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是指接种某种病毒后能快速表现特有症状的植物,又称鉴别寄主
植物超低温种质保存:
是指将植物的离体材料包括茎尖(芽)、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等,经过一定的方法处理后在超低温(一196℃液氮)条件下进行保存的方法。
1从外植体到小植株有哪些培养途径?
答:
离体器官的分化有三种比较典型的分化途径:
一是由分生组织直接分生芽;
二是由分生组织形成愈伤组织,经过分化实现细胞的全能性;
三是游离细胞或原生质体形成胚状体(embryoid),由胚状体直接重建完整植株,或制成人工种子后再重建植株。
愈伤组织再分化时,可经过两条途径,一是由愈伤组织的部分细胞先分化产生芽(或根),再在另一种培养基上产生根(或芽),形成一个完整的植株,因为芽和根都是植物体的器官,所以这一过程叫器官发生途径。
二是在愈伤组织中产生出一些与种子中的胚相似的结构,即同时形成一个有苗端和根端的两极性结构,然后再在另一种培养基上同时发展成带根苗,由于这一过程与种子中胚的形成和种子萌发时形成幼苗的过程相似,所以叫做胚状体发生或无性胚胎发生。
2简述培养基和器具的灭菌方法和技术。
培养基的灭菌方法:
(1)高压蒸汽灭菌法:
培养基消毒灭菌时间不宜过长,也不可超过灭菌锅规定的压力范围(1.15kgf·
cm-2或O.15MPa,温度126℃);
否则,培养基中的蔗糖、有机物质,特别是维生素类物质就会分解,导致培养基变质、变色,甚至难以凝固。
(2)过滤除菌法:
过滤灭菌的原理是溶液通过滤膜后,细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻。
器具的灭菌方法:
(1)干热灭菌法:
是将器具长时间放在高温下消除杂菌的一种方法。
其具体做法是将需要灭菌的器具(玻璃器皿或器械)先用铝箔包好,放入温度设定为150℃的恒温干燥箱内,保温2h,取出冷却后便可以使用。
(2)高压蒸汽灭菌法:
高压蒸汽灭菌法是将需灭菌的玻璃器皿、器械或培养基等放在高压蒸汽灭菌锅内,通过高温高压进行灭菌的一种方法。
一般在1.06kg/cm2的压力下(121℃)下保持15~20min,就可达到灭菌效果。
对于无菌操作所用的各种器械,如镊子、解剖刀、解剖针等,可采用灼烧灭菌。
一般的消毒办法是把它们先在95%酒精中浸一下,然后再置火焰上灼烧,然后放在灭过菌的支架上,待冷却后使用。
3常用培养基分为哪几类?
各类的主要特点是什么?
(1)MS培养基:
特点是无机盐的浓度高,有加速愈伤组织生长的作用,能满足植物组织对矿质营养的要求。
(2)改良的White培养基:
特点是一个无机盐浓度较低的培养基。
它的使用也很广泛,同时它还非常适合于生根培养和胚胎培养。
(3)B5培养基:
它的主要特点是含有较低的铵盐,该营养成分可能对不少培养物的生长有抑制作用,对有些植物如双子叶植物(如豆科植物)特别是木本植物,却更适合生长。
(4)N6培养基:
其KN03和(NH4)2S04含量高且不含钼,广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养和组织培养。
(5)white培养基:
特点是无机盐的数量比较低,更适合合本科植物的组织培养,根的培养。
4试述培养基选择的方法。
选择合适的培养基主要从以下两个方面考虑:
(1)是基本培养基:
根据培养的目的选择一种培养基为基本培养基。
(2)培养基中各种激素的浓度及相对比例:
组织培养中对培养物影响最大的是外源激素,在基本培养基确定之后,实验中要大量进行的工作是用不同种类的激素进行浓度和各种激素间相互比例的配合试验。
4培养基的成分有哪些?
各有什么作用?
由水、无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。
(1).水分:
构成培养基的绝大部分组分为水分。
(2).无机营养物(无机盐):
提供植物所必需的16种营养元素。
(3).碳源和能源:
①作为生长发育的能源;
②具有维持培养基一定渗透压的作用.(4).维生素类:
主要作用是诱导愈伤组织的形成,胚状体的产生以及试管苗的生根。
生长素类常用的是2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)、IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸),它们作用的强弱顺序为:
2,4-D>
NAA>
IBA>
IAA。
在培养基中加入细胞分裂素的目的,主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽。
作用的强弱顺序为:
TDZ,4PU>
ZT>
2-iP>
6-BA>
KT。
(5)植物生长调节物质:
对外植体愈伤组织的诱导和器官分化起着重要和明显的调节作用,其中以生长素类和细胞分裂素类最为常用。
(6).氨基酸及有机附加物,它能促进离体根的生长,对植物组织培养物的生长也有良好的促进效果。
5简述培养基母液及MS培养基配制的基本过程。
培养基母液的配制:
母液的配制有两种方法:
一种是配制成单一化合物母液,法适合配制多种培养基都需要的同一种母液;
另一种是配成几种不同化合物的混合母液,法在大量配制同种培养基时省时省力。
配好的母液应放在试剂瓶中贮存。
(1)药品及用具的准备aMS培养基母液的准备。
b用具、用品的准备。
(2)<
1>
称量的琼脂(0.7~0.8%),放入医用口杯中,加入适量的蒸馏水(估计加入母液后不超过配制总量)置于电炉上加热溶解,边加热边用玻棒搅动。
<
2>
待琼脂完全溶解后,加入规定用量的母液、蔗糖,继续加温并不断搅拌,待琼脂煮透后端离火源,根据培养基配方及培养基体积加入所需要的生长调节物质,最后定容至所需体积。
3>
调节培养基的酸碱性至pH5.8。
4>
培养基的分装,配制好的培养基要趁热分装.<
5>
培养基的灭菌.121℃时保持15~30min左右即可.
补充:
(1)大量元素母液的配制:
MS培养基中的大量元素除C、H、O外,剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、CaCl2•2H20、MgSO4•7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应,它们可配在同一母液中。
配制的步骤为:
称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。
注意:
CaCl2•2H20.
(2)最后加入微量元素母液的配制:
MS培养基中的微量元素可由MnSO4•4H2O、ZnSO4•7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4•2H2O、CuSO4•5H2O、CoCl2•6H2O几种无机盐来供应,它们也可配在同一母液中。
配制步骤为:
(不要求顺序)(3)铁盐母液的配制:
铁盐母液宜单独配制,它是由硫酸亚铁(FeSO4·
7H20)和乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)配制而成。
称量→分别溶解→混合→煮沸→调pH值至5.8→冷却→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。
6再分化有哪几种方式?
它们的特点是什么?
答:
(1)细胞水平的再分化:
再分化中首先可见的是细胞壁变厚、假导管细胞的形成及酶水平的变化和明显的机能分化,从而形成各种类型的细胞。
(2)组织水平的再分化:
松散的愈伤组织内含有大量拟分生组织或瘤状结构。
致密的愈伤组织内组织分化很少,大多由高度液泡化的细胞组成。
(3)器官水平的再分化
器官水平的再分化又称为器官发生。
根据起源不同,器官发生可分为器官型和器官发生型。
前者直接由外植体的细胞形成器官原基,继而发育成器官;
后者由外植体先形成愈伤组织,再由愈伤组织产生不同的器官原基。
包括四种方式:
①先形成芽,后在芽基部长根;
②先形成根,再从根基部形成芽;
③在愈伤组织不同部位分别形成芽和根,然后根、芽的维管束接通形成完整植株;
④仅形成芽或根(如茶树的花粉愈伤组织诱导器官分化时,往往只形成根,而芽的发生则十分困难)。
7愈伤组织形成的条件是什么?
其形成过程分为哪几个阶段?
愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类,而是培养条件,其中激素的种类和浓度最为重要。
当然,外植体的类型(如木本植物中的幼态或成年态)和外植体原来在植株上所处的位置(它反映了内源激素的水平)对愈伤组织诱导的影响也不能忽视。
阶段:
(1)诱导期又称启动期,是愈伤组织形成的起点,是外植体细胞进行分裂准备的时期。
内部却发生了生理生化变化,细胞内合成代谢活跃,RNA含量迅速增加,细胞核体积明显增大.
(2)外植体外层细胞开始迅速分裂,但中间部分的细胞不分裂,形成了一个静止的芯。
在这一时期由于细胞分裂的速度大大超过了细胞伸展的速率,细胞体积迅速变小,逐渐回复到分生状态。
当细胞体积最小,细胞核和核仁最大,细胞内无大液泡,RNA含量最高时,标志着细胞分裂进入了高峰期(3)分化期(形成期)进入形成期后,细胞的平均大小相对稳定,不再减少,细胞分裂由原来局限在组织外缘的平周分裂转为组织内部较深层局部细胞的分裂,结果形成瘤状或片状的拟分生组织(meristemoid),称做分生组织结节。
8影响茎芽分化的因素有哪些?
答
(1)化学因素大量的实验证明,影响茎芽分化的化学因素主要是培养基中生长素和细胞分裂素的浓度和比例,当生长素的相对浓度较高时,有利于细胞的增殖和根的分化,若细胞分裂素的相对浓度较高,则促进芽的分化,当这两种激素之间的比例适中时,则仍产生无结构的愈伤组织。
另外,在烟草、紫雪花、秋海棠和水稻中,赤霉素对于茎芽的分化有抑制作用。
(2)物理因素:
包括培养基的状态、光照、温度等,光照因素包括光照强度、光照时间和光的质量。
高强度的光照对烟草茎芽的形成有抑制作用。
(3)其它因素:
培养材料的染色体组、供体植株和外植体的生理状态(分生细胞和胚细胞产生的愈伤组织具有较高的再生能力)、外植体的细胞发育状态、培养物的历史(反复继代保存后形态发生能力下降)以及内生激素水平等。
9植物体细胞胚胎发生的概念是什么?
有哪些途径?
由单细胞或一群细胞被诱导不断再生非合子胚,并萌发形成完整植株的发育过程称为体细胞胚胎发生。
由外植体诱导体细胞胚胎发生的途径有两种,即直接途径和间接途径。
(1)直接途径是指从培养中的器官、组织、细胞或原生质体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎,中间不经过愈伤组织阶段,这种“胚性细胞”是在胚胎发生之前就已“决定”了的。
(2)间接途径是指外植体先脱分化形成愈伤组织,再从愈伤组织的某些细胞,即重新“决定”为胚性细胞的细胞分化出体细胞胚胎。
10影响体细胞胚胎发生的主要因子有哪些?
对于体细胞胚胎发生特别重要的是培养基中的两种成分,即生长素和氮源。
(1)生长素在无生长素的培养基上连续继代培养的组织或愈伤组织一般不能形成体细胞胚。
结论:
在增殖培养基中生长素的存在,对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少的。
(2)氮源:
除生长素外,培养基中氮源的形态也会显著影响离体条件下的胚胎发生。
体细胞胚诱导和成熟需要大量氮素,通常为还原态氮如铵盐。
(3)其他因子:
高浓度的钾(20mmol/L)是胚胎发生所必需的。
在培养基中溶解氧的含量应低于一个临界值(1.5mg/L),否则将有利于生根,而不利于成胚。
这是因为低水平的溶解氧在细胞内似乎会导致较高水平的ATP合成,高水平的溶解氧有利于生根。
11长期培养物形态发生潜力丧失的可能原因有哪些?
(1)遗传假说,培养细胞中细胞核物质变化,如多倍性、非整倍性和染色体结构突变,可能与长期培养物器官发生或胚胎发生潜能丧失有关。
这种由遗传原因造成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。
(2)生理假说:
在某些情况下,形态发生潜力的下降可能是由于细胞或组织内激素平衡关系的改变造成的,或是由于细胞对外源生长物质敏感性的改变造成的。
(3)竞争假说在复合多细胞外植体中,只有少数细胞能产生胚性细胞团,其余细胞没有细胞全能性。
12愈伤组织培养中存在哪两种类型的细胞?
(1)紧密型(compact):
愈伤组织内无大的细胞间隙,细胞间被果胶质紧密结合,不易形成良好的悬浮系统。
2)松脆型(friable):
愈伤组织内有大量大的细胞间隙,细胞排列无次序,容易分散成单细胞或少数几个细胞组成的小细胞团,是进行悬浮培养的最合适的材料。
两类愈伤组织通过激素调节可互相转变。
13简述制造单胚人工种子的方法和工业化生产人工种子的步骤。
植物人工种子是指将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育为完整植株的分生组织(芽,愈伤组织,胚状体)包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳内形成的在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体1方法:
(1)人工种子由包裹在防护层中的体细胞组成,在制造单胚人工种子的时候,主要采用诸如藻酸钠一类的水凝胶作为体细胞胚的包被物质。
(2)当体细胞胚与藻酸钠混合以后,再滴人到硝酸钙或氯化钙溶液中,30min内表面即可完全络合,形成一层持久的种皮(3)在种皮基质中还可加入一些对体细胞胚有益的物质,如能促进生长的微生物、营养物质、生长调节物质、杀虫剂以及用于旱地播种的亲水性化合物等作为人工胚乳。
2步骤,首先,必须建立起适当的组织培养技术,从中能产生高质量的大小一致和发育期同步的、功能像合子胚一样的体细胞胚。
为了促成体细胞胚的同步发育,现在常常采用的方法有以下3种:
(1)在细胞培养初期,于培养基中加入DNA合成抑制剂如5-氨基尿嘧啶等,使细胞分裂暂停,或将培养物置于低温之下,以抑制细胞分裂。
一定时间之后,除掉抑制剂或转入正常温度下培养,以促使细胞同步分裂。
(2)将培养细胞用不同直径的玻璃珠或不同孔径的尼龙网过滤,以收集不同发育时期的胚状体。
(3)利用渗透压控制胚胎发育同步性。
还必须建立大规模自动化的液体培养体系,以便生产数量足够的体细胞胚。
生产具有适当水分含量的种皮的方法,掺入营养物质和其他附加物质的方法,以及用于包埋体细胞胚的设备等,也都有待改进。
14简要说明分离单细胞的方法。
1由完整的植物器官分离单细胞:
(1)机械法:
现在广泛用于分离叶肉细胞的方法是先把叶片轻轻研碎,然后再通过过滤和离心把细胞净化。
(2)酶解法:
利用果胶酶(pectase)处理植物叶片,使细胞间的中胶层发生降解,分离出具有代谢活性的细胞。
(酶解法分离细胞能得到较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。
)2由培养组织中分离单细胞由愈伤组织获得游离细胞的具体做法是,把未分化的和易散碎的愈伤组织转移到装有液体培养基的三角瓶中,在25℃±
1℃,弱光或黑暗中,将三角瓶置于摇床上不断振荡。
初期每10d左右用新鲜培养液更换掉三角瓶中大约4/5的旧液,同时将飘浮在原培养液上层的细胞碎片和长弯形衰败细胞淘汰。
几个周期之后,培养液由浊变清,开始出现胞质浓密的单细胞和小细胞团。
此后不断进行继代培养,直至建成良好的悬浮培养物。
震荡的作用:
①可对细胞团施加一种缓和的压力,使它们破碎成小细胞团和单细胞。
②振荡可以使细胞和小细胞团在培养基中保持均匀的分布。
③培养基的运动还会促进培养基和容器内空气之间的气体交换。
15简述分批培养、半连续培养和连续培养的特点。
(1)分批培养:
分批培养(batchculture)是指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养,当培养物增殖到一定量时,转接继代,建立起单细胞培养物
在分批培养中每单位容积悬浮培养液内的细胞数与培养时间关系的示意图
(2)半连续培养
半连续培养是利用培养罐进行细胞大量培养的一种方式。
在半连续培养中,当培养罐内细胞数目增殖到一定量后,倒出一半细胞悬浮液于另一个培养罐内,再分别加入新鲜培养基继续进行培养,如此这样频繁地进行再培养。
连续培养
连续培养(continuousculture)是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。
连续培养的特点是:
在连续培养中由于不断注入新鲜培养基,排掉旧的培养基,保证养分的充足供应,不会出现悬浮培养物发生营养亏缺的现象。
连续培养可在培养期间内使细胞长久地保持在对数生长期中,细胞增殖速度快。
连续培养适于大规模工厂化生产。
连续培养有封闭型和开放型之分。
16试述诱导细胞同步化的方法及原理。
同步化培养是大多数细胞同时通过细胞周期每一阶段(G1、S、G2和M,)的培养方法。
(1)物理方法:
物理方法主要是通过对细胞物理特性(细胞或小细胞团的大小)或生长环境条件(光照、温度等)的控制,实现高度同步化,其中包括按细胞团的大小进行选择(以最优质的潜在悬浮培养物中细胞团大小为标准选择细胞团,有可能获得同步化生长的细胞)的方法和低温休克法等。
(2)化学方法
(1)饥饿法在这种方法中,先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素,使细胞停滞在G1期或G2期,经过一段时间的饥饿之后,当重新在培养基中加入这种限制因子时,静止细胞就会同步进入分裂。
(2)抑制法使用DNA合成抑制剂如5-氨基尿嘧啶、羟基脲和胸腺嘧啶脱氧核苷等,也可使培养细胞同步化。
当细胞受到这些化学药物的处理之后,细胞周期只能进行到G1期为止,细胞都滞留在G1期和S期的边界上。
当把这些抑制剂去掉之后,细胞即进入同步分裂。
应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细胞周期。
17试述单倍体植株的鉴定方法及其染色体加倍的方法。
花粉和花药植株的倍性鉴定:
染色体直接计数法、间接鉴定(扫描细胞光度仪鉴定、细胞形态学鉴定法、植株形态学鉴定法、高/低温胁迫法、杂交鉴定法分为自交鉴定和测交鉴定、分子标记鉴定分为①生化标记鉴定②分子标记研究)。
(2)花粉和花药植株的染色体加倍。
茎段培养:
单倍体愈伤组织培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂(没有核分裂的染色体复制)及花粉核的融合,形成二倍体细胞,可有意识地利用这一特点来获得纯合的二倍体植株。
化学试剂诱变:
单倍体植物染色体加倍用得最多的是化学诱变法,常用的诱变剂有秋水仙素和Oryzalin(黄草消)、trifluralin(氟乐灵,一种除莠剂)、APM(amiprophosmethyl)等除草剂,其中秋水仙素应用最广泛。
18简述离体授粉的程序。
①确定开花、花药开裂、授粉、花粉管进入胚珠和受精的时间;
②去雄后将花蕾套袋隔离;
③制备无菌子房或胚珠;
④制备无菌花粉;
⑤胚珠(或子房)的试管内授粉。
19什么是胚珠培养和子房培养?
简述胚珠培养和子房培养的意义。
胚珠培养是将胚珠从母株上分离出来,在人工控制的条件下,进行离体培养,使其生长发育形成幼苗的技术。
胚珠培养的意义为:
①通过受精前胚珠培养以及未受精的胎座或子房培养,可以作为试管受精的基础;
②利用胚珠培养技术,使杂种尽早培养,防止杂种胚早期败育,获得杂种植株;
③未受精的胚珠培养能和花药培养一样,诱导出大孢子或卵细胞增殖,形成单倍体植株,用于单倍体育种。
(2)子房培养是指将子房从母体上分离下来,置于培养基上,使其进一步发育成幼苗的技术。
意义在于:
①使未受精胚囊中的单倍性细胞诱导发育成单倍体植株;
②获得杂种植株;
③为试管受精提供一项基础技术。
根据培养的子房是否授粉,可将子房培养分为授粉子房培养和未授粉子房培养。
技术措施:
①胚珠培养:
(1)材料的选择和灭菌.
(2)培养基:
多为White、Nitsch、MS等,Nitsch使用更普遍。
离体胚珠发育中,培养基的渗透压起着重要的作用,特别是对幼嫩的胚珠。
不同发育时期的胚珠对培养基的要求也不同。
(3)胎座和子房对胚珠培养的影响:
胎座或子房的某些组织在胚珠发育初期起着重要的作用。
(4)胚发育时期的影响:
合子和早期原胚期的胚珠较难剖取和培养,对培养基成分也要求严格。
培养发育到球形胚期的胚珠,较容易获得种子,对培养基的要求也不高。
②子房培养:
(1)子房外植体的制备.
(2)培养基:
用于子房培养的培养基有MS、White、B5、N6、Nitseh等。
此外,培养基的成分对子房的生长发育及成熟有很大的影响。
(3)培养子房的发育.(4)影响子房培养的因素:
可以通过控制培养基及激素条件调节子房发育的方向。
20离体授粉中影响结实的因子有哪些?
外植体:
柱头和花柱的影响,胎座的影响,外植体的生理状态.由雌蕊上剥离胚珠的时间对于离体授粉后的结实率有明显影响。
在剥离胚珠或雌蕊时,雌蕊的生理状态对离体授粉后的结实率也有影响。
在离体授粉中,可以把剥离胚珠的时间选择在雌蕊授粉后和花粉管进入子房之前,从而增加离体授粉成功的机会。
在进行柱头授粉的时候,应当避免弄湿胚珠和柱头的表面,否则将会影响花粉萌发,导致花粉管破裂,造成结实不良。
②培养基:
培养基最重要的作用在于促进受精胚珠的正常发育。
常用于离体授粉的培养基为Nitsch、White、MS等。
培养基中蔗糖的浓度一般为4%~5%③培养条件:
在离体授粉中,培养物一般都是在黑暗或光照较弱的条件下培养的。
④基因型:
离体子房培养与结实之间的效应取决于植物的种类。
21什么是植物的胚胎培养?
什么是合子胚培养?
简述胚培养的方法和应用。
(1)植物胚胎培养:
(2)合子胚培养:
(3)方法:
成熟胚培养:
①培养基和培养条件:
培养基只需含无机盐和糖即可;
提供合适的生长条件及打破休眠.②操作:
受精后的果实或种子(带种皮)表面消毒剥离种胚培养完整植株.幼胚(未成熟胚)培养:
①幼胚指的是尚未成熟即发育早期的胚。
在人工培养基上幼胚培养难成功,利用胚乳看护培养,可显著提高幼胚的成活率.可用同种胚乳,也可用异种胚乳.进行幼胚培养时,关键是维持胚性生长。
此途径为需要途径.②操作:
表面消毒(对受精后子房进行表面消毒)切开子房壁取出胚珠剥离胚珠取出完整幼胚培养完整植株.
(4)应用:
①通过“胚拯救"
获得远缘杂种。
通过“胚拯救”即可克服这种受精后障碍,产生远缘杂种。
“胚拯救”的方式有3种:
一是杂种幼胚在人工培养基
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