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挥发性和非挥发性萜烯都能吸引传粉昆虫、食草动物的天敌,避免植物受到光胁迫、调节植物的耐热性和直接防御昆虫和微生物[1-3]。
目前已经鉴定了2万多种萜类代谢物,这些天然产物丰富的结构多样性令人着迷和困惑。
通过对这些产物的生化基础和生物学意义的研究,发现合成这些萜类物质生物的最初前体物质是简单的具有C5骨架的异戊烯基焦磷酸(IPP)及其异构体二甲基
烯丙基焦磷酸(DMAPP)。
通过三种异戊烯转移酶的作用产生萜类的直接前体物质,三种线性的异戊烯二磷酸,即香叶基二磷酸(GPP,C10)、法尼基二磷酸(FPP,C15)和香叶基香叶基二磷酸二磷酸(GGPP,C20)。
如图一所示,萜类合成酶(TPS)是合成萜类物质的关键酶,分别以DMAPP、GPP、FPP、GGPP为底物合成半萜(C5)、单萜(C10)、倍半萜(C15)、双萜(C20)。
植物半萜、单萜、倍半萜和双萜合成酶在进化上相互联系,但是在结构上又不同于三萜和四萜合成酶,这在本文中不重点论述。
大量的萜类合成酶已被发现,随着实验技术的提高,它们功能也得以鉴定,例如利用基因组测序获得的信息来进行序列拼接,从而获得基因的全长[4]。
一些萜类合成酶只能催化产生一种特定的萜类化合物,而一些酶则能催化产生具有高定向性的复合物[5]。
近年来取得的研究进展主要集中于TPS多肽结构的分析和在不同模式植物中TPS基因家族成员的鉴定和生化研究。
这些研究发现可以使我们更好地了解TPS的蛋白结构特征,它们能推动形成大量萜类物质的反应机制,也是萜类物质多样性的分子进化的基础。
本文主要论述了近两三年来萜类物质的形成、单一物种中萜类物质的变异以及萜类物质的多样性。
而通过萜类合成酶的结构和进化、以及生长发育阶段和环境因素对TPS基因的表达调控可以确认植物中萜类物质的多样性。
这些研究结果能够用于分析植物中萜类代谢物的功能。
萜类合成酶在萜类物质合成的进化和多样性方面的作用
造成萜类代谢物的结构多样性的主要原因是由于萜类合成酶大家族的演变,目前已发现100多个TPS基因。
一个最近的系统发育树分析将挪威云杉中推断出的萜烯合图一
植物萜类合成图。
(a)所有萜类物质都由萜类合成酶催化,底物来源于DMAPP、GPP、FPP和GGPP。
其中,DMAPP通过异戊烯转移酶连接不同个数的IPP形成GPP、FPP和GGPP。
不同的单萜合成酶、倍半萜合成酶、双萜合成酶产物如图所示。
所有I类萜类合成酶催化反应都包括戊烯二磷酸底物电离,正碳中间体形成的初始步骤。
II类双萜合成酶,如CPP合成酶催化GGPP经过质子诱导环化形成CPP。
双功能双萜合成酶(I类和II类)如松香二烯合成酶催化GGPP初始环化形成酶—(+)-CPP复合物,再对(+)-CPP电离驱动环化,经过一系列步骤最后形成松香二烯。
I类双萜合成酶产物包括CPP或GGPP(图中未显示)。
所有萜类合成酶产物都可以进行二次转化。
(b)图示植物细胞中萜类合成产物。
合成C5单元的IPP和DMAPP包括细胞液中甲羟戊酸和质粒中赤藓糖醇磷酸两个独立途径。
FPP和倍半萜代谢产物主要在细胞液中合成,异戊二烯、单萜、双萜主要在质粒中产生。
OPP指二磷酸基。
酶基因的氨基酸序列与其他裸子、被子植物中的序列进行了比较,分析结果证实了早期的研究,即大多数裸子植物中的萜类合成酶家族不同于被子植物中的萜类合成酶家族[6],但是所有植物中的萜类合成酶都来源于一种双萜合成酶,这种酶参与了初级代谢,在被子植物和裸子植物中的萜类合成酶分化、功能特殊化之前就已经存在[6,7]。
模式植物拟南芥、玉米、水稻、马铃薯、苜蓿属和云杉属中的基因组序列和表达序列标签(EST)数据表明存在大量的TPS基因家族,这主要是由于基因的周期性复制、多位点突变和可能存在的功能分离。
拟南芥中的TPS基因家族是展现萜类合成酶进化演变过程很好的实例[8]。
编码1,8-桉油醇合成酶和(Z)-γ-没药酸合成酶的两个于根部表达的基因已经被分离[9˙,10]。
每个基因都以双拷贝形式存在,分别具有100%和91%的氨基酸序列一致性,这揭示了进化上的前后复制。
此外,拟南芥中的另一个TPS基因已经被鉴定,与1,8-桉油醇合成酶有高达78%的同源氨基酸序列,但是1,8-桉油醇不是这个编码酶的主要产物,它主要在花器组织中特异性表达[11]。
这些发现揭示了组织特异性表达模式的差异和与TPS基因紧密相关的催化活性。
在裸子植物和被子植物进化枝中不同物种的的单萜、倍半萜和双萜合成酶构成了TPS亚家族(TPSa-g)[6]。
尽管如此,TPS基因的快速演化也构成了特异物种旁系同源的TPS基因簇。
在拟南芥中,超过10种倍半萜和推断可能为双萜合成酶之间的关系比其他被子植物中的这两种酶关系更为密切[8,12˙]。
除了这些物种特异基因的趋异进化,TPS基因功能的趋同进化也被发现。
例如,异戊二烯合成酶和其他萜类合成酶通过相对简单的反应机制生成非循环产物,如(E,E)-α-法尼烯[13˙]。
这些酶在被子植物和裸子植物中明显区别于单萜合成酶而独立进化。
除了萜类合成酶的快速演化,这些酶催化剂的结构特征也是导致萜类物质多样性的另一个主要原因。
I类单萜、倍半萜、双萜合成酶的反应机制(图1a)包括戊烯二磷酸底物的二价阳离子依赖性离子化和正碳中间体的形成[5]。
这个中间体具有多种不同的代谢途径,可合成结构相异的产物。
通常只根据萜类合成酶的初级结构预测其合成产物的特征是不可能的。
因此,阐明酶结构与功能的关系必须依靠蛋白质的三维(3D)结构,同时也与催化反应中氨基酸残基的位置有关。
有研究对烟草中的倍半萜合成酶马兜铃合成酶和鼠尾草中的单萜合成酶龙脑磷酸合酶的结构进行了分析,阐明了催化机理与位于羧基端区域的活性位点的拓扑结构之间的关系。
虽然双萜合成酶催化II类和双功能类型反应机制的研究已较深入,但目前它的三维结构仍不清楚。
II类双萜合成酶,如参与赤霉素和植物抗毒素合成的顺式和反式CPP合成酶,它能催化GGPP经质子诱导环化为CPP(图1a;
[16])。
双功能(I类/II类)双萜合成酶,如巨冷杉中的松香二烯合成酶,在GGPP环化初始步骤形成(+)-CPP酶复合物,随后(+)-CPP经离子驱动环化及一系列反应形成松香二烯同分异构体。
这两个环化反应分别发生在中心区域(包含有质子化作用的DxxD模体)和羧基端的不同活性位点。
但是,一系列短截肽链的酶活性表明这两个区域在结构上相互依赖,不能作为完全独立的活性中心[17]。
同时,双功能酶和II类酶拥有一个额外的,长度约为250个氨基酸的氨基末端“插入”元件,它的存在有助于蛋白质的正确折叠[16]。
对该区域三维结构的研究有助于阐明其特殊功能。
根据已知的双萜合成酶结构,通过域交换和定点突变建立的相关的萜类合成酶多肽模型,可以识别控制产物专一性的区域和活性层及周围层的氨基酸残基。
虽然萜类合成酶整体结构具有很高的相似性,但对与特殊机制相关的氨基酸的鉴定分析到目前为止寥寥无几。
可产生多种产物的双萜合成酶通常表现为多个氨基酸共同作用控制级联反应。
这个现象在对巨冷杉中多产物单萜合成酶的活性中心互换和定点突变研究中可以观察到。
例如,将α(-)-蒎烯合成酶转化为高度同源的(-)-樟脑萜合成酶和通过改变(-)-柠檬烯合成酶和有91%相似性的(-)-柠檬烯合成酶/α(-)-蒎烯合成酶的产物[19]。
最近对玉米中两种萜类合成酶TPS4和TPS5的研究证明了位于这些酶催化中心的氨基酸的作用。
依次对应某种倍半萜挥发物的酶产生的倍半萜混合物混合两种不同的玉米品种,它们的基因组都含有TPS基因但是只有一个功能性等位基因[20˙˙]。
这项研究揭示了萜类物质多样性如何影响栽培品种育种,主要是由于与TPS基因密切相关的初级结构中的等位变异和微妙差异。
通过建模和定点突变对TPS4作用机制的进一步分析表明导致倍半萜合成的反应发生在催化中心的两个不同部位。
一个口袋用于包裹(E,E)-FPP,对顺式橙花叔二磷酸中间体进行异构化作用和形成(S)-及(R)-没药酸阳离子的初始环化,这些阳离子经过构象改变从一个口袋转化到另一个口袋,随后形成不同的倍半萜产物[21]。
对玉米TPS4和TPS5合酶的研究也表明等位基因编码的非功能性萜类合成酶也明显被转录。
在存在自然变异的不同生态型的拟南芥的花器萜类挥发性组分中也发现类似情况。
特定生态型的花器失去倍半萜挥发性物质主要是由于两种TPS等位基因的变异或转录后调控及翻译调控,而不是由于转录的区别[12˙]。
不同品种罗勒的盾状腺体中存在大量单萜和倍半萜混合物变异体,主要受控于几个TPS功能基因表达的种内变异[22˙]。
阿哈罗尼等[23˙]描述了芳樟醇/橙花叔醇合成酶(FaNES1)和蒎烯/月桂烯合成酶基因的差异表达分别决定在栽培草莓和野生草莓中萜类产物的丰度。
FaNES1主要在胞质中发生作用,因为质体转运肽的缺失,这种肽是由野生草莓中萜类合成酶相关的等位基因编码。
FaNES1负责芳樟醇和橙花叔醇的合成,这意味着胞质液中存在着GPP和FPP的底物区域。
这是一个不同寻常的发现,因为在大多数植物中,GPP和GGPP在质体中合成,而FPP在细胞液中合成,两者间几乎没有交叉(图1b)。
由于许多萜类合成酶,比如FaNES1,不止作用于一种底物,萜类物质多样性和变异性调控的一个关注点在于萜类合成酶在亚细胞位点的活性与底物共同决定着产物的特异性。
在应对环境的过程中不同植物组织中的萜类合成酶的调控
通过研究萜类合成酶基因在植物生长发育过程中及对生物、非生物环境因素的反应中的差异表达特征,可发现萜类代谢物具有一些生态和生理功能(图2)。
挥发性萜类一般在特定的时间从特殊花器中释放以吸引传粉昆虫。
杜达雷瓦等[24]研究发现金鱼草中的单萜(E)-β-罗勒烯和月桂烯的生物合成和释放与花生长过程中花冠上下部中相应单萜合成酶基因的特定表达模式有关,在花后四天,转录水平达到最大值。
这些基因表达在生物钟的控制下存在微弱的日变化。
在拟南芥花中,单萜和倍半萜合成酶在花瓣中不表达,只在柱头、花药、蜜腺、萼片中表达[12˙]。
这些表达特征表明,在拟南芥中合成的挥发性萜类不仅在短期内用于吸引授粉昆虫,同时也可驱赶病原微生物及食草动物,保护植物组织。
许多单萜和倍半萜合成酶的基因已经从富含萜类的细胞和组织,比如叶腺毛状体、农业生产中的重要水果柑橘、葡萄中分离和描述[22˙,25-29]。
通过对香气物质合成的代谢和遗传调控相关的研究发现,一些TPS基因在水果和花中广泛表达,而另一些只在水果生长、成熟的特定阶段特异性表达。
目前对植物挥发性物质的生化功能研究已成为一个热点,许多研究者开始关注萜类挥发性物质在吸引食草动物和植物寄生虫的天敌来进行间接防御过程中的作用。
因此,通过食草动物或者红蜘蛛虫害可诱导产生一些TPS基因表达,引起挥发性单萜和倍半萜的再次合成,这已经在玉米、黄瓜、苜蓿属、莲属中通过微矩阵、EST-data和cDNA分析得到了证实[30-33]。
由于不同害虫和树木上相关真菌的破坏作用,挥发性或非挥发性萜类物质在树木防御过程中的作用已成为目前研究的重点。
例如在白杨中喂养天幕毛虫会局部和系统地诱导叶片中萜类合成酶基因的表达和萜类物质的释放[34˙]。
同样,阿拉斯特加云杉遭受白松象鼻虫侵袭后在茎中也会诱导TPS基因的表达[35]。
TPS转录水平的提高伴随着萜类物质的大量积累,这种反应被在针叶树中表现为外伤性泌脂现象。
在获得完整的水稻基因组序列后,单子叶植物中萜类代谢物的生物合成和功能的研究得以展开。
特别是赤霉素和双萜防御性代谢物(如赤霉素和化感物质)已经被详细研究,一些柯巴基焦磷酸合酶和贝壳杉烯和酶类基因已经被鉴定[36]。
单一的对映柯巴基焦磷酸合酶(OsGPS1)和贝壳杉烯合成酶(OsKS1)基因很有可能主要参与赤霉素的合成[36,37˙,38˙],另一些基因则参与双萜植物抗毒素的生成,在水稻叶片遭受刺激物或紫外线处理后诱导表达。
例如,一个顺式CPP合成酶基因(如OsCyc1和OsCPSsyn)和另一个顺式CPP合成酶同工酶基因(OsCyc2)已经被鉴定。
这些基因产生的CPP前体物质来源于稻壳酮、
图二
萜类合成酶表达的植物组织和器官在应力和胁迫状态。
括号内数字代表在特定组织中萜类合成酶基因表达或活性的相关参数。
oryzalexines和phytocassanes派生出的的双萜碳骨架[16,37˙,38˙]。
另外,两个I类双萜合成酶(OsDTCS1和OsDTS2)已经被确认分别转化对映CPP和反式-CPP为植物抗毒素双萜前体物质[39,40]。
相比这些地上部植物的器官,根部萜类物质的生物合成和功能尚不清楚。
仅有少数几种萜类合成酶被鉴定,如水稻中的双萜合成酶OsDTS2[40]。
在拟南芥中,编码1,8-桉油醇合成酶和(Z)-γ-没药烯的TPS基因在幼嫩根部生长区的中柱和较老根部的外层和表皮中进行不同的表达[9˙,10]。
这些发现引发了挥发性萜类物质在根部不同生长发育阶段的生化功能及它们同食草动物、寄生虫、微生物的互作关系等研究热点。
在裸露的植物器官中,根部在胁迫条件下会诱导产生萜类物质,比如对道格拉斯冷杉根部进行茉莉酸甲酯处理[41]或玉米根部遭受草食动物侵袭[42]。
许多研究证明萜类合成酶的活性受控于TPS基因的转录水平。
但是到目前为止,仅有一个转录因子——Gawrky1被鉴定,它在棉花中调控δ-杜松烯合成酶(CAD1-A)的表达[43˙]。
CAD1-A催化植物抗毒素棉子酚合成中的第一个关键步骤。
GaWRKY1和CAD1-A在花器官中存在协同表达,在真菌诱导处理后会产生这种响应。
W盒元件是设定的WRKY转录因子的结合位点,它不仅在CAD1-A启动子中被鉴定,也存在于其它植物TPS基因的启动子中,包括烟草中的5-epi-马兜铃合成酶[44]以及从拟南芥和水稻中推断的一些TPS基因[43˙]。
关于萜类合成酶转录后、翻译后的调控机理主要在拟南芥倍半萜挥发性物质的生物合成的相关研究中发现12˙]。
此外,杨树叶片中异戊二烯合成的季节性多样性分析揭示了异戊二烯合成酶活性的翻译后修饰[45˙]。
而且杨树中异戊二烯合成也受代谢水平调控,因为底物DMAPP的浓度和异戊二烯的释放受控于白天的协调变化,没有导致异戊二烯合成酶活性的改变。
在金鱼草花中,单萜的生物合成与GPP合成酶的小亚基的表达水平紧密相关,这表明在花的生长发育阶段单萜合成受到GPP底物的严格调控[46]。
通过调控萜类合成酶的表达评估萜类在植物中的功能
植物萜类代谢产物的生物活性,比如它们的毒性、防虫性、抗菌性,已经通过体外分析得以验证。
但是这些研究并不一定可以反应生物体中萜类产物在细胞核组织水平上的生物活性效应。
另外,许多植物产生萜类混合物,从生态学上角度来看比单一萜类物质更加有效,如吸引授粉昆虫、昆虫的寄生虫或者减慢突破植物直接防御机制的速度。
解决这些问题最为有效的途径之一就是在模式植物中通过TPS基因的表达调控萜类物质的合成。
Bouwmeester实验团队[47]研究发现草莓橙花叔醇/芳樟醇合成酶基因FaNES1在拟南芥叶片中的异位表达产生的效应是在正常条件下没有释放萜类挥发性物质。
定位于叶绿体中FaNES1基因合成的芳樟醇可以趋避蚜虫。
将FaNES1定位到线粒体细胞室中通过一种非特征性的线粒体酶可以使橙花叔醇转变为类似萜的4,8-二甲基-1,3-(E)-7-九三烯([E]-DMNT)。
DMNT的释放可吸引捕食螨,起到植物间接防御的作用[48˙˙]。
施内等[49˙˙]在拟南芥中玉米基因tps10的表达中也发现了同样的途径。
转基因植株释放tps10挥发性倍半萜可吸引雌性绒茧蜂,这种蜂类学会选择曾经暴露于这类挥发性物质之中的鳞翅目的寄主。
另一个例子证明可操纵萜类挥发性物质的释放来自于拟南芥中异常表达的异戊二烯合成酶,而拟南芥是一种不产生异戊二烯的品种。
虽然这些释放异戊二烯的转基因植株没有被深入研究,但是它们是未来分析异戊二烯在植物耐热和氧化应激保护作用的重要工具。
其他模式植物如在烟草中对萜类合成的操控也获得成功[50,51]。
与TPS基因表达植株相呼应,TPS基因被敲除的转基因植株可以用来研究单个内生萜类化合物或已确定的萜类混合物的生物功能。
例如,对拟南芥的在花中表达的倍半萜合成酶基因中插入T-DNA,拟南芥花中释放的倍半萜就发生明显的变化[12˙]。
这些植株可以帮助阐述拟南芥花中这些挥发物质在生理、防御或吸引的作用。
总结
萜类合成酶催化生成了植物中最丰富、结构最多样的天然代谢物。
萜类合成酶在多基因家族中的进化,它们合成多种产物的能力和它们受生长和胁迫相关机制影响的差异表达,共同导致萜类产物的复杂性和可塑性。
虽然我们目前已知数百种萜类合成酶,对于它们的结构和构造属性已经有所了解,但是解释这些萜类合成酶产物的生理、生态作用仍然是一个严峻的挑战。
对萜类在细胞、亚细胞水平合成的管理和调控机制的研究必须结合调控模式植物中萜类产物的生态或生理反应。
这些途径可以帮助我们进一步了解天然产物复杂性和多样性在植物与环境的联系中的作用。
致谢
非常感谢吉姆•笃久对手稿的建议及意见。
本文由马克思普朗克协会(乔纳森•格森中)和美国国家科学基金会(授权号IBN-0211697埃兰•波彻斯基)提供资金支持。
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