液200uL+4x样
品处理液100uL,90℃5min(室温保存SDS电泳备用)
4.取1.0mL细胞破碎液,4℃12,000rpm离心10min
5.留取离心上清液(酶)200uL+4x样品处理液100uL,90℃5min(室温保存SDS电泳备用)
三、酶活性分析
SDS-PAGE和Westernblotting
一、SDS-PAGE
1.洗净胶板,架好和固定好胶板
2.配置12%分离胶(20mL)
3.分离胶混匀后用5mL枪头加入两玻璃夹缝中,并小心在胶面上加入1cm蒸馏水,约20-40min后胶自然凝聚
4.倾斜倒出蒸馏水,配制5%浓缩胶(10mL)
5.浓缩胶混匀后加入两玻璃夹缝
6.在两玻璃板夹缝中垂直插入1.5mm的梳子,浓缩胶凝固后将凝胶装入电泳槽,在槽中加入1×
SDS电泳缓冲溶液,小心拔出梳子
7.电泳加样:
将样品12,000r/min室温离心10min后,按顺序向胶孔中加入适当体积的蛋白样品(20-30uL)和标准样品(10uL)
8.电泳:
接通电源,电压设定为80V开始电泳,当样品进入分离胶时,调节电压使其恒定在100V,当溴酚蓝移动到离底部时,切断电源,停止电泳
9.将胶板从电泳槽中取出,小心从玻璃板上取下凝胶,将凝胶切成两部分
10.含蛋白标准的凝胶部分用R250染色、脱色和观察结果
二、免疫分析
1.另一部分凝胶、滤纸和硝酸纤维素膜分别在转移缓冲液中浸泡至少30分钟
2.正极上铺三层和凝胶一样大小的滤纸,然后依次将硝酸纤维素(NC)膜和凝胶铺在滤纸上,再在凝胶上铺三层滤纸,吸干“三明治”样结构周围的印迹缓冲液,并压另一极上(注意不要有气泡)
3.恒流1.0mA/cm2,电转移1.5hr
4.转移结束后将NC膜取出,用1xPBS溶液配制的5%脱脂奶粉40C封闭过夜,凝胶继续用R250染色以便分析转移的完全程度
5.倒去封闭液,加入1xPBS稀释的一抗(稀释的倍数为ELISA所测效价的1/10),加入的一抗工作液覆盖住膜即可。
370C轻轻摇动,孵育45min
6.1xPBS清洗3次后(每次漂洗5min),加入按1:
200倍稀释的偶联有辣根过氧化物酶的二抗。
37℃轻轻摇动,孵育45min
7.1xPBS清洗3次(每次漂洗5min),用显色液显色至出现清晰条带,加水冲洗终止显色反应。
报告二:
基因组DNA的分离与Southern杂交
一、小鼠基因组DNA的提取
1、取0.2g鼠肝,冰冷生理盐水洗3次,剪碎
2、碎鼠肝转入玻璃匀浆器中,加入2mL匀浆液,匀浆6次(冰上操作)
3、匀浆液转入2mL小指管,4℃,5000rpm离心2min,
4、沉淀加0.8mL无菌水,吹散,分成两份,再加0.4mL酶解液,慢慢颠倒混匀
5、55℃水浴酶解过夜,4℃存放
6、加RNase,终浓度200ug/mL,37℃保温60min
7、加入等体积的酚:
异戊醇轻轻混匀
8、12000r/min离心5分钟,用扩口枪头将上清转入一新管中
9、加入等体积的氯仿:
异戊醇,轻轻混匀
10、12000r/min离心5分钟,用扩口枪头将上清转入一新管中。
重复一次
11、加入1/10体积的醋酸钠(3mol/LNaAcpH5.2),2倍体积的无水乙醇
12、轻轻旋转小指管,可见珠状絮丝,即为染色体丝,用枪头小心吸出液体
13、染色体丝用75%乙醇洗涤2次(每次10000r/min离心5分钟)
14、室温下稍干,加0.2mLTE4℃溶解过夜
二、基因组DNA的酶切
1、在灭菌的1.5mL管中,按下表准备酶切反应体系
2、37℃保温两小时
3、加入1/10体积的3mol/LNaAcpH5.2和2倍体积的无水乙醇
4、室温沉淀20分钟
5、12,000r/min离心10分钟
6、室温干燥
7、加入10uLTE溶解
三、酶切产物的琼脂糖凝胶电泳
0.7-1%琼脂糖凝胶25mL(1×
TAE),含1uLGoldViewTM
加样:
DNAMarker8uL(DL15000或DL2000+)
质粒(T-载体-643bp)10uL+1uL10×
loadingbuffer
酶切产物(鼠肝)10ul+1uL10×
loadingbuffer
基因组DNA(鼠肝)6ul+0.6uL10×
电泳:
恒压80V电泳
当溴酚蓝染料移出凝胶前沿10min后,停止电泳(电泳时间在1小时左右)
凝胶成像仪观察和记录电泳结果
四、Southern转膜
1、(注:
以下操作要戴上一次性手套)用刀片切掉未用过的凝胶区域,并将凝胶切掉一个角(对点样顺序做个标记),然后转至玻璃平皿中
2、在室温下将凝胶浸泡在变性溶液中15分钟,并轻轻摇动
3、更换变性液继续浸泡凝胶20分钟,并轻轻摇动
4、将带正电荷的尼龙膜裁成比凝胶大一毫米大小,并在相应位置上剪掉一个角,再切六张与膜一样大小的滤纸,先用重蒸水浸湿再放入碱性转移缓冲液中浸泡约30min
5、制作夹心饼式的结构(由下至上):
三张潮湿的滤纸\膜\凝胶\三张潮湿的滤纸(胶与膜的切角对齐,千万不要有气泡)
6、在玻璃板上先放上约10cm高的纸巾上,并在其上放上10层同样大小的干滤纸,将夹心饼结构放到其上
7、在其上放两层浸湿转移缓冲液的滤纸(滤纸的两端浸入转移缓冲液中)
8、盖上盖子,让凝胶上的DNA下行转移16小时或过夜
五、Southern预杂交
1、将膜塞入热密封袋中,按每平方厘米0.2mL加入预杂交液
2、尽量将袋中的空气全部挤出,用热封口机密封袋的开口两次
3、轻轻挤压袋子以检查密封的强度是否完整
4、将袋子放在65℃恒温水浴中预杂交过夜
六、Southern杂交
1、迅速将装有膜的塑料袋从水浴中取出,用剪刀剪开一角打开袋子,将预杂交液倒出
2、小心取出膜,转入装有5ml杂交液(含有探针的新鲜预杂交液)的袋子中,尽量将袋中的空气全部挤出
3、热封机封口,轻轻挤压袋子以检查密封的强度是否完整
4、将袋子放在62℃恒温水浴中杂交16小时或过夜
七、洗膜
一洗:
2×
SSC+0.1%SDS15min×
2,室温慢摇
二洗:
1×
三洗:
0.5×
SSC+0.1%SDS20min×
2,65-68℃慢摇
四洗:
0.1×
SSC,15min,室温慢摇
八、检测
1、将膜放入洗涤液中,在15-25℃振摇5min
2、将膜放入封闭液中,保温40min
3、将膜放入抗体溶液(用封闭液1:
5000稀释DIG-Ab-AP)中,保温30min
4、用洗涤液洗涤膜两次,每次20min
5、将膜放入检测缓冲液中,平衡2-5min
6、将膜放入2mL新鲜准备的有色底物溶液(2mL检测缓冲液+40uLNBT/BCIP)中,避光使可见的有色斑点产生(千万不能摇动)
7、待颜色达到所需的程度时,用无菌水或TE浸泡5min即可终止反应
报告三:
植物总RNA的提取及RT-PCR
一、植物总RNA的提取
1、准备细胞裂解液,2.0mL小指管充分混匀:
0.8mL变性液(异硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸钠促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中)
0.2mL2mol/LNaAc(pH4.0)(去除多糖,提供酸性环境)
0.6mL水饱和酚(去除蛋白质和DNA)
2、组织及细胞的破碎:
萌芽五天左右,大约5cm的小麦黄化苗0.2g,立即液氮研磨成粉末状,并尽快转入细胞裂解液中,剧烈振荡至组织分散,室温放置30钟
3、纯化总RNA(杂质的去除)
12000r/min,10min
取上清至2.0mL小指管中(弃沉淀,注意杂质的污染)
加入氯仿0.3mL,剧烈振荡15s(旋涡混匀),室温静置5min
12000r/min,10min
水相转入1.5mL小指管中(弃有机相,注意杂质的污染)
4、纯化总RNA(浓缩纯化)
加0.5倍体积的异丙醇和0.5倍体积的RNA沉淀液,充分混匀
室温静置30min,12000rpm离心10min
沉淀用1mL75%乙醇(用DEPC水配制)洗两次
每次12000r/min,5min
室温稍干燥(5-10min)
沉淀加20uLDEPC水,650C,10min溶解RNA
二、琼脂糖凝胶电泳分析总RNA
1、1%琼脂糖胶20mL,电泳缓冲液1XTAE(用DEPC水稀释)
1μLGoldView
2、6μL样品+1μL10xloadingbuffer,混匀上样
3、80V恒压电泳20分钟,紫外灯下观察结果
三、小麦总RNA的紫外吸收分析
小麦总RNA用DEPC水稀释100倍(总体积400uL),测定OD260和OD280
四、RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应)
1、阳性对照RT-PCR的cDNA第一链的合成(RT)
10uL反应体系:
2xBca1stbuffer5uL
MgSO4(25mM)2uL
dNTPMixture(10mMeach)0.5uL
H2O0.5uL
OligodTPrimer0.2uL
R-1Primer0.5uL
RNaseInhibitor(40U/uL)0.3uL
BcaBESTpolymerase(22U/uL)0.5uL
阳性模板0.5uL
进行如下循环:
65℃,1min;
30℃,5min;
15min内从30℃匀速升温到65℃;
65℃,30min;
98℃,5min;
5℃,5min。
2.阳性对照RT-PCR的PCR扩增
①在0.2mLPCR管中,加入下列试剂混匀即为溶液I:
5xBca2ndbuffer4uL
MgSO4(25mM)1.5uL
F-1引物0.25uL
R-1引物0.25uL
Bca-OptimizedTaq0.2uL
H2O13.8uL
②PCR体系的建立
取5uLRT产物加入上述已准备好的溶液中
③按下列程序进行PCR扩增
94℃,5’
94℃,1’
60℃,1’
72℃,2’
72℃,10’
④扩增产物的分析
1%琼脂糖凝胶20mL,1XTAE
3、实验样品RT-PCR的cDNA第一链的合成(RT)10uL反应体系
2xBca1stbuffer5uL
MgSO4(25mM)2uL
dNTPMixture(10mMeach)0.5uL
H2OYuL
OligodTPrimer0.2uL
特异的下游引物0.5uL
RNaseInhibitor(40U/uL)0.3uL
BcaBESTpolymerase(22U/uL)0.5uL
总RNAXuL(0.5ug)
进行如下循环:
65℃,1min;
15min内从30℃匀速升温到
65℃;
4、实验样品RT-PCR的PCR扩增
①在0.5mL小指管中,加入下列试剂混匀即为溶液I:
5xBca2ndbuffer8uL
MgSO4(25mM)3uL
特异上游引物引物0.5uL
特异下游引物引物0.5uL
Bca-OptimizedTaq0.4uL
H2O27.6uL
在0.2mLPCR管中,按下表配制PCR反应液,25uL反应体系
1%琼脂糖凝胶20mL,1XTAE
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 分子 实验 步骤