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标记溶液

●反应缓冲液，内含核苷混合物

●1×

550μl

3黄色

转换剂-POD

●荧光猝灭抗体，绵羊Fab片段，马-罗卜组合超氧化物

●直接使用

●3.5ml

试剂盒外自备仪器和试剂

出上表所列试剂外，实验者需制备系列溶液。

下表列出了在不同实验步骤中所需要的试剂。

在每步操作前都给出了详细的说明。

步骤

仪器

试剂

样品制备（3.2）

●细胞粘附，涂片和细胞离心涂片器的制备（3.2.1）

●低温保藏组织（3.2..2.2）

●清洗液：

磷酸盐缓冲液（PBS）

●结合液：

含3%H2O2的甲醇

●固定液：

4%的多聚甲醛PBS液，pH7.4，无菌制备

●渗透液：

0.1%的柠檬酸钠溶液（含0.1%TritionX-100），无菌制备【6】

石蜡包埋组织（3.2..2.1）

●二甲苯和乙醇（100%，95%，90%，80%，70%，溶解于双倍蒸馏水中）

PBS

●蛋白激酶K，不含核酸酶的工作液：

10-20μg/mlin10mMTris/HCl,pH7.4-8.0

其它处理方法

●渗透溶液：

0.1%的柠檬酸钠溶液（0.1%TritonX-100），无菌制备

●胃蛋白酶（0.25%-0.5%inHCl,pH2.0）或者胰蛋白酶（0.01NHC，不含核酶l）

●0.1M柠檬酸缓冲液，pH6.0，微波辐射用

标记步骤（3.3）

主观控制（3.3.1）

●小球菌核酸酶

●重组型DNaseⅠ，一级

细胞粘附、爬片、涂片及组织（3.3.2）

●帕拉玢膜或者盖玻片

●湿化腔

坚硬组织（3.3.3）

●塑料罐

●微波

●柠檬酸钠缓冲液，0.1M，Ph6

●0.1MTris-HCl,pH7.5（3%BSA,20%正常牛血清）

单分子转化（3.4）

●PBS洗液

●DAB金属增强试剂或者其它可替代试剂

●粘合试剂

2引言

2.1产品描述

实验原理

在细胞凋亡过程中，基因组DNA会断裂产生双链、低分子量的DNA片段和高分子量的单链DNA断端（缺口），这些DNA链缺口可以利用酶标记核苷酸3’末端方法来识别。

描述

1

末端脱氧核糖核酸转移酶以非模板依赖的方式催化自由的3’-OH末端核苷酸聚合反应，从而标记DNA链断端缺口。

2

马-萝卜的氧化酶被整合到绵羊的Fag片段上，并被带有荧光的抗体标记。

当发生反应后，标记的细胞就能够在光镜下被观察到。

3

反应结束后，在光镜下检测分析被染色的细胞。

应用

原位细胞凋亡检测试剂盒具有准确、快速、简单、非辐射等特点，可以用来对细胞或者组织中的单个细胞进行检测并定量，因而次法被用在很多分析系统中，例如：

●在基础研究和日常病理中检测冰冻和福尔马林固定的组织切片。

●在肿瘤研究和临床癌基因研究中确定某些恶性肿瘤对某种药物的敏感性。

●通过双染色操作，确定经历死亡的异常增生细胞的分型。

专一性

TUNEL反应可以更好的标记通过凋亡产生的DNA链末端，因此就可以区分出凋亡与坏死，以及由抗肿瘤药物或者放射诱发的初始DNA链末端。

试验干扰

假阴性：

在某些形式的细胞凋亡中，DNA逃逸酶切或者不完全（37）。

固定障碍物例如胞外的成分可以阻止TdT到DNA的通路，因而导致假阴性。

假阳性：

在坏死的末期可能产生一些额外的DNA碎片（4,38）。

在具有快速增值和转移能力的细胞中，DNA链裂解也可能比较突出，从而导致假阳性。

为了确认细胞凋亡，应仔细检测目标细胞的形态。

凋亡具有很特征的形态学改变，因此在干扰导致结果模糊的原位凋亡中，细胞形态学的确证尤其重要。

样品

●细胞涂片的制备

●贴壁细胞的腔室斜面培养（31）

●冷冻、福尔马林固定的、石蜡包埋组织部分（1，25，26，29，30，32-34,36,39）

分析时间

2-3小时，终止培养，固定，细胞渗透化以及组织制备。

实验次数

次试剂盒设计使用次数为50次。

试剂盒的稳定性及保存

保质期内的为开封的试剂盒储存在-15—25℃下

储存及稳定性

TUNEL反应混合物

TUNEL反应混合物应当现配现用，并立即保存冰浴中

转移物-POD

解冻的转移物-POD溶液储存于2-8℃的环境中（最长可保藏6月）

不宜冷冻

优点

请参照下表

特点

敏感

单分子水平上检测出早期凋亡

专一

优先标记凋亡（1,2,6）

快速

操作时间段（2-3h）

方便

试剂以最稳定和适宜的浓度形式提供

无需稀释步骤

灵活

●适于固定的细胞和组织，可以使样品收集、储存和运输成为可能

●应用双标可以区分凋亡细胞的分型和不同时期

质优

每一批产品都经过严格的检查

2.2背景知识

细胞死亡

细胞两种不同的死亡方式，凋亡与坏死，可以通过死亡细胞形态学、生物化学和分子生物学等方式进行区别。

细胞程序化死亡或称凋亡是真核细胞死亡的最常见的形式，它是细胞维持自稳状态而具有的一种生理性自杀机制，是发生于正常细胞的一种正常死亡（8,9）。

一般情况下,历经凋亡的细胞其细胞核与细胞浆会发生一些特征性变化，包括核膜快速皱缩及细胞核的崩解。

这种胞核的塌陷与钙依赖的内源性核酸内切酶（10,11）的活化而导致的染色体和DNA被裂解成寡核苷酸DNA片段密切相关（37）。

凋亡

凋亡是许多正常的生理过程所必需的，包括免疫系统（12,13）的成熟和作用机制、组织器官和肢体的发生（14）、神经系统（15,16）的发生等过程。

在许多病理条件下，凋亡机制的调节失衡（17）起很重要的作用，包括出血、中风、心脏病、癌症、爱滋病、自身免疫缺损和中枢神经系统的退行性变等（18-20）。

在癌基因的研究方面，由于细胞凋亡可由抗癌药物、放射及高热等启动，并且肿瘤细胞具有由于一些癌基因表达即能启动凋亡的内在特性，因此细胞凋亡已引起人们的广泛重视（21）。

凋亡的检测

检测凋亡细胞的方法有数种（22-24）。

细胞凋亡过程中核酸内切酶的活化是关键的过程，导致核DNA被裂解成寡核苷酸大小的片段。

因此，这个过程被用于检测凋亡，在琼脂糖凝胶电泳上出现典型的“DNA梯形带”。

但是，这种方法既不能检测单个细胞水平的凋亡，又不能提供细胞发生凋亡所处的组织位置和细胞分化状态等方面的信息。

这一切可以由凋亡的原位酶标记方法来完成。

DNA聚合酶和末端脱氧核酸转移酶（TdT）用来标记DNA链断端的核酸（1-6,25-36,41），应用TdT进行的末端反应又称为ISEL或TUNEL技术（1,6,31,33），它与ISNT相比具有以下优点：

●与ISNT相比，TUNEL标记细胞凋亡更为灵敏，从而增加其灵敏度（2,4）。

●TUNEL技术下的核苷整合技术更快（2,4）。

●优先标记发生凋亡的细胞，而不是坏死的细胞。

因此可以区分出坏死或者因药物或放射作用而引起的初期DNA裂解（3,4）。

3实验操作及耗材

下列描述的操作过程已由R.Sgonc等开发并已发表，这种简单快速的方法最突出的优点就是使用了荧光标记的dUTP来标记DNA链末端，这就允许在TUNEL反应后直接用荧光显微镜检测DNA片段，而后在进行POD荧光结合。

3.1分析流程

3.2.1细胞贴壁、涂片的制备

其它所需试剂

渗透液：

操作

下表描述了细胞固定、内源性氧化镁的结合以及细胞渗透

提示：

固定和渗透额外的两个样本作为阳性和阴性对照

在15-25℃下用新鲜的固定液固定风干的细胞1h

PBS清洗30min

15—25℃下，结合液处理10min

4

PBS冲洗斜面

5

渗透液冰浴（2-8℃）2min

6

依据3.3进行操作

3.2.2组织部分

3.2.2.1石蜡包埋组织的处理

石蜡包埋组织的前处理

可以用四种方法对组织进行前处理。

如果使用蛋白激酶K处理，那么核酶的有无、浓度、培养时间和温度等必须根据组织的类型进行优化（1,29,33,36,40,42））

不含核酶的蛋白激酶K源于RocheAppliedScience，因为它已经做了核酶有无的检测，否者会导致假阳性。

其它溶液

可供替代的试剂

0.1M柠檬酸缓冲液，pH6.0，微波辐射用。

在下表中，描述了不含核酶的蛋白激酶K处理和其它3中替补方法。

添加了阴性和阳性对照。

根据标准操作对组织进行脱蜡和再水化的操作（如60℃加热，然后用二甲苯冲洗；

用不同比例的乙醇进行系列的再水化过程）（1,33,36）

37℃下，用蛋白激酶工作液培养组织15-30min

替代方法

处理

1.渗透溶液

培养斜面8min

2.胃蛋白酶或胰蛋白酶

15-60min，37℃

3.微波放射

●斜面置于盛有200ml，pH6.0，0.1M的柠檬酸钠缓冲液的塑料瓶中。

●350W微波放射5min。

PBS清洗斜面两次

3.2.2.2冷冻保存组织的处理

所需试剂

0.1%的柠檬酸钠溶液（含0.1%TritionX-100），新鲜制备

冷冻组织

下表描述了冷冻组织的前处理

固定和渗透额外的两个样本作为阳性和阴性对照。

在15-25℃下用固定液固定组织20min

脱水组织浸泡无水乙醇2min，然后储存在-15—-25℃条件下

3.3标识规定

3.3.1开始之前

Tunel反应混合物的准备

取两个管（管1：

酶浓缩溶液，管2：

标记溶液）为10个样本和2个阴性对照组进行染色，每个样本使用50ulTunel混合液，每个对照组使用50ul标记溶液。

Tunel混合液需在使用前即刻配置，且不可储存。

需保存Tunel混合液处于冰冻状态直至使用。

具体操作

取100ul标记溶液（管2）于对照组。

将酶浓缩溶液（管1）的总量（50ul）添加到管2中剩余的450ul标记溶液中，以配成500ulTunel混合液。

混匀，以使各成分充分混合。

所需要的其它试剂：

微球菌核酸酶或重组脱氧核糖核酸酶，1级*

对照：

每个试验台上需包括2个阴性对照组及1个阳性对照组。

阴性对照

温育固定的透化细胞50ul/纯标记溶液替代Tunel混合液

阳性对照好

用微球菌核酸酶或重组脱氧核糖核酸酶、1级（50mM盐酸中包括3000U/ml-3U/ml，pH7.5，10mMMgCl21mg/mlBSA）在15-25°

C内1温育固定透化细胞10分钟以诱导DNA断裂，在标记法之前进行。

3.3.2有关贴壁细胞、细胞涂片、细胞涂片机的使用和组织的标识规定

需要的其他设备及溶液：

洗涤液：

PBS；

湿盒；

封口膜或盖玻片。

过程：

请根据以下表格使用：

用PBS溶液冲洗载玻片2次

使样本周围区域保持干燥

添加50ulTunel混合液到样本中

每个阴性对照组添加50ul标记溶液。

保证Tunel混合液在单层细胞中均匀扩散，避免蒸发造成丢失，温育期间应将样本用封口膜或盖玻片遮盖。

加盖，避光在湿盒中37°

C下温育60分钟。

用PBS液冲洗3次。

滴一滴PBS液，在该状态下在荧光显微镜下对样本进行分析。

使用激发波长范围为450-500nm，检波波长范围为515-565nm（绿色）。

3.3.3不同组织的标识规定

需要的其它设备及溶液：

缓冲液：

0.1M，pH6.0；

Tris盐酸：

0.1M，pH7.5，包括3%BSA和20%正常牛血清；

塑料罐；

微波；

湿盒。

请根据以下表格内容进行操作：

根据标准步骤进行脱掉固定组织部分的多聚甲醛或福尔马林。

把载玻片放到含有200ml0.1MpH为6.0的缓冲液的塑料罐中。

用750W微波照射1分钟。

迅速加入80ml蒸馏水（20-25°

C）进行快速冷却。

载玻片转移至PBS液（20-25°

C）中。

不要使用蛋白酶K进行治疗。

将载玻片沉于15-25°

C、0.1M、pH7.5、包括3%BSA和20%正常牛血清的盐酸中30分钟。

用PBS液在15-25°

C温度下冲洗3次。

让过多液体流干。

在该截面加50ulTunel混合液。

阴性对照组加50ul标记溶液。

7

避光、潮湿、37°

C条件下温育60分钟。

8

用PBS液冲洗3次，每次冲洗间隔5分钟。

3.4信号转换

洗涤溶液：

封口膜或盖玻片；

DAB基质或替代POD基质；

光学显微镜封固剂。

具体操作：

请按照以下表格内容进行操作。

使样本区域干燥。

样本中加50ulPOD抗体（管3）。

保证POD抗体在单层细胞上均匀扩散，避免蒸发丢失，温育过程中用封口膜或盖玻片遮盖。

37°

C下在湿盒中温育载玻片30分钟。

用PBS冲洗3次。

加入50-100ulDAB基质或替代POD基质。

15-25°

C下温度载玻片10分钟。

置于玻璃下（如：

用PBS/甘油），并于光学显微镜下观察分析。

替换物：

在光学显微镜下进行分析前可对复染样本。

4.附录

4.1疑难解答

该表格描述了各种各样的疑难问题的解答

问题

试剂或步骤

可能的原因

解决办法

无详尽标注

组织嵌入

对嵌入物质的聚合进行了紫外线照射（如甲基丙烯酸酯导致DNA分解）

使用不同的嵌入物质或不同的聚合试剂。

固定

酸性固定液（如：

石蜡切片、卡诺氏固定剂）

试用4%多聚甲醛冲洗液。

试用福尔马林或戊二醛。

Tunel反应

TdT浓度太高

可用Tune稀释液稀释到1：

2至1：

10之间以减少TdT浓度。

转换液

内在POD活性

透化细胞之前在3%H2O2中浸泡10分钟以阻止内在活性的POD。

非详尽的抗荧光POD链接

用正常抗羊血清进行对抗。

用含有3%BSA的PBS液20分钟进行对抗。

将抗体浓度降至50%。

核酸酶

一些组织（如平滑肌组织）在准备好组织以后，其DNA分解会非常快

在器官准备好时迅速固定组织

肝静脉中灌注固定剂

有些酶仍然非常活跃

用含有ddUTP及dATP的溶液进行阻止

背景颜色过深

固定剂

福尔马林固定剂导致含有黑色素前体物质的细胞染色为淡黄色

试用甲醇作为固定剂，但注意这可能导致敏感性减低。

对于乳癌而言，标签混合物浓度过高

通过稀释Tunel稀释液*将标签混合液浓度降低50%。

样本

支原体污染

支原体检测试剂盒*

细胞高度增生

复染，如：

用膜联蛋白荧光素*

不可能通过酶标仪测量，因为背景颜色太深。

标签过低

乙醇及甲醇可导致标签过低（在固定期间，核小体与蛋白质无交叉联系，并在染色过程中消失）

过度固定导致过量交联蛋白产生

减少固定时间

试用2%冲洗用多聚甲醛

透化作用

透化时间太短，导致试剂不能达到目标分子数。

增加温育时间

在稍高温度下进行温育（如15-25°

C）

试用蛋白酶K、无核酸酶（使浓度和时间尽量适于每种类型的组织）

70°

C下试用0.1M柠檬酸钠30分钟

石蜡包埋

试剂可达性太低

用蛋白酶K、无核酸酶（每种组织要求合适的浓度、时间及温度）脱蜡后处理组织部分

在200ml0.1MpH6.0柠檬酸盐（每种组织最适值不同）冲洗液中试用370W（低）微波照射5分钟

阳性对照组中无信号

脱氧核糖核酸酶

脱氧核糖核酸酶浓度太低

冰冻切片用3U/mL重组DNaseI、1级。

石蜡包埋组织部分用1500U/mL重组DNaseI、1级。

总之，用1U/mL重组DNaseI、1级溶解10mM含有10mMNaCl、5mMMnCl2、0.1mMCaCl2、25mMKCl的pH7.4盐酸，并在37°

C温度下温育30分钟。

替代冲洗液50mM、pH7.5且包含有1mMMgCl2和1mlBSA。

信号弱

复染

染色欠佳

可能需用5%甲基绿在0.1M、pH4.0的佛罗那醋酸溶液或苏木紫复染。

可以用碘化丙啶复染，但仅用于检测细胞形态上的改变。