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的制备成为可能。
幻灯片13
●20世纪中期:
发现限制性核酸内切酶和DNA连接酶,实现DNA体外切割和连接。
●1972年,Berg用E.coRⅠ切割SV40DNA和λphageDNA,经过连接组成重组的DNA分子。
Berg是第一个实现DNA重组的人。
幻灯片14
美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子
幻灯片15
第一个取得基因工程成功的人-Cohen
1973年,CohenGroup将E.coli的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒体外限制酶切割,连接成一个新的质粒,转化E.coli,在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer,实现了细菌遗传性状的转移。
这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子,这一年被定为基因工程诞生的元年。
幻灯片16
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幻灯片20
1997英国罗林研究所成功的克隆了多莉
幻灯片21
CloningDolly
幻灯片22
幻灯片23
克隆技术的应用前景
1.改良动物品种
2.挽救濒临灭绝的物种
3.培植人体皮肤
4.研制名贵药品
5.培育人体器官
幻灯片24
第二节工具酶
幻灯片25
一、限制酶
幻灯片26
(一)限制酶的定义
限制酶(restrictionenzyme):
一类专门切割DNA的酶。
是一类能识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并与其特异结合,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。
“Restrictionendonucleasesarebacteriaenzymewhichcut(hydrolyze)DNAintodefinedandreproduciblefragments.Inbacteriatheyformpartoftherestriction—modificationdefensemechanismagainstforeignDNA.Theyarebasicgenecloningtools.”
幻灯片27
(二)限制酶的发现
大肠杆菌的限制—修饰系统中,该系统由两种酶组成:
限制酶(分解和识别DNA的酶)
修饰酶(改变碱基结构,免遭限制酶分解)
甲基化修饰Am/Cm
两种酶作用于同一DNA的相同部位
幻灯片28
(三)限制酶的命名与分类
1.分类(根据酶的组成、所需辅助因子及裂解DNA的方式):
Ⅰ型R.E
复合酶:
核酸内切酶、甲基化酶(修饰)、ATPase
识别序列:
特异性识别15bp
切割特点:
识别位点与切割位点不一致产生片段较大、
识别后,要移动100~1000bp切割。
Ⅲ型R.E
M.W和亚基组成类似Ⅰ类R.E,作用方式同I型。
Ⅱ型R.E
分子内部切割、特异性强、切割序列可知且固定。
幻灯片29
2、限制酶命名的原则
(1)以该菌株的属名的第一个字母及种名的头两个字母组成三个斜体字母的略语表示
(2)同一种细菌若有不同菌株,则在属名种名后再加上株名
(3)若一个菌株中有几种酶时,以罗马字加以区分
(4)同一属细菌种名头两个字母完全相同,其中一个菌的酶可改用词头后的另一个字母来代替
幻灯片30
限制酶命名举例:
第一个字母该酶来源的细菌属名大写英文字母
第二、第三个字母该细菌的种名小写英文字母
第四个字母代表株名
罗马数字同株、不同酶发现的先后次序
属名+种名+株名+序号
(大.斜)(小.斜)(大/小.正)(正)
E-EscherichiaH-Haemophilus
(EcoRI)co-coli(HindⅢ)in-influenzae
R-RY13d-Rd
I-该株首次分离Ⅲ-该株第3次分离
幻灯片31
(四)限制酶的识别和切割位点
识别和切割位点:
识别:
4~6碱基对,多具有回文结构(palindrom),少数识
别长序列或简并序列(有的核苷酸位点可以不同)。
EcoRIPstⅠSmaⅠ
5′GAATTCCTGCAGCCCGGG3′
3′CTTAAGGACGTCGGGCCC5′
简并序列:
GTYRAC——Y=C/T
R=G/A
YR=CG/CA/TG/TA
∴HindⅡ可识别4个特定序列
幻灯片32
(五)限制酶的切割方式
(1)识别序列内两条链上交错切割,产生单链突出的粘性末端
(2)对称处同时切断DNA的两条链,产生平端DNA片段
幻灯片33
(六)限制酶的切割结果
切割的结果:
产生三种不同的末端
平末端—bluntend
5’突出—5’-protruding(cohesiveend)
3’突出—3’-protruding(overhangtail)
切割的化学本质:
磷酸二酯键的断裂,
形成含5’—P和3’—OH末端的两个DNA片段。
对一特定的DNA而言,识别序列碱基对少的,则切点数多,产生的片段小。
幻灯片34
幻灯片35
(七)同功异源酶(isoschizomers)
同裂酶(isoschizomer):
又称异源同工酶,是指来源不同,但能识别和切割同一位点,切割DNA后产生相同末端的一类限制酶。
幻灯片36
(八)同尾(裂)酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割DNA后,产生相同类型的粘性末端。
BglⅡ
BamHⅠ
+
幻灯片37
二、修饰酶
幻灯片38
(一)DNA聚合酶
1.依赖DNA的DNA聚合酶(DNAPolymerase)
以单链DNA(SSDNA)为模板合成DNA的酶
E·
ColiDNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段
T7噬菌体DNA聚合酶
T4噬菌体DNA聚合酶
TaqDNA聚合酶
幻灯片39
(1)E·
ColiDNA聚合酶Ⅰ
一条多肽链组成,MW:
109kDa,含Zn2+
三种活性:
5′3′DNA聚合酶
5′3′核酸外切酶
3′5′核酸外切酶
RNA酶H活性(RNaseH)
用途:
1、切口平移标记DNA探针
2、对DNA的3′尾进行末端标记
3、合成cDNA第二链
幻灯片40
(2)Klenow片段
枯草杆菌蛋白酶裂解E.Coli聚合酶I产生两个片段,大片段的分子量76kD,又称Klenow片段。
两种活性:
5′3′DNA聚合酶
3′5′外切酶活性
1.填平5′突出的粘端(补平3’端),
3′————5′3′—————5′
5′——3′5′——---------3′
2.3’末端标记(填平)
3.合成cDNA第二链
4.DNA序列分析
幻灯片41
(3)TaqDNA聚合酶
耐热DNAPolymerase,最佳作用温度:
75~80℃。
幻灯片42
2、依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)
逆转录酶(ReverseTranscriptase)
依赖于RNA的DNA聚合酶,以RNA为模板合成DNA,合成方向为
5’3’,无3’5’核酸外切酶的活性。
还兼有RNaseH活性,可使DNA:
RNA杂合体中的mRNA水解。
商品化产品:
AML—鸟类成髓细胞白血病病毒颗粒中的RTase纯化而得。
★
MML—Moloney小鼠白血病病毒颗粒制备而得
rMML—基因工程制品。
幻灯片43
3、不依赖模板的DNA聚合酶
末端转移酶(末端脱氧核苷酰转移酶)
(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)
功能:
在M2+离子存在下,将脱氧核苷酸
(dNTP)加到DNA的3’-OH上
主要用于探针标记
在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾,以
便于进行连接。
幻灯片44
(二)DNA连接酶
DNA连接酶(DNALigase)
T4DNA连接酶和E.coliDNA连接酶
催化一双链DNA3’-OH端与另一双链DNA的5’端磷酸
根形成3’,5’-磷酸二酯键,使具有相同粘性末端或平
末端的DNA末端连接起来。
幻灯片45
T4DNA连接酶(T4DNALigase)
幻灯片46
(三)碱性磷酸酶及其他
碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)
能除去DNA或RNA5’-端的磷酸根
制备载体时,用该酶处理后,可防止载体自身
环化,提高重组效率。
其它
T4多聚核苷酸激酶、RNA聚合酶、核酸酶等
幻灯片47
第三节载体(Vector)
一、定义:
携带目的基因片段进入受体细胞的DNA
《特点》:
(a)载体在进入受体细胞后,可自身复制或插入到基
因组中,随受体细胞的基因组一起复制。
(b)将目的基因与载体相连后,导入受体细胞,目的基
因将随载体的复制而大量扩增。
(c)目的基因与载体连结后,可在受体细胞内转录,翻
译成蛋白质产物(表达载体)。
(d)载体上还带有特定的药物抗性基因,以利于筛选。
幻灯片48
二、载体的分类
功能分类:
克隆载体
表达载体
转移载体
探针载体
主要类型
质粒(plasmid)载体
噬菌体载体:
如λ噬菌体载体、M13噬菌体载体
杂合载体(如粘粒cosmid)
病毒性载体:
逆转录病毒载体、腺病毒载体等
幻灯片49
三、克隆载体(cloningvector)
(一)克隆载体的功能:
用来克隆和扩增DNA片段
(目的基因)的载体
具备条件:
(a)必须是一个复制子,能在受体细胞中复制。
复制起点Ori
复制区
复制终点term
(b)带有抗药性基因
Tetr:
编码膜蛋白,阻止Tet进入细胞
Ampr:
β-内酰胺环水解酶。
Kanr:
Kan~P,neo~p
Camr:
氯霉素乙酰基转移酶
幻灯片50
(C)具有克隆位点(multiplecloningsits,MCS)
载体上含有的一个人工合成的DNA片段,其上含有数个单一酶切位点,是外源DNA的插入部位
是载体中的一段硷基序列,由数个酶切位点组成。
这些位点在载体上都是单一位点
(d)可导入受体细胞
幻灯片51
(二)常用克隆载体
1.质粒(plasmid)载体
特点:
分子量小、宿主内稳定存在、有较高拷贝数。
>
1个的遗传标志,便于选择,如antibiotics+lacZ。
含MCS,便于外源基因的插入。
克隆容量<
10kb,主要用于亚克隆片段。
〈例〉pBR322(4.3kb、MCS位于ampr和tetr基因中间)
pUC系列(2.6kb、来源于pBR322的ampr、Ori、LacZ
片段,MCS位于LacZ片段中间)
幻灯片52
质粒pUC
质粒pBR322
幻灯片53
2.λ噬菌体(λbacteriophage,phage)
(1)生活周期:
分为lytic和lysogenic期
基因组结构:
野生型为双链线性分子,在宿主细胞中成环状。
左侧(包装)、中间(非必须)、右侧(整合/切离、重组、调控)
幻灯片54
(2)λ噬菌体的包装
●75%或105%长度的DNA《基因组的包装》
●可以包装
●中间的非必须区可插入9-23kbp的
●外源DNA(replacementvector)
●左右臂连接的片段过小
●不能包装(选择标志)
●
幻灯片55
(3)λ噬菌体改造的载体
λgt10/EMBL/Charon
λgt10/λgt11为插入型载体(克隆容量<
7kb),用于cDNA文库构建,然后进行文库筛选。
幻灯片56
3、粘粒(cosmid)
粘粒(cosmid)
由λ噬菌体的cos区与质粒DNA构建而成
含质粒的ampr或tetr、Ori成分,可在大肠杆菌中复制
含噬菌体的cos区,可在体外进行包装
含1个或多个酶切位点
本身分子量小(6.5左右),可容纳40kb的DNA片段
非重组体太小不能包装,只包装重组体,便于筛选
幻灯片57
4.M13噬菌体(M13phage)
大肠杆菌纤维状噬菌体,基因组DNA为全长6.5kb的闭环ssDNA,
感染细菌后呈复制型dsDNA(RFDNA)。
载体特点:
a.允许包装大于病毒单位长度的外源DNA,一般DNA测序的插入片段<
1kb;
b.感染细菌后,复制环状ssDNA,经包装形成噬菌体颗粒,分泌到细胞外而不溶菌。
c.分离ssDNA容易。
如含有插入DNA,可用于测序、制备杂交探针、定点突变研究。
幻灯片58
几种常用克隆载体的比较
幻灯片59
四、表达载体(expressingvector)
(一)表达载体的功能:
在受体细胞中表达外源基因的载体
结构:
克隆载体+表达构件—原核生物表达
真核生物表达
ori
ampr基础上加转录和翻译相关element
MCS
(二)原核(大肠杆菌)表达载体
表达载体=克隆载体+表达元件
“启动子—核糖体结合—克隆位点—转录终止信号”
“P—RBS—MCS—term”
幻灯片60
原核表达表达载体结构示意图
用T7表达系统质粒的基本结构元件
幻灯片61
(三)原核表达载体的表达构件
①启动子(promoter)
trp-lac启动子(tac):
杂合启动子,由trp启动子加lac操纵子中的操纵基因和SD序列融合而成。
如:
tacI:
由Trp的-35P区和LacO区
tac12:
由Trp的-35P区、LacO区、SD序列
(在lac阻遏蛋白高水平表达的lacIq大肠杆菌菌株中,其转录可被抑制,加入异丙基硫代糖苷(IPTG)可诱导表达)
宿主菌:
RB791/XL-1-blue/SB221/JM109
诱导表达:
Lactose或IPTG
幻灯片62
T7噬菌体启动子
表达效率高,需要特殊的受体菌。
如BL21(DE3),Jm109(DE3)带有lacUV5启
动子控制下的T7噬菌体RNA聚合酶基因,为溶原
菌,可用IPTG诱导表达。
λ噬菌体PL启动子(温度敏感启动子)
该启动子受控于温度敏感的阻抑物cIts857.
温度诱导:
cIts857在37℃时,阻抑转录
42℃时,去阻遏,激活转录
E·
coliM5219(被缺陷型溶原λBPф感染后,含
有阻抑物cIts857的编码基因)
PBV220/221(我国构建)
幻灯片63
②核糖体结合位点(ribosome-bindingsite,RBS)
RBS包括SD序列和AUG起密码子(或单指SD序列)
③转录终止序列(terminationsequence)
多数表达载体含终止子序列,从几十到800碱基对的长度。
幻灯片64
(四)哺乳动物表达载体
原核序列(克隆用)+真核序列(表达用)
复制子真核抗药基因+真核表达组件
抗药基因(或真核复制起始点)
Promoter/Enhance+CloningSite+Terminater+PolyA-addingSignal
必须用真核启动子和增强子,但活性差异较大。
常用病毒的
元件,如SV40病毒早期基因增强子、Rouse肉瘤病毒(RSV)
的LTR、人类巨细胞病毒(CMV)等
幻灯片65
②转录终止和加尾信号
真核细胞中转录后,准确地加poly(A)尾依赖于:
poly(A)加尾信号–AAUAAA
poly(A)位点及其下游的GC-rich区或U-rich区
真核表达载体必须含有上两部分,以弥补内源性序列本身的不足。
常用SV40的信号:
237bp的BHI-BclI酶切位点片段,同时含有早期和晚期转录单位的切割和加polyA信号,两套信号作用相反,分别位于不同的DNA链上,对mRNA的加工均有效。
幻灯片66
真核表达载体的转录终止信号
TAA/G10~30bp尾
转录——AAUAAA————poly(A)100~200100~1000bp
切割及加尾的必需条件:
加poly(A)n信号及随后的U丰富区
③其它
纯化表达载体:
pRSET/pET/pcDNA3.0~5.0
(pRSET):
—P—TAG—HisHisHisHisHisHis—MCS—
Ni柱分离
终止密码子加尾信号切断降解
幻灯片67
第四节重组DNA技术的基本过程
重组DNA技术的应用目的:
克隆某个特定的基因
建立基因文库
cDNA文库
基因片段的亚克隆进行测序
构建表达载体以便在特定的细胞中表达某个基因
幻灯片68
重组DNA技术的基本步骤
重组DNA技术的基本步骤:
①制备目的基因和相关载体
②将目的基因和有关载体进行连接
③将重组的DNA导入受体细胞
④DNA重组体的筛选和鉴定
⑤DNA重组体的扩增、表达和其它研究
幻灯片69
一、目的基因的制备(Isolation)
(一)建立基因组文库(genomiclibrary)
采用限制酶将基因组DNA切成片段,每一个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA,然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩增,得到的分子克隆的混合体称为“基因文库”。
从基因组文库中通过杂交筛选得到目的基因片段。
从细胞中分离基因组DNA、用Sau3A或MboI部分消化、回收大小在一定范围内的片段、构建重组体。
幻灯片70
(二)建立cDNA文库(cDNA文库)
将不同细胞类型或不同阶段
细胞的mRNA逆转录成cDNA
后,将所有cDNA混合体与载
体进行连接后,将所有的重组
体分子都引入宿主细胞并进行
扩增,所得到的分子克隆的混
合体称为cDNA文库。
幻灯片71
(三)制备用于表达的基因片段
1.直接用限制酶消化基因组/重组质粒/特定的cDNA文库获得目的基因片段,然后用电泳分离纯化。
2.用PCR或RT-PCR技术体外扩增有关的DNA或cDNA片段。
3.化学合成
幻灯片72
二、载体的选择和制备(Digestion)
(一)载体的选择(主要考虑以下5个条件)
1.有足够容纳目的基因的幅度
根据克隆外源DNA片段的大小选择合适的载体
2.构建DNA重组体的目的
克隆选克隆载体,表达选表达载体
3.载体MSC中的酶切位点
根据克隆外源的酶切位点选择具有相同酶切位点的载体
4.根据受体细胞的类型确定表达载体的类型
5.载体克隆位点的阅读框要与目的基因的阅读框匹配
幻灯片73
(二)根据不同的用途选择载体
λ噬菌体和粘粒:
构建基因组文库
pUC系列:
构建cDNA文库和小的重组体
M13噬菌体:
克隆待测序的DNA片段
获得载体后,用适当的限制酶切割载体DNA分子,获得线形分子。
尽量用与消化目的基因时相同的酶来切割载体,以便获得相同的粘末端,便于连接。
幻灯片74
(三)载体的制备的方法
1.碱变性法
2.羟基磷灰石柱层析法
3.释放法
4.酸酚法
5.溴乙锭-CsCl2密度梯度离心法
6.Kit-试剂盒法
幻灯片75
三、DNA分子的体外连接(Ligation)
(一)粘性末端连接:
用同一种酶或同裂酶裂解后,产生相同的粘性末端,很容易按照碱基配对的原则以氢键结合,在
T4DNA连接酶的作用下,共价闭合。
连接方式:
定向取代双向插入(正向/反向)
(双酶切)(单酶切)
措施:
载体酶切后,用AP(碱性磷
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