不同年龄大鼠颗粒性脑蛋白聚糖的比较研究文档格式.docx
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大分子硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)主要存在于初生组和青年组;
小分子硫酸皮肤PG的提取率随增龄而降低;
颗粒性脑PG随动物
Comparativestudyonparticulatebrainproteoglycansinratsofdifferentages
LiangXueqing,TianMengyu
(DepartmentofBiochemistry,MedicalSchoolofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China)ABSTRACT:
Objective
(PG)withdevelopmentTostudytheassociationofparticulatebrainproteoglycan
SDratsweredividedintothreegroups:
newborn,youngadultandnearold
・L-1groups.Afterbraintissuesweredefatted,particulatebrainPGsofeachgroupwereextractedwith4molofguanidineHClandpurifiedbyDEAE-sephacelchromatography,theirmolecularsizeswereidentifiedby
(GAG)compositionswerecharacterizedbytwoSepharose4Bchromatographyandtheirglycosaminoglycan
TheextractionratesofparticulatebrainPGsdecreasedwithage;
the
largemolecular-sizeparticulateCSPGmainlyexistedinnewbornandyoungadultgroups;
thepercentageofsmallmolecular-sizeDSPGincreasedandCSPGdeclinedwithage.ConcIusionwithageandarerelatedtobraindevelopmentandaging.
ParticulatebrainPGschange
dimensionalelectrophoresis.ResuIts
andagingofthebrain.Methods
KEYWORDS:
brainproteoglycan;
glycosaminoglycan;
development脑组织中的蛋白聚糖(proteoglycan,PG)主要有硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和硫酸皮肤素蛋白聚糖(DSPG)等[1,2]类,其特点是易提取的可溶性脑PG占的比例较大,而难提取分离的颗粒性脑PG占的比例较小。
近年来国外学者开始研究脑PG与发育和老
[3]
化的关系,但研究对象多为可溶性脑PG,且多选择某一部位进行研究,难以反映全貌,也难以深入阐明颗粒性脑PG与脑的发育和老化的关系。
本研究在改进提取分离方法的基础上,对大鼠颗粒性脑PG进行提取和分离,同时对不同年龄组(初生组、青年组及近老年组)颗粒性脑PG的分子特
收稿日期:
修回日期:
2002-08-082002-10-21基金项目:
国家自然科学基金资助(No.39070240)通讯作者:
田梦玉.Tel:
(029)5275816作者简介:
梁雪清(1970-),女(汉族),博士/讲师.研究方向:
基因
诊断和治疗.现在广州医学院生化教研室(510182)Tel:
020-81340212Email:
LXQ76@hotmail.com
点进行了比较分析,旨在对颗粒性脑PG与发育年
龄的关系有一个全面的了解,为今后进一步研究颗粒性脑PG的分子与功能的关系提供线索。
11.1
材料和方法酶和试剂
链酶蛋白酶(E,;
盐Merck产品)
酸胍(上海试剂总厂产品经活性碳处理后再结晶);
;
DEAE-Sephacel、Sepharose4B(Pharmacia产品)
、硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸皮肤素硫酸软骨素(CS)(DS)及透明质酸(HA)标准物为芝加哥大学Hor-witz博士惠赠。
1.2动物处理将SD纯种大鼠按年龄分为3
组:
(生后1d);
(3~4个月龄);
①初生组②青年组(15个月龄以上)。
各组动物均于实验③近老年组
前准确称取体重,立即断头处死,剥离全脑,用冰冷的Tris-HCl(10mmol・L-1,反复冲洗,除去pH7.2)
卷
附着在脑表面的血液,滤纸除去多余的缓冲液,分别准确称重后进行匀浆和提取实验。
大鼠脑经准确称重后,用1.3脑PG的提取
(pH20倍体积的10mmol・L-1Tris-HCl缓冲液
在冰浴下充分匀浆,其间4℃提取48h以上,7.2)
表1
分组初生组青年组近老年组
大鼠颗粒性脑PG的提取量n801517
(x±
s)-351312
己糖醛酸/・g-1脑湿重提取率/%g
180.35±
19.00*39.60±
2.2444.41±
1.98
不断振荡。
经离心后分为上清部分(内含可溶性脑和沉淀颗粒部分(内含细胞结合性脑PG)。
将PG)
沉淀颗粒部分经丙酮及氯仿(V)(V):
/甲醇2:
1脱脂处理后,加入4mol・L-1盐酸胍2mL,4℃提注:
与其他两组相比*P<
0.05
2.2DEAE-Sephacel柱层析为了进一步得到纯
化的颗粒性脑PG,将上述各提取物分别上DEAE-并用含0.1~1mol・L-1NaCl的Sephacel层析柱,
取48h以上,其间不断振荡,进一步提取分离颗粒性脑PG。
在上述提取液中加入4倍体积的乙酸钠饱和乙醇沉淀PG,4℃放置过夜,
离心,弃上清。
再依次加入少量的无水乙醇和乙醚脱水干燥,得PG的初提样品。
1.4脑组织PG的分离纯化
①DEAE-Sephacel
柱层析[5]
:
将PG样品用5~8mL7mol・L-1尿素0.1mol・L-1NaCl,50mmol・L-1NaAC)溶解,上DEAE-Sephacel柱(1×
10cm),用7mol・L-1尿素(内含0.1~1mol・L-1NaCl,50mmol・L-1NaAC,pH6.7)
进行梯度洗脱,计时收集,流速为3mL
・h-1,每管收集1mL。
②Sepharose4B柱层析[6]:
将DEAE-Sephacel柱层析后所得的各峰值管样品溶于1mL1mol・L-1盐酸胍(内含50mmol・
L-1Tris-HCl,2mmol・L-1
Na2-EDTA,
1mmol
・L-1的N-乙酰马来酰亚胺和0.2mmol・L-1苯基甲磺酰胺,pH7.5,下同)中,取0.5mL上Sepharose4B柱
(0.8×
100cm),用1mol・L-1盐酸胍进行洗涤,计滴收集,每管收集30滴。
③层析洗脱收集液的监测:
采用阿尔新兰染色斑点检测法。
将层析过程收集的各管,各取5~10µ
L点在醋酸纤维素薄膜上,用0.1nmol・L-1阿尔新兰液(内含1mol・L-1乙醇、0.17nmol
・L-1乙酸及0.03mol・L-1氯化镁)
染色20min,经4次漂洗后,晾干。
剪下各斑点,溶于1.5mL二甲亚砜(内含0.05mol・L-1硫酸)中,37℃保温30min,不断振摇,最后在677nm下测定各斑点的吸光度。
1.5脑组织PG中糖胺多糖
(GAG)的双向电泳按文献[6]所述方法进行。
2
结
果
2.1不同年龄脑PG的提取颗粒性脑PG的提取量,采用测定提取物中的己糖醛酸含量为指标。
以己糖醛酸µ
g・g-1脑湿重计[4],不同年龄组颗粒性脑PG的提取量和残渣保留量以及由此计算的
提取率列于表1。
7mol
・L-1尿素液进行梯度洗脱,用阿尔新兰染色斑点法进行监测。
3组颗粒性部分均可得到一个大的脑PG洗脱峰。
初生组和青年组均分布于
0.76mol
・L-1NaCl附近,而近老年组则分布于0.64mol
・L-1NaCl附近,提示在近老年组,其颗粒性脑PG分子中的负电荷量低于初生组和青年组。
另外,青年组在0.5mol・L-1NaCl附近还有一个较小的洗脱峰,近老年组依次在0.33mol・L-1Na-Cl和0.5mol
・L-1NaCl附近有两个较小的洗脱峰。
经测定,这3个洗脱峰的蛋白质比例均在
90%以上,
可能是糖蛋白的洗脱峰(图1)
。
(内含
2期梁雪清,田梦玉.不同年龄大鼠颗粒性脑蛋白聚糖的比较研究103
水解液先用高浓度的NaCl溶解,用3mol・L-1乙
并加热煮沸以沉淀除去其中的蛋酸调节至pH5,
白质,经离心后,所得上清用乙酸钠饱和乙醇沉淀其中的GAG,经用无水乙醇及乙醚洗涤后得到干
燥的GAG样品。
用适量的0.6mol・L-1NaCl溶解GAG样品,然后点样进行双向电泳。
电泳后薄膜上各染色斑点GAG的种类用标准物共电泳的方法加以确定(图3),然后将各斑点剪下,溶于二甲亚砜(内含0.05mol・L-1硫酸)中,测定其677比例也有随年龄的增长而下降的趋势。
表2
颗粒性脑PG经Sepharose4B柱层析后的GAG组成(%)
Ⅱ
初生组青年组GAG
CS10084838889HA-1617-11HS---12-DS-----组分Ⅰ
nm下的光吸收,进而计算出各种GAG的百分含量,所得结果见表2
图3
峰ⅡGAG的醋酸纤维素薄膜双向电泳
由图3可见,在颗粒性脑PG中,不仅含有硫
酸软骨素(CS)、透明质酸(HA)和硫酸乙酰肝素HS),而且还含有硫酸皮肤素(DS),它们分布在分子大小不同的PG洗脱峰中,表明在脑组织中不仅含有CSPG和HSPG,而且还含有DSPG,甚至还含有两种GAG糖链的杂化型PG。
由表2可见,CS主要存在于分子比较大的峰Ⅰ和峰Ⅱ,而且与HA共存,表明是大分子集聚型的CSPG;
HSPG主要存在于分子比较小的峰Ⅲ中,有的在峰Ⅱ中也有少量;
而DSPG则主要存在于小分子的峰Ⅳ中,有的在峰Ⅲ也有少量。
GAG的年龄性变化最明显的是峰Ⅳ,它的DS的比例随年龄增长而逐渐增高,而
CS的比例则随年龄增长而下降。
此外,
峰Ⅰ的CS近老年组
77914-Ⅲ
初生组77-1013青年组69-2011近老年组
77-716Ⅳ
初生组61--39青年组58--42近老年组
37
--63
3讨论
3.1颗粒性脑PG分子电荷的年龄性差异PG
是一种具有负电荷的生物大分子,应用离子交换柱层析分析纯化PG,
主要是根据其负电荷的性质进行的。
本研究在应用DEAE-Sephacel柱层析分离纯化脑PG时,
发现3组颗粒性部分均可获得一个脑PG洗脱峰。
但在近老年组,其脑PG的梯度洗脱峰位置出现了明显前移现象,提示近老年组脑PG分子的负电荷量明显低于其他各组。
PG的负电荷减少是组织老化的一种表现,这在软骨CSPG的研究中已得到证实。
但其机理尚不清楚,可能是由于催化转录后糖基化和硫酸化的酶类活性发生改变,致使糖链和硫酸化程度有所降低。
我们曾分析了3种脑PG的己糖醛酸/蛋白质比例,发现近老年组均低于其他两组,这可能是其负电荷降低的
一个因素。
要完全明确颗粒性脑PG负电荷降低
的原因,需进一步分析其GAG糖链的特点,包括糖链的组成、分子大小以及硫酸化的程度等。
3.2颗粒性脑PG的分子大小和种类及其年龄性差异3组颗粒性脑PG经过Sepharose4B柱层析后,可按分子质量大小分为4部分,即峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ、峰Ⅳ。
峰Ⅰ是属于大分子的CSPG;
峰Ⅱ主要也是CSPG,但分子质量略小;
峰Ⅲ以HSPG为主;
峰Ⅳ以小分子DSPG为主,但尚不能排除既含DS链又含CS链的杂化型小分子PG。
此外,CS在4个峰中均含有一定比例,
表明脑中的CSPG可能存在着几种分子大小不同的类型。
由于在提取分离的各个阶段均应用了各种蛋白酶抑制剂,故可排除核心蛋白水解的可能性。
Margolis等总结了国
(
104西安交通大学学报(医学版)第24卷
外不同学者从脑组织中鉴定的约10余种CSPG,其相对分子质量范围相当大,从60~70kD到
[5]
由此可见,存在于脑组织中的PG,680kD不等
不仅种类较多,而且同一种类型的PG也还有不同
CS比例则逐渐下降。
综上所述,颗粒性脑PG随动物年龄的增长发生一定的变化,与脑的发育和老化有密切关系。
本研究为进一步探讨脑PG的结构、功能及其在发育和老化中的变化机理提供了较为重要的线索和依据。
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(编辑
卓选鹏)
的分子类型。
进一步研究这些复杂多样PG的分
子特点以及它们的功能,可能具有重要意义。
3组颗粒性脑PG的年龄性差异比较明显的主要有以下几个方面:
从各洗脱峰的分布比例来看,初生组和青年组大部分集中于大分子的峰Ⅰ,分别为53%和73%;
而中等分子和低分子洗脱峰的比例都比较小。
与此相反,近老年组的峰Ⅰ比例最小,为17%,而峰Ⅱ的比例却较其他两组约高2倍以上,峰Ⅲ和峰Ⅳ也高于其他两组,这种变化的机理目前尚不清楚,可能是:
各种①随着年龄的老化,脑PG核心蛋白的基因表达发生变化,分子质量最大的核心蛋白表达降低,而分子质量小的表达增高;
使PG②催化合成糖链的酶类活性发生改变,上的GAG链变短;
③活性氧对脑PG的降解破坏。
当然,究竟是什么原因导致脑PG发生这样的变化,还有待今后做进一步的研究。
但值得注意的是峰Ⅳ,它主要是小分子的DSPG,在近老年组中此峰的比例均高于其他两组。
分析3组峰Ⅳ的发现随着年龄增长,其DS比例逐渐增加,而GAG,
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◇书
讯◇
《外科黄疸疾病诊断治疗学》出版
由西安交通大学第一医院石景森教授和昆明医学院王炳煌教授主编,黄志强院士担任名誉主编的专著《外科黄疸疾病诊断治疗学》于2003年1月由人民军医出版社出版发行。
石景森教授系西安交通大学第一医院外科教授、博士生导师、肝胆外科研究室主任,担任西安交通大学肝胆胰疾病研究会理事长、中华外科学会胆道外科学组副组长、《中华肝胆外科杂志》副总编以及《中国实用外科杂志》、《世界华人消化杂志》等二十一种专业杂志的编委。
黄疸是临床工作中最常遇见的疾病症状群之—,因其病因复杂,所以,诊断和鉴别诊断显得尤为重要,且梗阻性黄疸又是研讨和争论的焦点。
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- 不同年龄 大鼠 颗粒 蛋白 聚糖 比较 研究