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10-6微克)
生物种类肾细胞肝细胞红细胞精子
家鸡2.42.52.51.3
牛6.46.4—3.3
鲤鱼—3.03.31.6
人5.65.6—2.5
3.核酸是一种线状结构,是由4种核苷酸聚合而成的生物大分子,由于4种核苷酸的随机排列,它可携带大量的遗传信息。
4.能改变DNA结构的各种因素都可引起基因突变或染色体变异。
如诱发生物产生突变的紫外线最有效的波长是260nm,而DNA吸收紫外线最多的波长也是260nm。
亚硝酸诱发突变也是由于它能破坏DNA分子的碱基结构,使碱基配对错误或DNA的复制发生改变。
三、核酸是遗传物质的直接证据
上述间接证据只能说明核酸可作为遗传物质,下列3个经典试验证明核酸可控制性状的发育。
1.肺炎双球菌的转化
肺炎双球菌(Diplococcuspnerumoniae)有2种不同的类型:
一种是光滑型(S型),细胞被一层多糖类胶状膜——荚膜所保护,使它们可以不被宿主的正常防护机构所破坏,具有毒性,菌株能引起人的肺炎和小鼠的败血症,它们在培养基上形成光滑的菌落。
另一种是粗糙型(R型),没有荚膜,不引起人的肺炎和小鼠的败血症,在培养基上形成粗糙的菌落。
R型与S型的各种抗原型都比较稳定,在一般情况下不发生互变。
在1928年,Griffith发现用高温杀死的S型细菌和活的无毒的R型细菌注射到小鼠体内,不仅很多小鼠因败血症而死亡,而且从它们心脏血液中找到了活的S型细菌。
活的R型细菌或死的R型细菌分别注射小鼠时,都不引起败血症(表3-2,图3-1)。
这说明S型肺炎双球菌必然含有某种促成这一转变的活性物质。
但当时并不知道这种物质是什么。
表3-2肺炎双球菌的转化试验
转化源小鼠的反应提取物的类型
S型菌败血症S型菌
R型菌健康—
死S型菌+R型菌败血症S型菌
S型蛋白质+R型菌健康—
S型DNA+R型菌败血症S型菌
16年后,Avery0.T.(1944)等用生物化学方法证明这种活性物质是DNA。
他们不仅成功地重复了Griffith的试验,而且他们把活的S细菌中的DNA、蛋白质和荚膜物质提取出来,然后分别与活的R型细菌混合,结果发现,只有DNA能使R型细菌转变为S型。
之所以确认导致转化的物质是DNA,是因为该提取物不受蛋白酶、多糖酶和核糖核酸酶的影响,而只能为DNA酶所破坏。
最后还证明,DNA纯度越高,转化效果越明显。
结论:
肺炎双球菌的遗传物质是DNA。
2.噬菌体的侵染与繁殖
Hershey和Chase1952年用同位素32P和35S分别标记T2噬菌体的DNA与蛋白质。
因为磷是DNA的组分,蛋白质中无磷;
而硫是蛋白质的组分,并不存在于DNA。
然后用标记的T2噬菌体(32P或35S)分别感染大肠杆菌,经10min后,用搅拌器甩掉附着于细胞外面的噬菌体外壳。
发现在用32P标记的情况下,基本上全部放射性见于细菌内而不被甩掉并可传递给子代。
在用35S标记的下,放射性大部分见于被甩掉的外壳中,细菌内很少或没有放射性,且不能传递给子代(图3-2)。
这样看来,主要是由于DNA进入细胞内才产生完整的噬菌体。
所以说DNA是在世代传递上控制性状发育的遗传物质。
3.烟草花叶病毒的重建
烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)是由RNA(不是DNA)与蛋白质组成的管状微粒,它的中心是单螺旋的RNA,外部是由蛋白质组成的外壳。
如果将TMV的RNA与蛋白质分开,把提纯的RNA接种到烟叶上,可以形成新的TMV而使烟草发病;
单纯利用它的蛋白质接种,就不能形成新的TMV,烟草继续保持健壮。
如果事先用RNA酶处理提纯的RNA,再接种到烟草上,也不能产生新的TMV。
这说明在不含DNA的TMV中,RNA就是遗传物质。
Rraenkel-ConratH.和SingerB.把2种病毒分离,然后交叉混合,再感染烟草。
结果是,如果把TMV的RNA和另一种病毒——霍氏车前病毒(Holmesribgrass,HR)的蛋白质混合感染,烟草叶片出现TMV特征;
若用HR的RNA与TMV的蛋白质混合感染,则烟草叶片表现出HRV的特征(图3-3)。
从这个试验中看到,在无DNA的生物中,RNA是遗传物质。
综上所述,遗传物质主要是DNA,有时是RNA。
第二节核酸的结构和复制
核酸存在于一切活细胞或病毒中,核酸可分为DNA和RNA2类。
一、核酸的分子组成
核酸(nucleicacid,NA)是一种高分子的化合物,组成核酸的基本单位是核苷酸(nucleotide,Nt),每个核苷酸包括3部分:
五碳糖、磷酸和环状的含氮碱基;
这种碱基包括双环结构的嘌呤(purine)和单环结构的嘧啶(pyrimidine)。
两个核苷酸之间由3′和5′位的磷酸二酯键相连。
核酸也可称为多聚核苷酸(polynucleotide)。
核酸水解产生核苷酸,核苷酸水解产生核苷(nucleoside)和磷酸,核苷进一步水解成五碳糖和含氮碱基。
核酸的分子组成如图3-4、5所示。
腺嘌呤和脱氧核糖结合成脱氧腺苷,核苷再与磷酸结合形成核苷酸,称为脱氧核苷-5′-磷酸或脱氧腺苷酸,简称腺苷酸。
其他核苷酸的名称或来源都可依此类推。
4种碱基(A、G、C、T)+脱氧核糖→脱氧核苷+磷酸→4种脱氧核苷酸
→n个脱氧核苷酸聚合→单链DNA→互补成双链DNA
4种碱基(A、G、C、U)+核糖→核苷+磷酸→4种核苷酸→n个核糖核苷酸聚合→RNA
图3-4核酸的分子组成
二、DNA的分子结构
DNA分子结构是J.D.Watson和F.H.C.Crick(1953)首先阐明的。
他们是依据一些前人所得出的证据而提出的DNA双螺旋结构
1.提出DNA双螺旋证据
(1)DNA是一条许多脱氧核苷酸构成的长链:
在Watson和Crick之前已经证实DNA的一级结构是由许多脱氧核苷酸构成的长链,自然界的DNA并不以单链存在,而是以2条或2条以上的链通过某种方式结合的形式存在。
DNA分子是细长的,而且有一定的坚硬度,因此与水形成十分粘稠的溶液。
(2)Chargaff(1949~1951)研究不同生物的DNA得到以下实验结果:
①嘧啶核苷酸的总数(T+C量)总是等于嘌呤核苷酸的总数(A+G量);
②A量总是等于T量,G量总是等于C量,但A+T的量不一定等于G+C的量。
(3)根据R.Franklin等关于DNA晶体的X射线衍射分析表明,DNA是由许多亚单位叠合在一起构成的,每一层的间距是0.34nm,还表明DNA是一个长链高分子,在整个线状分子的长度上,分子的直径是衡定的。
2.DNA双螺旋的分子结构
根据以上试验证据,Watson和Crick提出了DNA双螺旋模型,这个模型的结构要点如下(图3-6):
(1)DNA分子是两条成对的多核苷酸链,以双螺旋的方式按一定空间距离相互平行盘绕:
其中每条多核苷酸链都是DNA双链分子的半分子。
每条单链都由相互交替连接的脱氧核糖和磷酸根所构成,而碱基则是跟戊糖-磷酸链相垂直。
一条链上的碱基与另一条链上的碱基以氢键相结合,因此,两条半分子长链从头至尾通过碱基对的氢键联系在一起。
(2)两条半分子多核苷酸链方向相反:
从图3-6看出单链DNA的戊糖-磷酸骨架在脱氧核糖和磷酸根之间是通过3′-5′磷酸二酯键连接起来,前一个脱氧核糖3′位碳原子与后一个糖分子5′碳原子上的磷酸根相连,因此它们是不对称、有极性的。
如果每一单链的起始端是5′位碳原子,那么末端必定是3′位碳原子。
如果把一条单链称为5′→3′,另一条单链则为3′→5′。
(3)两条链的碱基以严格的互补关系配对:
即腺嘌呤(A)一定与胸腺嘧啶(T)配对,鸟嘌呤(G)一定与胞嘧啶(C)配对,这称为碱基互补原则或Chargaff法则。
在DNA分子中,A与T是以2个氢键相连,G与C是以3个氢键相连(图3-7)。
所以,在含G-C碱基对多的片段,结构较牢固。
根据碱基互补原则,若测知某条DNA分子的一种碱基的含量,即可求出其他3种碱基的含量。
如在某种生物的DNA分子中,经测知含15%的胞嘧啶,那么其他3种碱基的含量则为G=15%,A=35%,T=35%。
(4)在DNA双螺旋中,各种空间距离非常固定:
螺旋的直径是2nm(1nm=10-9m),每旋转1圈的高度是3.4nm,相邻的两对核苷酸(或碱基)对间的距离是0.34nm,即螺旋一圈含有10对碱基。
那么若已知某DNA的长度,就可求出该分子所含的核苷酸对数。
例:
大肠杆菌(E.coli)的染色体是由1100μm的DNA组成的,它包含多少对碱基?
解:
由于已知两核苷酸对间的距离为0.34nm,
所以E.coli含有的核苷酸(碱基)对数为:
1100×
103/0.34=3.235×
106(对)
人类单倍体细胞中约有3×
109对核苷酸,二倍体细胞中DNA的长度应为多少?
∵两碱基对间相距0.34nm
∴人的二倍体细胞中DNA总长度为:
3×
109×
0.34×
10-9×
2=2.04(米)。
(5)4种碱基在1条DNA单链上可随机排列:
从A、G、C、T4种碱基中任选2种在一条单链上作全排列的形式就有42=16种,即AA、AT、AG、AC、GA、GT、GC、GG、CA、CG、CC、CT、TA、TG、TC、TT。
假设一条DNA单链含有100个核苷酸,按全排列方式推算,应有4100种不同的排列结构,可见数目是非常大的。
现已知大多数生物体的基因约含1000对碱基,而基因数一般在千、万个以上,所以DNA分子内贮存的遗传信息是相当丰富的。
(6)不同物种DNA的4种碱基含量各不相同(表3-3)
表3-3不同物种中DNA的碱基成分百分比
物种鸟嘌呤(G)腺嘌呤(A)胞嘧啶(C)胸腺嘧啶(T)A+G/A+CG+C/A+T
人19.930.919.829.41.030.66
小麦23.825.624.626.00.970.94
洋葱18.431.818.231.31.010.58
菜豆20.629.720.129.61.010.69
酵母18.331.717.432.61.000.56
大肠杆菌26.024.725.723.61.021.07
T2噬菌体18.232.516.832.51.020.54
3.DNA结构的变异类型
近年来发现DNA的构型并不是固定不变的,除主要以Crick和Watson提出的的右手双螺旋构型存在外,还有许多变型。
所以现在一般将Crick和Watson提出的双螺旋构型称为B-DNA。
这种B-DNA是DNA正常生理状态下的构型。
活细胞中绝大多数DNA是B-DNA。
但当外界环境条件发生变化时,DNA的构型也会发生变化。
当DNA在高盐浓度下时,则以A-DNA形式存在。
A-DNA是DNA的脱水构型,它也是右手螺旋,但每螺旋一圈含有11个核苷酸对。
A-DNA比较短和密,其平均直径为2.3nm。
大沟深而窄,小沟宽而浅。
在活体内DNA并不以A构型存在,但细胞内DNA-RNA或RNA-RNA双螺旋结构,却与A-DNA非常相似。
现在还发现,某些DNA序列可以以左手螺旋的形式存在,称为Z-DNA(图3-8)。
某些DNA序列富含G-C,并且在嘌呤和嘧啶交替出现时,可形成Z-DNA。
Z-DNA除左手螺旋外,每螺旋含有12对碱基,分子直径为1.8nm,只有一个深沟。
表3-43种DNA结构的差异
双螺旋碱基倾角(°
)碱基间距/nm碱基直径/nm每轮碱基数螺旋方向
A-DNA200.262.311右
B-DNA60.342.010右
Z-DNA70.371.812左
DNA结构除上述构型变化外,在体内还以正超螺旋的形式存在。
从病毒到高等生物,DNA在生物体内均表现为负超螺旋(negativesupercoil)形式。
负超螺旋是DNA复制过程中,在拓扑异构酶(topoisomerase)和溴乙锭的存在下形成的。
现在已有很多证据表明,这种负超螺旋结构与DNA复制、重组以及基因的表达和调控有关。
而正、负超螺旋的变化反映了DNA在不同环境条件的变化。
三、RNA的分子结构
至于RNA的分子结构,就其化学组成上看,也是由4种核苷酸组成的多聚体。
它与DNA不同,首先在于以U代替了T,其次是用核糖代替了脱氧核糖,再次是绝大部分RNA以单链形式存在,但可以折叠起来形成若干双链区域。
在这些区域内,凡互补的碱基对间可以形成氢键(图3-9)。
有一些以RNA为遗传物质的动物病毒含有双链RNA。
RNA分子结构的研究比DNA晚,这是因为细胞中的DNA比RNA较稳定。
现已知RNA大致分为3类,即mRNA、tRNA、rRNA,但它们的结构却干差万别,长度也不一样。
它们的结构特点主要有以下几方面:
(1)RNA一般是单链结构,骨架是由核糖和磷酸分子间隔排列构成的,碱基与核糖相连。
(2)有些RNA常以碱基配对的形式卷曲起来,形成多种空间结构。
例如tRNA可形成三叶草结构,rRNA也可拆叠,但mRNA多以线状形式存在。
(3)4种碱基在RNA分子中的排列依DNA的碱基顺序而定,由于它是以DNA为模板转录来的,所以也可蕴藏着丰富的遗传信息。
四、两种核酸的区别
经过分析,DNA和RNA既有相同处,又有不同处。
其共同点是:
都是由核苷酸组成的多聚体,且是长链大分子;
4种碱基在一条单链上可随机排列,可形成4n种排列方式,也能贮存大量的遗传信息。
然而,2种核酸也存在着多方面的差异。
主要表现在:
1.组成核酸的糖分子不同
DNA是脱氧核糖;
而RNA是核糖。
2.构成核酸的碱基不同
DNA含有A、G、C、T4种碱基;
RNA中除主要含有A、G、C、U4种碱基外,还含有少量的稀有碱基,如甲基化的碱基和假尿嘧啶等。
3.多聚核苷酸链的结构不同
DNA通常是双链,以双螺旋的方式形成主体结构,只在少数病毒中有单链DNA;
而RNA通常是单链结构,tRNA可在多点上进行折叠,但在极少数病毒中,也有双链RNA。
4.产生的途径不同
DNA常由半保留复制方式产生,只在极少数病毒中,由一种反转录酶,以RNA为模板,反转录出单链DNA,继而再互补成双链DNA(cDNA);
而RNA常是以DNA为模板转录产生的,但在极少数病毒中也可以通过复制而产生。
5.在真核生物细胞内存在的部位不同
DNA多位于细胞核内,只有很少一部分存在于细胞质中,而且主要分布在叶绿体和线粒体内。
RNA多存在于细胞质中,如rRNA与蛋白质结合成核糖体,tRNA存在于细胞质基质内,可携带氨基酸,仅有少部分留在细胞核内,成为染色体的组成成分及形成核仁等。
6.行使的功能不同
DNA通过复制可把遗传信息贮存并传递给子代,通过转录将信息传递给RNA;
而mRNA可作为蛋白质合成的模板,rRNA与蛋白质结合成核糖体,是蛋白质合成的场所,tRNA可携带氨基酸,并将氨基酸安放在mRNA的特定位置上,它们共同作用将核酸的信息转译成蛋白质。
五、DNA的复制(DNAreplication)
绝大多数DNA的复制是在细胞分裂间期的S期中进行。
复制的简要过程是:
①DNA双链分子的碱基对间的氢键逐步脱开,两条多核苷酸链彼此逐渐分开;
②双链一面分开,一面以每一条单链为模板各自将对应的核苷酸聚合起来;
③新核苷酸链与原有的多核苷酸链形成新的双螺旋。
这样,在DNA聚合酶和其他多种酶的作用下,一个DNA分子就复制为两个结构上完全相同的DNA分子(图3-10)。
亲代DNA分子
(1)的螺旋打开,每一条链作为新链合成的模板
(2),最后形成两条相同的新DNA分子(3)
1.DNA复制是半保留方式
DNA复制所产生的两条新DNA分子与原来的DNA分子完全相同。
由于每条子代DNA分子的两条核苷酸链中,一条来自亲DNA分子,另一条是新合成的,所以这种复制方式称为半保留复制(semi-conservativereplication)。
关于半保留复制方式的机理最初是Watson和Crick(1953)根据实验提出的模型。
在1958年Meselson和Stahl用实验证实了这一设想。
他们采用了氯化绝离心实验(图3-11)。
把大肠杆菌在含15N的NH4Cl的培养基中培养15代,使所有的细菌DNA都被15N标记,然后把细菌迅速转移至含14N的NH4Cl的培养基中培养,在不同间隔时间取出样品,将细胞裂解,把裂解液放在CsCl密度梯度中离心(60000转/分,48小时)。
由于在超速离心时,Cl–和Cs+被强大的离心力抛向离心管底部,但离子扩散力又使这些离子上浮,2种相反力达到平衡时,在离心管中形成CsCl分布梯度,从离心管顶端往下浓度逐渐递增,越向下密度越大。
不同的DNA分子将按照各自的密度停留在相应的密度的某一位置上,形成一条带。
在正常情况下,可以在紫外光下观察到不同密度的DNA分子不同位置上形成区带。
当把所有的细菌分别进行离心后发现,经15N标记的DNA在离心管下层形成一条带(下层带);
经在14N中培养一代的DNA,由于含有一重链(15N)和一轻链(14N),结果有有一条带,位于15N和14N的带之间(中间带);
而在14N中生长两代的DNA,又经过了一次复制,形成一条l4N/15N杂种分子(中间带)和一个14N/14N的轻分子(上层带),即在离心管中形成2条带:
一条带位于14N和15N中间,另一条同14N带相一致。
这样就证明了DNA复制是半保留的,并有力地否定了DNA的全保留和不保留等复制方式。
2.DNA复制的方向是按5′→3′进行的
复制过程中,新加入的脱氧核苷三磷酸(dNTP)总是以它的5′位磷酸与DNA链上3′端的–OH-缩合脱去焦磷酸,形成了3′磷酸酯键。
也就是说,DNA新链的延伸生长总是在3′端。
那么复制方向总是5′→3′。
3.DNA复制所需的各种酶
DNA复制是一个非常复杂的酶促过程,它需要30多种酶和蛋白质共同作用。
人们常把这些酶和蛋白质称为复制体系,其中一部分酶和蛋白质结合在一起,协同动作,构成复杂的复制体系——复制体(replisome)。
(1)DNA聚合酶(DNApolymerase)
DNA聚合酶在不同的生物中其结构、功能各不相同(表3-5)。
表3-53种大肠杆菌DNA聚合酶的性质比较。
性质聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ
3′→5′
外切校正+++
5′→3′外切校正+——
新生链的合成或聚合——+
相对分子质量/10310390900
细胞内分子数400?
10~20
生物学活性10.0515
已知的结构基因polApolBpolC(dnaE、N、Z、X、Q等)
在真核细胞中主要有5种DNA聚合酶,分别称为DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε,其特性如表3-6。
真核细胞的DNA聚合酶和细菌DNA聚合酶基本性质相同,均以dNTP为底物,需Mg2+激活,聚合时必须有模板链和具有3′-OH末端的引物链,链的延伸方向为5′→3′。
但真核细胞的DNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶活性,推测一定有另外的酶在DNA复制中起校对作用。
真核生物中的DNA聚合酶α的功能主要是引物合成;
β活性水平稳定,可能主要在DNA损伤的修复中起作用;
δ主要负责DNA复制的酶,参与前导链和后随链的合成;
ε的主要功能可能是去掉RNA引物后把缺口补全。
表3-6真核生物DNA聚合酶的特性比较
性质聚合酶α聚合酶β聚合酶γ聚合酶δ聚合酶ε
外切校正无无有有有
5′→3′外切校正无无无无无
功能DNA引物合成损伤修复mtDNA复制核DNA复制核DNA复制
在细胞内分布核内核内线粒体核内核内(?
)
亚基数4122~3≥1
(2)DNA连接酶
DNA聚合酶虽能充填缺口,甚至聚合了很长的DNA互补链,但都无法使缺口接合,只有DNA连接酶可以完成这一任务。
在当缺口的3′-OH和5′-P相邻并且各自的碱基处于配对状态时,DNA连接酶才能起作用(图3-12)。
由于连接反应是在3′-OH和5′-P之间进行。
因此必须水解ATP或NAD供应能量,真核生物中连接酶使用ATP,E.coli使用NAD。
(3)螺旋酶(helicases)或解旋酶
是促进DNA的两条互补链分离的一类酶,细胞中含有多种螺旋酶。
它们的功能相互重迭或平行。
这大概是由于许多反应都需要DNA螺旋的分离,特别是DNA复制这个精确度要求特高的反应更是如此。
绝大多数螺旋酶在解链过程中都需要水解ATP供应能量,它们具有依赖于DNA的ATPase活性。
螺旋酶可以分为两类:
一类是反应后酶分子按化学计量方式与产物单链DNA结合,如螺旋酶Ⅰ螺旋酶Ⅱ,另一类是仅仅催化DNA双链的分离,它们常与单链DNA结合蛋白(简称SSB蛋白)配合,以防止链间或链内“退火”。
如E.coli的rep蛋白,螺旋酶Ⅲ,T4的基因4蛋白等。
人们相信,在E.coli中rep蛋白是最主要的螺旋酶,它解开一个碱基对,需要水解2个ATP分子。
(4)DNA旋转酶
是大肠杆菌中重要的拓扑异构酶,大多数天然DNA都具有负超螺旋,它不但可以变为泡状单链形式,有利于许多蛋白质的结合,而且在复制的开始阶段,可以缓解由于复制叉的移动而造成的超缠现象。
DNA旋转酶有4个亚基,两
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