钙指示剂分光光度法测定微量钙Word文档下载推荐.docx

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1,最大吸收波长λ

为620nm，方法的表观摩尔吸光系数ε为2.15X10

l/（mol*cm），在此波长及最佳操作条件下，钙含量在0~1.5μg/ml质量浓度范围内符合比尔定律。

在试验了13种常见共存离子干扰的基础上对水样及化学试剂硝酸钠、氯化钾、氯化钠、硫酸钠，中微量钙的测定，回收率在98.0%~100%之间，结果满意。

［关键词］：

钙指示剂；

分光光度法；

钙的测定

Calciumindicatorspectrophotometricmethoddeterminationmicrocalcium

Abstract：

Hasstudiedthecalciumindicatorandthecalciumionfunctioncoloredsystem,experimentedhasaffectedthiscoloredsystem'

ssensitivityandthestableeachfactor,haddeterminedthebestoperatingcondition,theexperimentindicatedthatinpHwasin5.4ethanoicacid-sodiumacetatecushionmedium,thecalciumandthecalciumindicatorformedthecomplexcompoundcoordinatecomparedtowas1:

1,inthewavelengthwas620nm,thesystemapparentmolarabsorptionabsorptivityis2.15X10000l/（mol*cm）,underthiswavelengthandthebestoperatingcondition,thecalciumcontentconformedtotheBilllawin0～1.5μg/mlmassconcentrationscope.Inexperiments13kindofcommoncoexistenceiondisturbanceinthefoundationtothewatersampleandthechemicalreagentnitrateofsoda,thepotassiumchloride,thesodiumchloride,thesodiumsulfate,themicrocalcium'

sdetermination,theresultissatisfied.

Keyword：

calciumindicator；

Calciumdetermination；

Spectrophotometricmethod

钙对细胞的新陈代谢等生命活动起主导调控作用，科学已经证实这说法。

1、钙是生命进化之源：

10亿年前有软体动物，后来经过钙的积聚，4亿年前出现鱼类。

近代人寿命增长很快，但基因的进化比较慢，对现代病的控制基因未能表达，癌症控制基因尚未形成。

钙是形成生命阶梯进化关键性物质，是生命进化之源。

同样是基因进化之源。

2、钙离子参与人体全部生命活动。

3、是人体的物质基础，不论是硬件还是软件，钙是不可缺少的主要成分。

4、是细胞的物质基础，不论是细胞膜、细胞质、细胞核均含有钙，线粒体、高尔基体、内质网都含有丰富的钙。

5、是基因的物质基础，有钙结合蛋白基因，钙泵基因等。

6、是信号系统的物质基础，人体内信号、信息、调控、密码均与钙振荡有关。

7、细胞内钙的物质波，给基因增加能量，改变基因内环境，使基因的复制、调控、修复功能正常化。

99%的钙分布在骨骼和牙齿中，是构成机体组织的主要成分，并使骨骼有一定的硬度，起着支撑身体的作用。

1%的钙分布在血液、细胞间液及软组织中，具有维持脑及心脏功能正常，负担所有正常细胞生理状况的调节及分泌激素、凝固血液等作用，细胞没有钙便不能生存。

钙在人体中的作用如下：

1.维持细胞的生存和功能。

细胞分裂繁殖，数目渐增，与单细胞渐渐改变功能，都需要钙的参加。

钙自细胞外进入，唤醒细胞开始工作，否则细胞一直保持睡眠状态。

钙进入细胞，发出电波，和布满全身的神经纤维，形成人体情报网络，信息的输入经过钙的活动才传到身体各部位。

内分泌腺细胞分泌激素时也必需由钙离子经过血液，到器官中传递信息。

细胞的单个功能和互相联络的网络都不能缺少钙，甚至老化、疾病、死亡都可以用钙的平衡说明。

充分摄入钙质，细胞才能保持健康活跃，人也才能蓬勃和有朝气。

2．降低神经细胞的兴奋性，所以说钙是一种天然的镇静剂。

缺钙会导致神经性偏头痛（占女性的10%--20%）、烦躁不安、失眠。

对婴儿会引起夜惊、夜啼、盗汗。

缺钙还会诱发儿童的多动症。

3．强化神经系统的传导功能。

比如说你的手碰到一杯水，特别热，很快就放下，这中间就有一个神经系统的运作过程：

感受器（皮肤）—传人神经—中枢神经—传出神经—效应器（肌肉）。

其中感受和冲动怎样传递给神经细胞，神经细胞又怎样传出去?

这中间有一种物质叫做神经递质。

钙有助于神经递质的产生和释放。

4．降低（调节）细胞和毛细血管的通透性。

缺钙易导致过敏，水肿等。

5．促进体内多种酶的活动。

缺钙时，腺细胞的分泌作用减弱。

钙还是酶的激活剂。

6．钙有镇静作用，当体液中钙浓度降低时，神经和肌肉的兴奋性增高，肌肉出现自发性收缩，严重时出现抽搐，当体液中钙浓度增加时，则抑制神经和肌肉的兴奋性。

7．钙对维持体内酸碱平衡，维持和调节体内许多生化过程是必需的，它能促进体内多种酶的活动，是多种酶激活剂,如脂肪酶、淀粉酶等均受钙离子的调节。

当体内钙缺乏时蛋白质、脂肪、碳水化合物不能充分利用，导致营养不良、厌食、便秘、发育迟缓、免疫功能下降。

8．钙为一种凝血因子，在凝血酶原转变为凝血酶时起到催化作用，然后凝血酶使纤维蛋白原聚合为纤维蛋白使血液凝固。

钙与磷脂结合，维持细胞膜的完整性和通透性。

钙离子能使体液正常通过细胞膜，通常用来缓解由于过敏等症所引起的细胞膜渗透压的改变。

日常生活中，如果钙摄入不足，人体就会出现生理性钙透支，造成血钙水平下降。

当血钙水平下降到一定阈值时，就会促使甲状旁腺分泌甲状旁腺素。

甲状旁腺素具有破骨作用，即骨骼中的钙离子被反抽出来，藉以维持血钙水平。

在缺钙初期，缺钙程度比较轻的时候，只是发生可逆性生理功能异常，如心脏出现室性早博、情绪不稳定、睡眠质量下降等反应。

持续的低血钙，特别是中年以后，人体长期处于负钙平衡状态，导致甲状旁腺分泌亢进，首当其冲的是骨骼，由于骨骼中的钙离子持续大量释出，导致骨质疏松和骨质增生。

另一方面，在甲状旁腺持续升高的情况下，由于甲状旁腺素具有促使细胞膜上钙通道开启而关不住，以及阻抑钙泵，使钙泵功能减弱，造成细胞内钙含量升高。

持续的细胞内高钙，激发细胞像失控的野马，无节制亢进，造成细胞能量耗竭。

与此同时，代谢废物又得不到及时消除，便会构成自身伤害，致使细胞趋向反常的钙化衰亡。

由于缺钙，导致骨质疏松、骨质增生、儿童佝偻病、手足抽搐症以及高血压、肾结石、结肠癌、老年痴呆等疾病的发生。

　　现代医学研究证明，缺钙会造成人体生理障碍，进而引发一系列严重疾病。

这里我们列举一些与缺钙有关的主要疾病：

　　高血压　缺钙会造成反常的钙内流，导致钙在血管内壁细胞和平滑肌细胞内反常积贮，引起血管收缩，血管外周阻力增大，血压异常升高。

持续的钙内流，促使血管壁弹性纤维和内皮细胞钙化、变性、甚至出现袭痕、断裂。

外周阻力进一步增大，血压持续升高。

由于血管内壁损伤，脂类通透性增大，血脂浸入血管壁的损伤处，造成胆固醇和其他脂类物质在血管壁上沉积。

血管内皮细胞内损伤而分泌内皮素和某些激活因子，引起血小板和白细胞在血管壁上粘附、聚集。

血管内皮细胞的损伤，又激活补偿性生理反应，促使血管平滑肌和成纤维细胞反常增生和内膜下移位，致使动脉管壁增厚、变硬，于是层层叠叠、大大小小的动脉粥样硬化形成了。

研究表明，对于某些高血压病人来说，不用药物而是增加钙制剂的量，有助于控制高血压。

美国南加利福尼亚大学医学院的预防医学副教授杰姆斯·

德威尔对国家统计中心为期13年的调查结果进行计算，发现每天用钙量为1300毫克的人比每天用钙量为300毫克的人患高血压的比例低12％。

　　冠心病　许多研究表明，钙离子还能降低血中胆固醇的浓度，从而起到保护心脏的作用。

有人观察，让胆固醇含量较高的男子食用含钙量低的食物10天（每天410毫克钙），检查他们胆固醇含量；

然后再让他们吃含钙量高的食物（每天2200毫克钙）。

结果高钙食物能减少胆固醇总量6％，其中低密度脂蛋白减少11％，而对人体有益的高密度脂蛋白数量则保持不变。

专家认为，长时期严重缺钙会引发冠心病。

　　尿路结石　多年来，医生告诉肾结石病人限制食用钙，理由是钙为结石的一种主要成分。

但是，美国哈佛大学的医学专家经过多年研究后发现，这可能是人类在认识上的一个大错误。

他们提出，减少肾结石危险的方法恰恰是增加钙摄入量。

大家知道，饮食中，特别是蔬菜中含有大量草酸盐，一般情况下，草酸盐在肠道内与钙结合成草酸钙，随粪便排出。

如果饮食中钙的摄入不足，就会使多余草酸盐，经肠腔吸收而进入血液，最终由肾脏提出。

如果人体长期处于负钙平衡状态，肾脏细胞不可避免会出现细胞反常钙内流损伤，肾脏回吸收功能减退，尿钙排出增多。

高钙尿液与尿中草酸盐结合，形成大大小小草酸钙结石。

如果不忌钙，而是采取补钙措施，尤其是补充水溶性钙剂，那么，在胃肠道中钙离子与饮食中草酸盐合成草酸钙，随粪便排出。

另外，补充足量的钙可扭转负钙平衡，肾脏回吸收功能正常，尿钙排出减少，结石的可能性也减少。

　　结（直）肠癌　高脂饮食会过度刺激胆汁的分泌，过量的脂肪酸和胆汁酸是引起结（直）肠细胞癌变的触发剂。

有研究证明，患有结肠直肠癌的病人，血清胆汁酸的含量比正常人高出1倍左右，而癌变细胞中胆汁酸含量比正常细胞高3倍以上。

如果用高胆汁酸的饲料喂小白鼠，结（直）肠癌的发生率明显增加。

如果补充足量的碳酸钙，钙离子与脂肪酸和胆汁酸结合，形成不溶性脂肪酸钙和胆汁酸钙，随粪便排出，从而消除癌变的触发因子，就能阻抑肠细胞癌变。

　　手足搐搦症　这种疾病是因婴幼儿体内缺少维生素D而使肠道对钙、磷的吸收发生障碍。

另外由于甲状旁腺未能及时分泌更多甲状旁腺素，以致血钙降低，引起神经肌肉的兴奋性增高，出现全身惊厥、手足痉挛和喉痉挛，常伴发阵发性呼吸暂停和短时间窒息，引起缺血缺氧性脑损伤。

据医学观察，大脑神经对缺血缺氧最为敏感，窒息10秒钟，神经功能开始出现障碍；

窒息数分钟，就会出现血管神经不可逆转的损伤，轻则影响孩子智力，重则导致低能、痴呆。

所以，做好手足搐搦症的预防工作是十分重要的，不管是母乳喂养还是人工喂养的孩子，都必须补充足够量的钙。

除了补钙外，还要增加户外活动，多晒太阳和补充适量维生素D，以预防手足搐搦症的发生。

　　骨质疏松　人体长期缺钙而引起负钙平衡的另一个严重后果——骨质疏松。

很多研究表明，增加钙的摄入量对骨质损耗有着重要减缓作用，在减少由骨质疏松引起的骨折率方面也有着重要作用，特别在食用钙的同时服用维生素D，效果尤其明显。

很多专家认为，补钙应在青春期就开始，这时候骨质正在形成，效果会更好。

　钙离子广泛存在于自然界中，人体血清中钙离子浓度是重要的生理指标之一，许多疾病都与血清中钙离子浓度有关。

1883年Ringer发现钙离子是引起心脏收缩不可缺少的因素以来,人们就逐渐认识到，钙离子在生物体中的功能,尤其是在细胞中的功能。

因此快速准确地测定血清中钙离子浓度具有十分重要的临床分析意义与理论价值。

目前测定钙离子浓度大致有以下几种方法：

1.分光光度法。

2.Clark法采用草酸直接沉淀钙离子,然后用标准高锰酸钾溶液滴定。

3.Roweyu于1929年报道的光度法,是一种先用磷酸盐沉淀,然后进行比色测定的方法。

4.原子吸收和火焰分光光度法。

5.荧光光度法,是用荧光钙试剂或类似的荧光化合物测定血清中钙离子浓度的方法。

6.离子选择电极法。

本文研究了分光光度法测定水和化学试剂中微量钙离子浓度的方法。

水和化学试剂中微量钙含量的测定在许多工业部门都是很重要和经常性的，目前已有的方法较多，但仍不能满足实际需求，如EDTA络合滴定法和重量法等灵敏度均较低；

离子选择性电极所用的硬度电极性能不稳定且使用寿命短不受欢迎；

原子吸收光谱法仪器价格较高不便普及，具有较高灵敏度的分光光度法研究了钙指示剂与钙的显色反应，确定了该方法测定水和化学试剂中钙的最佳条件后，用于化学试剂中微量钙和合成的有机磷水处理剂对工业循环水处理后的钙测定，可得到较好结果，与EDTA络合滴定法比较，结果一致，对于空白钙低的样品，显示出较高的灵敏度。

实验结果表明,在pH为5.4的乙酸-乙酸钠缓冲介质中，钙指示剂与钙生成蓝色1：

1的配合物，在波长λ为620nm，体系表观摩尔吸光系数ε为2.15X10

l/（mol*cm），在此波长及最佳操作条件下，钙含量在0～1.5μg/ml质量浓度范围内符合比尔定律。

可见此方法用于微量钙的测定,具有稳定性好、灵敏度和准确度高、试剂和仪器廉价、操作简便快速,结果令人满意等优点。

一、实验部分

（1）721型分光光度计一台；

（2）PHS—10B型酸度计（上海第三分析仪器厂）；

（3）pH为5.4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；

（4）0.1%（质量分数）钙指示剂：

称取0.10g钙指示剂〔2-羟基-1-（2-羟基-4-磺酸-1-萘偶氮）-3-萘甲酸〕（C21H14N2O7S）或其钠盐与100g在105℃干燥的氯化钠，置于研钵中研细混匀。

贮存于棕色磨口瓶中。

（5）100.0μg/ml钙储备液：

准确称取经2h在120摄氏度烘干的基准AR级碳酸钙0.2497g于小烧杯中，加少量去离子水润湿，缓慢加入3mol/l盐酸使之完全溶解，煮沸除去二氧化碳，冷却后转入容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀。

（6）10.00μg/ml钙标准溶液：

移取100.0μg/ml钙储备液10.00ml于100ml容量瓶中，并用去离子水稀释至刻度，摇匀。

于100ml的洁净容量瓶中，依次加入10.00μg/ml钙标准溶液10.00ml，3ml0.1%（质量分数）钙指示剂，5mlpH为5.4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用水稀释至刻线，摇匀，放置10min，用1cm吸收池，以试剂空白溶液为参比溶液，在波长为620nm处测定显色液的吸光度。

二、试验结果与讨论

取两个100ml洁净的容量瓶，移取10.00μg/ml钙标准溶液10.00ml于其中一个100ml容量瓶中，然后在两个容量瓶中依次加入3ml0.1%（质量分数）钙指示剂，5mlpH为5.4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用去离子水稀释至刻线，摇匀，放置10min，用1cm的吸收池，以试剂空白溶液为参比溶液，在波长为550-660nm之间，每隔10nm测定一次吸光度，在峰值附近每隔2nm测定一次吸光度。

以波长为横坐标，吸光度为纵坐标确定最大吸收波长。

钙的吸收曲线

λ

550

560

570

580

590

600

610

616

A

0.239

0.274

0.290

0.331

0.374

0.443

0.497

0.518

618

620

622

624

630

640

650

660

0.525

0.528

0.526

0.522

0.500

0.451

0.402

0.361

吸光度与波长的表

（1）

由以上的数据与曲线可知，显色体系的最大吸收峰在620nm处。

取两个100ml洁净的容量瓶，移取10.00μg/ml钙标准溶液10.00ml于其中一个100ml容量瓶中，然后在两个容量瓶中依次加入3ml0.1%（质量分数）钙指示剂，5mlpH为5.4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用去离子水稀释至刻线，摇匀，放置5min，立即用1cm的吸收池，以试剂空白溶液为参比溶液，在波长为620nm处测定吸光度，以后隔10、20、30、60、420min各测定一次吸光度。

t/min

5

10

20

30

60

420

0.527

吸光度与显色时间表

（2）

体系在室温下很快显色，放置5min后可显色完全并达到稳定，本试验用放置10min后测定，显色完全后体系至少可稳定7h。

取11个100ml洁净的容量瓶，各加入10.00μg/ml钙标准溶液10.00ml，然后依次加入3ml0.1%（质量分数）钙指示剂，5mlpH为3.6、4.0、4.4、4.8、5.0、5.2、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0、7.4的不同酸度的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用去离子水稀释至刻线，摇匀。

放置10min，用1cm的吸收池，以试剂空白溶液为参比

溶液，在波长为620nm处测定各溶液吸光度。

编号

1＃

2＃

3＃

4＃

5＃

6＃

pH

3.6

4.0

4.4

4.8

5.0

5.2

0.201

0.325

0.430

0.502

0.520

7＃

8＃

9＃

10＃

11＃

12＃

5.4

5.8

6.2

6.6

7.0

7.4

0.530

0.538

0.544

0.482

0.363

0.223

吸光度与pH表（3）

由表可知，溶液的pH在3.6~7.4之间逐渐，但在pH=4.80~6.20范围内吸光度最大且稳定，实验本试验用pH为5.40的乙酸-乙酸钠缓冲溶液控制酸度，用量在5ml左右可把pH控制在适宜范围。

取5个100ml洁净的容量瓶，各加入10.00μg/ml钙标准溶液10.00ml，然后依次加入0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml0.1%（质量分数）钙指示剂，5mlpH为5.4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用去离子水稀释至刻线，摇匀。

放置10min，用1cm的吸收池，以试剂空白溶液为参比溶液，在波长为620nm处测定各溶液吸光度。

1

＃

V/ml

1.0

2.0

3.0

0.264

0.496

吸光度与显色剂的用量表（4）

因此：

对显色剂用量为0,1.0,2.0,3.0，4.0，5.0mL时进行了实验，试验表明：

0.1%（质量分数）钙指示剂用量在2.0—5.0ml内吸光度最大且稳定，实验选用3ml。

取5个100ml洁净的容量瓶，各加入10.00μg/ml钙标准溶液5.00ml，然后依次加入含钙的质量为25、50、75、100、125μg的钙指示剂，5mlpH为5.4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用去离子水稀释至刻线，摇匀。

m/μg

25

50

75

100

125

0.132

0.248

0.267

吸光度与配合物的组成的表（5）

配合物的组成由摩尔比法可测得配合物中钙与钙指示剂的络合比为1：

1。

取7个100ml洁净的容量瓶，各加入10.00μg/ml钙标准溶液0、3.00、6.00、9.00、12.00、15.00、18.00ml，然后依次加入3ml0.1%的钙指示剂，5mlpH为5.4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用去离子水稀释至刻线，摇匀。

0.00

3.00

6.00

9.00

12.00

15.00

18.00

0.161

0.320

0.477

0.633

0.790

0.95

工作曲线表（6）

因此在选定实验条件下，钙含量在0~1.5μg/ml内符合比尔定律。

从工作曲线计算出摩尔吸光系数ε=2.15X10

l/（mol*cm）

测定50ug/100mL钙,结果表明:

相对误差不超过±

5%时，下列13种共存离子不干扰钙测定的允许量（以g计）为:

钾离子（8）,钠离子（8）,二价铁离子（0.0002），铝离子（0.0002）,二价铜离子（0.0004），锌离子（0.0004），二价锰离子（0.0004），钡离子（0.0004），三价铁离子（0.0004），二价镁离子（0.00012）,氯离子（12）,硝酸根离子（8）,溴离子（4）。

试验常用的干扰抑制剂EDTA,、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、三乙醇胺,8-羟基喹啉、硫代硫酸钠等。

对铜干扰的抑制效果，结果表明，加人柠檬酸可以消除铜的干扰，并对其他元素无影响，同时三乙醇胺可以消除铁、铝的干扰。

三、样品分析

硫酸钠：

准确称取10.0000g硫酸钠，用少量蒸馏水溶解后，定容于100mL容量瓶中.依次加入3ml0.1%的钙指示剂，5mlpH为5.4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用去离子水稀释至刻线，摇匀。

由工作曲线计算出试液中钙含量，样品分析结果见表（7）：

试样

硫酸钠

测定结果/（μg/g）

7.107.097.107.097.10

平均值/（μg/g）

7.10

相对平均偏差/（%）

0.056

加入量（μg）

100.0

测得量（μg）

99.1

回收率

原子吸收光谱/（μ