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由此表明基因是可以的,而且是可以重组的。
(4)多肽与基因之间存在对应关系普遍认为,一种多肽就有一种相对应的基因。
因此,基因的转移或重组最终可以根据其表达产物——多肽的性质来考察。
(5)遗传密码是通用的一系列三联密码子(除极少数几个以外)同氨基酸之间的对应关系,在所有生物中都是相同的。
也就是说遗传密码是通用的,重组的DNA分子不管导人什么样的生物细胞中,只要具备转录翻译的条件,均能转录翻译出同样的氨基酸。
即使人工合成的DNA分子(基因)同样可以转录翻译出相应的氨基酸。
(6)基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代经重组的基因一般来说是能传代的,可以获得相对稳定的转基因生物。
基因工程是一项比较复杂的技术,如果抛开细节问题,基因工程操作的基本技术路线可以如图2—1所示,在此基础上根据自己研究的目的要求进行增删和具体化。
2.1DNA重组
从裸露的质粒到病毒颗粒(或噬菌体),从原核细胞到真核细胞,承载和传递遗传信息的物质,除少数病毒(噬菌体)是RNA(核糖核酸)外,其余的都是DNA(脱氧核糖核酸)。
在自然界,生物体内时刻发生DNA的重组,导致基因重组,呈现出对生物有利或有害的变异。
但是这种DNA重组一般不受人们的意志控制,重组结果难以预测。
而基因工程涉及的DNA重组是根据人们的愿望,进行严密的设计,在生物体外通过人为的DNA片段化和连接重组,产生新的重组DNA分子,使其遗传信息发生预期的变化。
体外DNA重组是基因工程的基本内容和关键技术,因此基因工程技术也称为DNA重组技术。
DNA是基因工程操作的主要对象。
2.1.1DNA
为了使不同的DNA分子或DNA片段能够按人们的设计进行重组,首先必须对DNA的组成、结构和功能有一定的了解。
2.1.1.1DNA的组成和结构
DNA是一类由四种脱氧核苷酸按照一定的顺序聚合而成的大分子。
脱氧核苷酸分子由脱氧核糖、碱基和磷酸基团组成。
脱氧核糖的第一位碳原子(1’)上连接一个碱基,第五位碳原子(5’)上连接一个磷酸基团。
一个脱氧核苷酸的脱氧核糖的5’磷酸基团和另一个脱氧核苷酸的脱氧核糖的3’羟基之间形成磷酸二酯键,把两个脱氧核苷酸连接在一起。
多个脱氧核苷酸按此方式连接成多聚脱氧核苷酸,其一端为游离的5’磷酸基团(5’—P),称为5’端,而另一端为游离的3’羟基(3’-OH),称为3’端(图2-2)。
组成DNA的碱基有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(C)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)四种,分别含有这四种碱基的脱氧核苷酸依次称为腺嘌呤脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷酸。
多聚脱氧核苷酸链中,各个脱氧核苷酸的脱氧核糖和磷酸基团的结构和位置是一致的,而不同的只是碱基。
因此在多聚脱氧核苷酸链(DNA链)中的脱氧核苷酸可以用碱基来表示。
例如,从5’端开始依此由鸟嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、腺嘌呤脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸连接成的核苷酸链可用碱基5'
-C,CCAT-Y表示。
DNA通常以双链形式存在。
两条脱氧核苷酸链总是按照碱基A与T互补配对和C与C互补配对的,通过氢键形成稳定的双螺旋结构,成为双链DNA(图2-3)。
只有少数病毒和噬菌体中的DNA是以单链形式存在的。
由于双链DNA是靠互补配对的碱基之间的氢键维持的,因此当溶解在溶液中的双链DNA处于较高温度条件下时,因氢键断开而解链成单链DNA,此过程称为DNA变性。
DNA溶液加热到90℃时,就足以使DNA完全变性。
高温变性的DNA被逐渐冷却时,分开的两条单链又会重新结合成双链DNA,此过程称为复性。
短链DNA容易精确复性,而长链DNA的复性比较困难,并且容易出现碱基错误配对。
在复性条件下,即使不是同一个DNA分子变性产生的两条单链,或者是人工合成的两条单链,只要它们之间的碱基序列是互补的,同样可以复性。
甚至于DNA与RNA之间,如果序列中碱基互补(除C与C配对外,RNA的U与DNA的A配对),在复性条件下也同样可以互相结合,成为双链杂种分子。
在基因工程的很多操作过程中常常利用DNA变性和复性的性质。
由于双链DNA中碱基是互补配对的,所以当一条链的核苷酸序列已经知道时,另外一条链的核苷酸序列也就知道了。
因此为便于书写,双链DNA的核苷酸序列往往以5’一3’走向的单链DNA的核苷酸序列来表示。
如DNA片段5’-GATCATGCCATC-3'
3’-CTACTACGGTAG-5’可写成5’—GATCATGCCATC-3’。
生物体内的DNA分子有的以线形存在,有的以环状存在。
几乎所有真核生物的染色体DNA都是线形DNA,小部分原核生物的染色体DNA是以线形存在的,而大部分原核生物的染色体DNA和全部线粒体DNA、叶绿体DNA以及细菌的质粒DNA是环状DNA分子。
病毒和噬菌体中有的含线形DNA,有的含环状DNA。
环状DNA分子一般以共价超螺旋形式存在,即ccc-DNA。
当ccc-DNA的一条链的一个磷酸二脂键断开时,则成为开环DNA分子(oc-DNA);
而当ccc-DNA的两条链中相对应的两个磷酸二脂键同时断开时,则成为线形DNA分子(1—DNA)。
2.1.1.2DNA的功能
(1)DNA分子能在细胞内复制DNA的功能之一是在细胞内能够进行半保留复制,复制后,新产生的双链DNA分子中含有一条旧的链和一条新的链,使DNA携带的信息可以精确的传代。
DNA的复制总是从具有一定核苷酸序列的位点起始的,这位点称为复制起始位点(ori),这对于DNA复制是不可缺少的。
从复制起始位点开始复制出一个DNA分子或一个DNA片段的核苷酸序列称为一个复制单位,或一个复制子。
有的DNA分子只有一个复制起始位点,完成全DNA的复制,整个DNA就是一个复制子。
原核生物染色体DNA、病毒(噬菌体)DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA和质粒DNA等属单复制子。
而真核生物染色体DNA分子的复制则由多个复制子共同完成。
(2)携带遗传信息DNA是遗传信息的主要携带者,DNA上的部分核苷酸序列决定着RNA的核苷酸序列。
通过转录,这些核苷酸序列分别指令转录出核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)和信使RNA(mRNA)。
rRNA成为核糖体的一部分,tRNA在蛋白质合成过程中转运氨基酸,mRNA上的核苷酸序列编码蛋白质的氨基酸序列,经翻译把遗传信息进一步传递给蛋白质(多肽)。
一般而言,一个mRNA编码一条多肽链,而原核细胞中有些mRNA能编码多条多肽链。
编码一个RNA或一条多肽链的DNA片段称为一个基因。
DNA的转录应包含转录启动子和转录区。
转录过程中,构成启动子的序列不转录出相应的RNA序列,只有转录区的序列才转录出相应的RNA序列。
把开始转录的第一个核苷酸(起录点)定为+1,其上游的核苷酸序列排列以“—”数表示,其下游的核苷酸序列排列以“+”数表示。
例如,起录点上游的第10个核苷酸定为—10,下游的第10个核苷酸定为+10。
一个基因或二个操纵子能否有效转录,首先取决于其上游是否存在有效的启动子。
启动子是RNA聚合酶识别和‘结合的位点。
启动子的序列具有相对的保守性。
原核生物基因的—4~—13核苷酸之间有一个由6个核苷酸组成的保守序列,多数情况是TATAAT序列,被称为Pribnow框或—10区;
在—35核苷酸前后有一个比较保守的TTGACA序列,被称为—35区。
—35区与—10区之间的序列对启动子的功能并不十分重要,绝大多数启动子中,间隔序列有17个左右的核苷酸。
真核生物基因的启动子虽然不像原核生物基因的启动子那样具有高度保守、功能明确的—10区和—35区,但也发现有3个比较保守的核苷酸序列区与转录启动相关。
这3个区分别是—25~—30区的TATA序列,—70~—80区的CAAT序列以及—80~—100区的CC序列。
转录区从转录RNA的起录点开始,包括基因编码区和转录终止子。
原核生物基因的起录点多数是CAT,少数是CAC或TAC,但一般从A开始转录。
真核生物基因的起录点不如原核生物基因的那样固定,但多数仍从A开始转录,少数从G开始转录。
在原核生物结构基因的起录点下游不远处,有一个相当保守的5’-AGGAGG-3’序列,转录出mRNA上的5’—AGGAGG~3’序列,与核糖体30S亚基16SrRNA3’端的5'
-CCUCCU-3'
互补,成为30S亚基识别和结合mRNA的位点。
把此序列称为SD序列(Shine-Dalgamosequence)。
真核生物基因转录区不具SD序列的互补序列。
.基因编码区指转录mRNA上起始密码AUG(少数情况是GUG)至终止密码UAG(或UAA、UGA)的各种遗传密码的核苷酸序列(表2-1)。
在DNA的5’→3’链上以ATG(或GTC,)表示起始密码序列,以TAG(或TAA、TGA)表示终止密码序列。
原核生物的转录区有的是由2个或2个以上的基因组成的操纵子。
组成同一操纵子的所有基因共用一个启动子,但是每个基因的编码区都含有起始密码序列和终止密码序列,两个基因编码区之间往往含有非编码的间隔序列区。
真核生物的转录区,一个启动子只控制转录一个基因的编码区,但是编码区内除了各种编码序列外,往往含有一个或几个长度各异的非编码间隔序列区,称为内含子(intron)。
多数内含子的5’端都是GT,3’端总是AG,构成GT'
….·
AG的内含子序列。
被内含子分隔的小区,称为外显子(exon)。
编码区内有n个内含子就有n+1个外显子。
由基因转录和加工后成熟的mRNA中不含内含子转录的序列。
在基因编码区下游有一段使转录终止的核苷酸序列,称为转录终止子(termi-nator)。
一个操纵子虽然有多个基因组成,但是与启动子一样也只需一个终止子.终止子的结构虽然不同生物之间有明显的差别,但是一般含有富cc的反向互补重复序列,如5’—CCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAA-3’,其中5’-GCCCGC与5,-GCGGGC为富GC的反向互补重复序列。
由此序列转录的RNA序列折叠形成终止子发夹结构,见图2-4。
病毒、噬菌体、线粒体、叶绿体和质粒等的转录启动子和转录区的结构,有的与原核生物的相同,有的与真核生物的类似。
人工构建的融合基因中,为了增强其表达量,往往组装两个转录启动子和(或)两个转录终止子。
2.1.2限制性内切核酸酶和DNA片段化
DNA体外重组,首先必须获得需要重组和能够重组的DNA片段。
用限制性内切核酸酶酶切DNA分子是获得这种DNA片段的主要途径。
2.1.2.1限制性内切核酸酶
性内切核酸酶(restrictionendonuclease)是一类能识别双链DNA中特殊核,并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开,产生具基团和5’—P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonucle—令发现的限制性内切核酸酶有工型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶,它们各具特性。
操作中真正有用的是Ⅱ型酶,如果没有专门说明,通常所说的限制性内切是Ⅱ型酶。
限制性内切核酸酶一般以酶源生物的属名和种名前1、2个字母以及株(型)代号来命名。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶,则依次用罗马数字表示。
例如,从HaemophilusinfiuenzaeRd中提取到的第三种限制性内切核酸酶被命名为HindⅢ(前三个字母必须是斜体)。
2.1.2.2限制性内切核酸酶的识别序列
限制性内切核酸酶在双链DNA上能够识别的核苷酸序列被称为识别序列。
各种限制牲内切核酸酶各有相应的识别序列。
现在发现的多数限制性内切核酸酶的识别序列由6个核苷酸对组成.如常用的限制性内切核酸酶EcoRI,HindⅢ和
有的限制性内切核酸酶可识别两种以上的核苷酸序列。
如AccⅠ即可识别GTATAC,又可识别GTCGAC;
DdeI可识别的核苷酸序列有CTAAG、CTFAG、CT-GAG和CTCAG。
这样的限制性内切核酸酶为获得多种酶切片段提供了方便。
另有一些限制性内切核酸酶虽然来源不同,但是具有相同的识别序列。
这样的限制性内切核酸酶被称为同裂酶(isoschizomer),如BamHI和BstI为同裂酶,具有相同的识别序列GGATCC。
同裂酶可以具有不同的酶切位点,也可以具有相同的酶切位点。
前者肯定是两种不同的限制性内切核酸酶,而后者往往是从不同生物中提取到的同一种限制性内切核酸酶。
2.1.2.3限制性内切核酸酶的酶切位点
DNA在限制性内切核酸酶的作用下,使多聚核苷酸链上磷酸二脂键断开的位置被称为酶切位点,可用↓表示。
限制性内切核酸酶在DNA上的酶切位点一般是在识别序列内部,如C↓GATCC、AT↓CGAT、GTC↓GAC、CCGC↓CC、AGCGC↓T等。
少数限制性内切核酸酶在DNA上的酶切位点在识别序列的两侧,如↓GATC、CATG↓、↓CCAGG等。
DNA分子经限制性内切核酸酶酶切产生的DNA片段末端,因所用限制性内切核酸酶不同而不同,见图2-5。
两条多聚核苷酸链上磷酸二脂键断开的位置如果是交错的,产生的DNA片段末端的一条链多出1至几个核苷酸,这样的末端称为黏性末端。
DNA片段末端的3’端比5’端长的称为3’黏性末端,DNA片段5’端比3’端长的称为5’黏性末端。
如果两条多聚核苷酸链上磷酸二脂键断开后产生的DNA片段末端是平齐的,称之为平末端。
不管是黏性末端还是平末端,5’端一定是一P基团,3’端一定是一OH基团。
有些限制性内切核酸酶虽然识别序列不同,但是酶切DNA分子产生的DNA片段具有相同的黏性末端,称这样的一组限制性内切核酸酶为同尾酶(isocaudar-:
ner)。
如TaqI,ClaI
和AccI为一组同尾酶,其中任何一种酶酶切DNA分子,均产生5’-CG黏性末端。
同尾酶在基因重组操作中有特殊的用途。
2.1.2.4限制性内切核酸酶反应系统
限制性内切核酸酶同其他酶类一样,反应系统除酶本身外,还应包括反应底物和反应缓冲液,并且还需要合适的反应温度。
限制性内切核酸酶的反应底物是环状的或线形的双链DNA分子(或DNA片段)。
厂家提供某种限制性内切核酸酶时一般同时提供一种相应的反应缓冲液。
大多数限制性内切核酸酶的最适反应温度是37℃。
2.1.2.5限制性内切核酸酶酶切DNA的方法
常用的酶切方法有单酶切、双酶切和部分酶切等几种。
(1)单酶切法这是用一种限制性内切核酸酶酶切DNA样品。
若DNA样品是环状DNA分子,完全酶切后,产生与识别序列数(n)相同的DNA片段数,并且DNA片段的两末端相同。
若DNA样品本来就是线形DNA片段,完全酶切的结果,产生n+1个DNA片段数(图2-6),其中有两个片段的一端仍保留原来的末端。
(2)双酶切法这是用两种不同的限制性内切核酸酶酶切同一种DNA分子的方法。
DNA分子无论是环状DNA分子,还是线形DNA片段,酶切结果,DNA片段的两个黏性末端是不同的(用同尾酶酶切除外)。
环状DNA分子完全酶切的结果,产生的DNA片段数是两种限制性内切核酸酶识别序列数之和。
线形DNA片段完全酶切的结果,产生的DNA片段数是两种限制性内切核酸酶识别序列数之和加1。
(3)部分酶切部分酶切指选用的限制性内切核酸酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的酶切(图2-6)。
导致部分酶切的原因有底物DNA的纯度低、识别序列的甲基化、酶用量不足、反应时间不够以及反应缓冲液和温度不适宜等。
部分酶切会影响需要的DNA片段的得率。
但是从另一方面说,有时根据重组DNA的需要,还专门创造部分酶切的条件,以获得需要的DNA片段。
2.1.3特异性DNA片段的PCR扩增
1983年建立了体外扩增DNA片段的方法,即PCR(polymerasechainreaetion,聚合酶链式反应)法。
采用这种方法,在反应系统中只要有一个拷贝待扩增的DNA片段,在短时间内就能扩增出大量拷贝数的特异性DNA片段,可满足用于常规方法的DNA检测和重组。
2.1.3.1PCR基本原理
PCR反应是模仿细胞内发生的DNA复制过程进行的,以DNA互补链聚合反应为基础,通过靶DNA变性、引物与模板DNA(待扩增DNA)一侧的互补序列复性杂交、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环,产生待扩增的特异性DNA片段。
一般反应过程是①反应系统加热至90~95℃,模板双链DNA变性成为两条单链DNA,作为互补链聚合反应的模板;
②降温至37~60℃,使两种引物分别与模板DNA链的3’一侧的互补序列杂交(复性):
③升温至70~75℃,耐热性DNA聚合酶催化引物按5’一3’方向延伸,合成模板DNA链的互补链。
重复以上过程,经过3次循环,就可以出现待扩增的特异性DNA片段,见图2-7。
由于上一次循环合成的两条互补链均可作为下一次循环的模板DNA链,所以每循环一次,底物DNA的拷贝数增加一倍。
因此PCR经过n次循环后,待扩增的特异性DNA片段基本上达到2n个拷贝数。
如经过25次循环后,则可产生225个拷贝数的特异性DNA片段,即3.4X107倍待扩增的DNA片段。
但是,由于每次PCR的效率并非100%,并且扩增产物中还有部分PCR的中间产物,所以25次循环后的实际扩增倍数为1X106~3X106。
采用不同PCR扩增系统,扩增的DNA片段长度可从几百碱基对(bp)到数万碱基对。
2.1.3.2耐热性DNA聚合酶
耐热性DNA聚合酶的发现使PCR扩增特异性DNA片段成为可能。
由于这种酶在靶DNA变性的高温下仍保持活性,所以在PCR扩增特异性DNA片段的全过程中,只需一次性加入反应系统中,不必在每次高温变性处理后再添加酶。
目前用于PER的耐热性DNA聚合酶主要有以下几种。
(1)TaqDNA聚合酶这种酶具有强的5’→3’DNA聚合酶活性和5’→3’外切酶活性,没有3'
→5'
外切酶活性,以带引物的单链DNA为模板,催化互补链的聚合反应,使引物按5’→3’方向延伸,一般用于扩增1kb(1kb=1000bp)左右的DNA片段。
(2)PwoDNA聚合酶这种酶具有强的5’→3'
DNA聚合酶活性,兼有3'
→5’外切酶活性,没有检测到5’→3’外切酶活性,可扩增5kb的DNA片段。
由于PwoDNA聚合酶具有3’→5’外切酶校对活性,用这种酶扩增DNA的准确度比用TaqDNA聚合酶高10倍。
并且用PwoDNA聚合酶PCR扩增的DNA片段是平末端的,因此,可直接用于平末端连接。
(3)TthDNA聚合酶由于这种酶在高温下既具有反转录的功能,又具有DNA扩增的功能,所以被用于反转录—聚合酶链式反应(RT-PCB),对于从RNA水平检测和分析基因表达是十分有用的。
TthDNA聚合酶用于RT-PCR系统,可以扩增至少1000bP长的cDNA片段。
(4)C.therm.聚合酶这是一种以Mg2+为辅助因子的反转录酶,在RT-PCR系统中催化反转录反应,合成cDNA的准确度比用TthDNA聚合酶高。
2.1.3.3PCR引物
引物是PCR过程中与模板DNA部分序列互补,并能引导模板DNA的互补链合成的一种脱氧核苷酸寡聚体,其3’端必须具有游离的一OH基团。
引物按预先设计用化学方法合成,其长短与PCR过程的特异性高低密切相关,引物长的,特异性高。
为扩增特异性高的DNA片段,一般设计的引物由20~30个核苷酸组成。
2.1.3.4DNA片段PCR扩增系统
自从建立DNA片段的PCR扩增系统以来,无论在PCR技术的研究上,还是在PCR技术的应用上,发展都非常迅速。
根据扩增不同DNA片段的需要,至今已建立了多种PCR扩增系统,如套式PCR、反向PCR、不对称PCR、锚定PCR、长程PCR、反转录PCR、锅柄PCR、AluPCR、多重PCR、原位PCR、定量PCR、免疫PCR和抑制PCR等扩增系统。
2.1.4DNA片段的化学合成
现在用化学方法合成DNA片段是一种十分成熟和简便的技术,利用DNA合成仪,根据待合成的DNA片段预定的核苷酸序列,可自动地将4种核苷酸单体按3’→5’磷酸酯键连接成寡核苷酸片段。
目前常用此方法合成引物、寡核苷酸连杆以及基因片段等。
(1)合成引物除上述的PCR引物外,常用的还有核苷酸序列测序引物和合成cDNA的引物等。
(2)合成DNA寡核苷酸连杆(1inker)寡核苷酸连杆也称为衔接物或接头,是一种按预先设计,化学合成的寡核苷酸片段。
寡核苷酸连杆一般由8~12个核苷酸组成,以中线为轴两侧互补对称。
其上有一种或几种限制性内切核酸酶的识别序列,使连接了寡核苷酸连杆的DNA片段经过这些限制性内切核酸酶酶切后,可以产生一定的黏性末端,便于与具有相同黏性末端的另一DNA片段连接。
有的寡核苷酸连杆超过100个核苷酸,其上有多种限制性内切核酸酶识别序列,不仅可作为连杆,而且被组装在克隆载体上成为多克隆位点(MCS)。
这样的连杆被称为多克隆位点寡核苷酸连杆或简称MCS连杆。
如果连杆的两端已具有一种或两种限制性内切核酸酶酶切产生的黏性末端,可直接使两DNA片段连接,也称为衔接头(adaptor)。
(3)合成基因片段根据某基因测定的核苷酸序列,或者根据蛋白质氨基酸序列推导的核苷酸序列,可以化学合成相应的基因片段。
2.1,5DNA片段的连接重组
基因工程的实质是基因重组。
基因之所以能够在试管内进行重组,是因为DNA片段在DNA连接酶作用下能够进行连接,组成重组DNA分子。
2.1.5.1DNA连接酶
DNA连接酶(
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