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前言
罗非鱼为一种中小形鱼。
现在它是世界水产业的重点科研培养的淡水养殖鱼类,且被誉为未来动物性蛋白质的主要来源之一。
原产于非洲,属于慈鲷科之热带鱼类,和鲈鱼相似。
通常生活于淡水中,也能生活于不同盐份含量的咸水中,可以存活于在湖,河,池塘的浅水中。
它有很强的适应能力,。
绝大部分罗非鱼是杂食性,常吃水中植物和碎物。
此鱼在面积狭小之水域中亦能繁殖。
甚至在水稻田里能够生长。
罗非鱼是以植物为主的杂食性鱼类,其次是浮游植物、浮游动物和少量底栖动物。
罗非鱼耐低氧能力很强,窒息点为0.07~0.23毫克/升,水中溶氧1.6毫克/升时,罗非鱼仍能生活和繁殖。
罗非鱼性成熟早,产卵周期短,口腔孵育幼鱼,繁殖条件要求不高。
罗非鱼的生存温度范围为15~35℃。
当水温低于15℃时,罗非鱼处于休眠状态。
罗非鱼最高临界温度约40~41℃,最适宜生长温度为28~32℃,罗非鱼繁殖温度在20℃以上。
笔者对4个实验温度阶梯下罗非鱼肝脏Na+-K+-ATPase、Mg++-ATPase、Ca++-ATPase、Ca++Mg++-ATPase四种ATP酶进行活性测定,试比较分析ATP酶活性对于罗非鱼不耐低温是否有影响。
1材料和方法
1.1实验试剂与仪器
HH系列恒温水浴锅(江苏金坛中大仪器厂);
中佳SC-04低速离心机;
中佳KDC-160HR高温冷冻离心机;
722S可见分光光度计;
ATP酶测试盒50T(南京建成生物工程研究所第一分所);
罗非鱼(河南师范大学水产养殖基地)
1.2实验鱼肝脏提取
选择罗非鱼120条,分成4组,每组30条,养于4个鱼池。
4个鱼池分别设置温度为15℃,19℃,22℃和常温。
至少养殖一个星期。
到达限定时间后,解剖全部30条罗非鱼,取其肝脏放于离心管中,编号1-30,待用。
1.3肝组织匀浆的制备
取肝脏在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重取0.5g于烧杯中,用移液管量取0.86%的冷生理盐水,生理盐水的体积总量应该是组织重量的9倍,即4.5g(450ul),用移液枪量取总量的2/3的生理盐水于烧杯中,用眼科小剪刀尽快剪碎肝脏组织块。
将剪碎的肝脏组织倒入玻璃匀浆管中,再将剩余的1/3冷生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块,一起倒入匀浆管中进行匀浆,左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的烧杯中,右手将捣杆垂直插入套管中,上下转动研磨数十次(6~8分钟),充分研碎,使肝脏组织匀浆化(10%组织匀浆),放入离心管中待用。
将全部离心管编号1-30。
1.4线粒体的提取
将制备好的10%的肝组织匀浆,以1000r/min(中佳SC-04低速离心机)离心10分钟,弃沉淀,取上清液以10000r/min(中佳KDC-160HR高温冷冻离心机)离心15分钟,沉淀物为线粒体。
用移液枪量取1000ul冷生理盐水加到分离的线粒体中,制备成混悬液,将混悬液倒入玻璃匀浆管中,仍然用手工匀浆的方法匀浆,使线粒体破碎,待测酶活力(共30个样本)。
1.550T试剂组成与配置(南京建成生物工程研究所第一分所)
试剂一:
液体10ml×
2瓶,4℃保存。
试剂二:
1瓶,4℃保存。
试剂三:
试剂四:
粉剂×
3支,-20℃以下保存。
用时每支加水至5ml,现用现配。
余下的-20℃以下可保存一周。
试剂五:
1支。
用时加水至5ml,适当加热溶解,4℃保存。
试剂六:
用时加水至10ml,室温保存。
试剂七:
1瓶。
用时加水至25ml,4℃保存。
试剂八:
3瓶。
用时一支加水至40ml溶解(溶解后4℃可避光保存一周)。
试剂九:
用时每瓶加水至100ml溶解,室温保存。
试剂十:
2.5mol/L硫酸100ml×
试剂十一:
10mmol/L标准磷贮备液10ml×
1μmol/ml标准磷应用液配置:
用时将贮备液10倍稀释,即取1ml加蒸馏水至10ml。
定磷剂的配制:
按H2O:
2.5mol/L硫酸:
试剂八:
试剂九=2:
1:
1的比例配制,配好的定磷剂应为浅黄色,若无色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,定磷剂需现用现配。
1.6酶促反应
将样本与试剂按表1.1操作
表1.1加样顺序及用量
管号(μl)
A管
B管
C管
D管
E管
试机一(μl)
70
50
试剂二(μl)
20
试剂三(μl)
试剂四(μl)
试剂五(μl)
试剂六(μl)
样本(μl)
100
混匀,37℃水浴准确反应10分钟后,按表1.2操作。
注:
A管为对照管;
B管为Na+k+—ATP酶管;
C管为Mg++—ATP酶管;
D管为Ca++—ATP酶管;
E管为Ca++Mg++—ATP酶管。
表1.2加样顺序及用量
试剂七(μl)
混匀,离心4000转/分×
10分钟。
1.7定磷
离心完毕后,按表1.3操作
表1.3加样顺序及用量
管号
标准管
1μmol/ml标准磷应用液(μl)
上清液
(μl)
定磷剂
2000
混匀,45℃水浴20分钟,冷却至室温,在660nm处,1cm光径,蒸馏水调零比色。
1.8测试原理及计算公式
测定原理:
ATP酶可分解ATP生成ADP及无机磷,测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。
规定每小时每毫克组织蛋白分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位,既μmolPi/mgprot/hour
计算公式:
ATPase活力=
×
标准管浓度×
反应体系中样本稀释倍数×
6÷
蛋白含量
式中标准管浓度单位为1μmol/ml;
蛋白含量单位为mgprot/ml
1.9统计学处理
数据以均数±
标准差表示,各组间比较采用SPSSl1.0统计软件进行单因素方差分析,各组间的两两比较采用LSD法(最小显著差法)进行统计。
用Excel软件绘图。
2实验结果
2.1各个温度下A、B、C、D、E及标管的吸光度平均值与标准差
见表2.1
表2.1四个温度下各管吸光度
9℃(常温)
15℃
19℃
22℃
A管
0.141
0.060
0.094
0.058
0.143
0.146
0.171
B管
0.286
0.062
0.872
0.476
0.328
0.228
0.157
0.068
C管
0.296
0.130
0.194
0.098
0.273
0.195
0.175
0.090
D管
0.314
0.128
0.218
0.038
0.257
0.127
0.227
0.050
E管
0.317
0.101
0.869
0.621
0.400
0.245
0.233
0.063
0.507
0.042
0.551
0.113
0.576
0.124
0.419
0.019
常温下测的水温为9℃。
为了增加实验的准确性和可判断性,笔者在此实验外额外增加了一个实验:
极性测试,既把在常温下养殖的罗非鱼取出,放于0℃环境中,隔3小时取一批,每批8条鱼,共两批,以此来进行测定,所得数据见表2.2。
表2.2极性测试数据
第一批
第二批
0.121
0.030
0.061
0.027
0.018
0.187
0.052
0.275
0.051
0.211
0.033
0.260
0.024
0.212
0.299
0.097
0.460
2.2各个温度Na+-K+-ATPase活性变化
表2.21显示,Na+-K+-ATPase活性在15℃时活性最高,显著高于其他3个温度,而9℃于19℃活性差异小,22℃时活性最低,不足15℃时的2%。
该表可以看出,该品种的罗非鱼在15℃时Na+-K+-ATPase活性最高,温度升高或者降低都将会使Na+-K+-ATPase活性降低
表2.22显示,极性测试中第一批和第二批罗非鱼肝脏的Na+-K+-ATPase活性在温度如此低的情况下并没有多大变化,或者是急剧降低,和表2.21中9℃时Na+-K+-ATPase活性相比,降低的并不明显。
说明温度降低时Na+-K+-ATPase活性会下降,但会稳定在一个水平上。
表2.21四个温度下Na+-K+-ATPase活性变化
Na+-K+-ATPase
171.5
847.2
192.7
15.8
表2.22极性实验中前后两批Na+-K+-ATPase活性变化
第一批
139.5
164.3
第一批鱼刚从常温中取出,温度低于但接近9℃,而第二批时温度接近0℃。
2.3各个温度Mg++-ATPase活性变化
表2.31显示,Mg++-ATPase活性在9℃时最高,在15℃时有所下降,在19℃时有有所上升,而在22℃时又下降,切降至四个温度最低。
Mg++-ATPase活性成波浪线状态。
表2.32显示,极性测试中,第一批和第二批罗非鱼肝脏的Mg++-ATPase活性相差不大,与表2.31中9℃相比,Mg++-ATPase活性有些许的提升。
表2.31与表2.32对比可以看出Mg++-ATPase活性在一定温度范围内才会有波动,当温度下降到更低是,并没有直线下降,而是稳定在一个挺高的水平。
表2.31四个温度下Mg++-ATPase活性变化
Mg++-ATPase
183.3
108.9
135.5
41.5
表2.32极性实验中前后两批Mg++-ATPase活性变化
200.8
195.6
2.4各个温度Ca++-ATPase活性变化
表2.41显示,Ca++-ATPase活性在9℃时最高,当温度上升时Ca++-ATPase活性会降低,但表中15℃,19℃,22℃三个温度的Ca++-ATPase活性差异小,说明Ca++-ATPase活性在9℃左右温度下活性达到最大,当温度上升时,会使活性降低,最后稳定在一个水平。
表2.42显示,第一批的Ca++-ATPase活性比第二批的Ca++-ATPase活性略低,与表2.41中9℃相比,随着温度的下降,Ca++-ATPase活性先是有所降低,然后又回升。
表2.41四个温度下Ca++-ATPase活性变化
Ca++-ATPase
204.7
103.5
118.8
116.0
表2.42极性实验中前后两批Ca++-ATPase活性变化
181.3
196.9
2.5各个温度Ca++Mg++-ATPase活性变化
表2.51显示,Ca++Mg++-ATPase活性在15℃时活性最高,随着温度的上升或下降,Ca++Mg++-ATPase活性都会降低,9℃与19℃时的Ca++Mg++-ATPase活性接近,22℃时的Ca++Mg++-ATPase活性最低。
表2.52显示,第一批Ca++Mg++-ATPase活性比第二批Ca++Mg++-ATPase活性要略高,与表2.51中9℃相比,随着温度降低,Ca++Mg++-ATPase活性先是有所上升,然后又有所下降。
表2.51四个温度下Ca++Mg++-ATPase活性变化
Ca++Mg++-ATPase
208.3
844.0
267.8
124.6
表2.52极性实验中前后两批Ca++Mg++-ATPase活性变化
233.1
3讨论
将实验结果的数据综合在一起,以15℃为中轴,列一个活性升降表,表3.11。
表3.11各个温度间ATPase活性升降对比表
极性第二批
极性第一批
上升(24.8)
下降(32)
下降(675.7)
Na+-K+-ATPase(847.2)
下降(650)
下降(176.9)
下降(36.2)
下降(635.7)
Ca++Mg++-ATPase(844)
下降(576.2)
下降(143.2)
上升(15.6)
下降(23.4)
上升(101.2)
Ca++-ATPase(103.5)
上升(15.3)
下降(2.8)
下降(5.2)
上升(17.5)
上升(74.4)
Mg++-ATPase(108.9)
上升(26.6)
下降(94)
注1:
表中15℃下括号中数字为该ATPase在15℃时的活性,而其他温度下括号中数字为与以15℃为中轴方向的前一个温度的ATPase活性值之差
注2:
表中9℃为常温下所测水温,极性第一批鱼刚从常温中取出,温度低于但接近9℃,而极性第二批时温度接近0℃。
表3.11显示,Na+-K+-ATPase活性在15℃时非常高,当温度上升或者下降时Na+-K+-ATPase活性急剧下降;
Ca++Mg++-ATPase活性在15℃时也非常高,当温度上升或者下降时Ca++Mg++-ATPase活性也急剧下降,情况大体和Na+-K+-ATPase相似,而Ca++-ATPase活性和Mg++-ATPase活性在9℃时最高,温度再降低时,Ca++-ATPase活性和Mg++-ATPase活性都会有不同程度的下降,但是下降的幅度不大。
对此,笔者推测,罗非鱼不耐低温与Na+-K+-ATPase活性和Ca++Mg++-ATPase活性有比较大的关系,这两种ATPase活性的急剧降级也许是罗非鱼不耐低温的原因之一;
对比而言Ca++-ATPase活性和Mg++-ATPase活性在各个温度间的变化没有Na+-K+-ATPase活性和Ca++Mg++-ATPase活性那么的明显,对于罗非鱼不耐低温也许有影响,也许没有,还有待进一步研究。
罗非鱼的生存温度范围为15~35℃,最适宜生长温度为28~32℃,为什么会出现现在这种15℃Na+-K+-ATPase活性和Ca++Mg++-ATPase活性这么高,而温度上升下降活性都下降的情况,对此,笔者有两种推测:
第一种,本次实验鱼皆来自河南师范大学水产养殖基地,河南地处偏北地区,与罗非鱼家乡非洲相比,温度差太多,即使有温池加温,也不能达到罗非鱼所认为的最适温度28~32℃,代代相传,可能对温度的适应性有所改变,使得实验所用这批罗非鱼最适温度在15℃左右。
第二种,罗非鱼为变温动物,在15℃时,Na+-K+-ATPase和Ca++Mg++-ATPase两种活性程度,能够使罗非鱼在15℃的情况下生存,当Na+-K+-ATPase活性和Ca++Mg++-ATPase活性降低,若生存环境温度高,则在外界温度的影响下罗非鱼能生存,若生存环境温度低,而酶活性也低,所以罗非鱼不能在低温下生存。
参考文献
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[9]
致谢
在论文的准备和写作过程中,笔者得到了李学军老师和蔡玉臻等同学的悉心指导和热情帮助,在遇到问题时李老师和同学们不辞辛苦的讲解和帮助才使得我的论文顺利的进行。
从论文的选题到资料的搜集直至最后设计修改的整个过程中,花费了他们很多的宝贵时间和精力,在此向导师和同学们表示衷心地感谢!
导师严谨的治学态度,开拓进取的精神和高度的责任心都将使学生受益终生!
邢莽
2013年2月于河南师范大学
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