南疆鸡群感染H9N2亚型AIV诊断分析Word文档格式.docx
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基金项目:
国家自然科学基金(编号:
31460655);
华中农业大学塔里木大学科研联合基金(编号:
HNTDLH1404);
新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室开放课题(编号:
HS2014011);
新疆生产建设兵团博士资金(编号:
2012BB023);
塔里木大学高教研究项目(编号:
TDGJ1409);
国家大学生创新创业训练计划(编号:
20140757023)。
作者简介:
刘永宏,男,内蒙古呼和浩特人,博士,研究方向为传染病与免疫病理学。
E-mail:
lyhdky@。
通信作者:
赵丽。
流感病毒(influenzavirus,IV)是正黏病毒科流感病毒属成员,根据病毒粒子中NP和M蛋白的抗原差异,分为甲(A)、乙(B)和丙(C)3型,其中A型流感病毒的抗原变异性最强,常引起世界性大流行。
A型流感病毒基因组为8个分节段负链RNA,编码12~13种病毒蛋白。
A型流感病毒根据2种表面蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)的抗原性特点分为不同的亚型,已证明有16个HA亚型和9个NA亚型[1-5]。
HA和NA基因可作为RT-PCR方法的靶序列基因,用于AIV的亚型鉴别。
1966年Homme等分离到第1株H9N2亚型AIV[6],此后H9N2亚型AIV在世界各地广泛流行。
1988年,香港在亚洲范围内第1次从陆禽中分离到3株H9N2亚型AIV[7]。
1994年陈伯伦等分离到中国第1株H9N2亚型AIV[8],后来发现H9N2亚型AIV在我国各地普遍存在,2009年新疆报道从野生灰雁中分离到H9N2亚型AIV[9],新疆也报道了个体养殖户麻花鸡感染H9亚型AIV[10]。
H9N2亚型AI多呈低致病性感染,但由于分布广泛且呈蔓延之势,有重组为强毒的可能性,因此给养禽业造成的威胁不容忽视。
本研究对南疆发病疑似H9N2亚型AIV感染鸡组织病料,进行RT-PCR扩增HA和NA基因部分片段,并测序确定其亚型。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病料6份病鸡组织病料,来自2013年南疆地区2个鸡场,-20℃保存备用。
1.1.2主要试剂TrizolinvitrogenTM(编码.:
15596-026),购自Invitrogen生物工程有限公司;
TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0(编码.:
DRR019A),PremixTaqVersion2.0(编码.:
D331A)和DNAMarker2000,购自宝生物工程(大连)有限公司;
TIANgelMidiPurificationKit(编码.:
DP209),购自天根生化科技(北京)有限公司等。
1.1.3引物按照引物设计原则,利用PrimerPremier5.0分子生物学软件,以GenBank数据库中国内外已发表的H9N2亚型AIV的HA和NA基因全序列为参照设计特异性引物。
引物序列为HA:
5′-TGCAACAAATCTGGGACA-3′,5′-AGGCGACAGTCGAATAAA-3′;
NA:
5′-TTGCGACAA-TATGTTTCC-3′,5′-GCTATTTGAAGTCCACCAC-3′。
引物由生工生物工程(上海)有限公司合成,预期大小约为1420、1270bp。
1.1.4仪器PCR仪:
TC-5000,比比科技有限公司;
小型高速冷冻离心机:
R134a,密封式制冷系统;
电泳仪:
DYY-12,北京市六一仪器厂;
紫外分析仪:
JY02S,北京君意东方电泳仪设备有限公司等。
1.2方法
1.2.1总RNA提取从病鸡组织病料中提取总RNA,按TrizolinvitrogenTM试剂盒说明书操作。
1.2.2RT-PCR反应总RNA按照TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0试剂盒,利用已设计的特异性引物,进行一步法扩增HA或NA基因片段,退火温度均为51℃。
cDNA同时加HA和NA特异性引物,作为阴性对照。
1.2.3PCR产物纯化回收取HA或NA基因片段RT-PCR扩增产物电泳切胶后,按照TIANgelMidiPurificationKit试剂盒说明进行回收纯化。
1.2.4测序将纯化产物标记后送生工生物工程(上海)有限公司测序,测序引物为HA或NA基因扩增引物。
1.2.5序列分析利用BLAST在线平台分析与本研究获得的HA或NA基因片段同源性较高的序列,判断本研究毒株的亚型。
2结果与分析
2.1AIVHA和NA基因片段RT-PCR扩增结果
本研究的6例样品,根据HA和NA特异性引物RT-PCR扩增相应基因片段,结果均为阳性,2个片段产物均与预期扩增长度一致,阴性对照成立(图1)。
2.2BLAST在线比对结果
本研究将6例样品经RT-PCR、胶回收纯化和测序得到HA和NA部分基因序列,利用BLAST在线平台分析,在线结果显示,与其同源性由高到低的100个序列均为H9或N2。
3结论与讨论
禽流感分为高致病性禽流感和低致病性禽流感。
高致病性禽流感主要由H5或H7亚型AIV引起,发病率和病死率均高,全球对其高度重视。
另外,全球人感染H5N1亚型AIV病例至少649例,死亡385例,病死率达到59.32%[11]。
2013年,中国十几个城市百余人感染H7N9亚型AIV,死亡40余人,研究表明,H7N9流感病毒能够发生有限的人传人[12]。
因此,全球对高致病性禽流感更加重视。
低致病性禽流感往往致死率较低,表现为轻度呼吸道症状和产蛋率下降等,而未被重视。
对养禽业危害最严重的低致病性禽流感亚型主要为H9N2,1996―2000年,中国H9N2亚型AI的发病率占AI总发病率的93.89%[13]。
1999年以来,H9N2亚型AIV感染人事件的多次发生,严重威胁了世界公共卫生[14]。
另外,AIV变异性较强较快,当2种低致病性毒株同时感染鸡,可能会发生毒株变异和重组,产生强毒株,导致鸡群遭受严重损伤。
因此,H9N2亚型AI应该被高度重视。
目前,中国对禽流感的防制措施主要是疫苗接种,但现在不同公司选用的H9N2亚型疫苗株不同,导致疫苗株繁多,某些地区不清楚当地流行株是什么,不清楚选用哪个毒株预防效果最好,且免疫程序混乱。
此外,养殖户对禽流感,尤其低致病性禽流感认识不够,防疫意识不够,对免疫监测更是一无所知。
所以,导致H9N2亚型AI在国内控制效果一直不能令人满意。
2009―2010年,在新疆部分地区蛋鸡、肉鸡、家养水禽的养殖场,H9免疫抗体合格率为62.4%~100.0%,20%~33%蛋鸡场存在100%的零效价现象,活禽市场H9抗体合格率为21.70%~67.14%[15]。
2013年,发现新疆和田县未免疫H9疫苗养殖户HI抗体感染率为35.29%,意味着和田县存在H9亚型禽流感发病的风险[16]。
2009―2011年,新疆野鸟检出了禽流感H1~H16全部亚型,不同野鸟各亚型检出率不同,其中野鸭类H9检出率最高[17]。
野鸟带毒却很少发病或死亡,往往成为重要的病原携带者,随着候鸟的迁徙,与留鸟及家禽的接触,而将疫情进一步扩散。
因此,AI的暴发流行除了与禽及禽产品贸易流通因素有关之外,野生鸟类被认为是最有可能的传染来源之一。
研究结果表明,湿地和水栖野鸟,如雁形目和?
a形目是AIV主要的天然储存者[17]。
新疆湿地资源丰富,每年数以万计的迁徙性鸟类途径新疆,并在南北疆地区栖息和繁殖。
因此,野生鸟类的迁徙对新疆地区乃至我国AI的防控造成潜在的威胁和巨大的压力。
1994年,新疆石河子报道了国内外首次从鸡中分离出的H14亚型禽流感分离株[18],证实了新疆AIV毒株的丰富。
近年来,不同动物流感病毒跨越种间屏障感染的报道越来越多,目前已经从多种家禽,如水禽、猪、马、狗、猫科动物、海洋哺乳动物以及人类中分离到AIV。
猪是AIV“禽―猪―人”传播链的重要中间宿主。
2009―2011年,新疆报道猪、狗H9亚型抗体阳性[19],加之猪、狗与人类的密切关系,这无疑对新疆地区流感的防控构成一定的潜在威胁,对流感的发生与流行发出了重要的预警。
禽流感对新疆乃至中国潜在威胁巨大,提醒相关人群应足够重视该病的防控[20-21]。
本研究根据流行病学调查、临床症状检查和病鸡剖检,疑似南疆2个鸡场鸡群感染低致病性禽流感。
影响我国养禽业的低致病性AIV主要为H9N2亚型,针对已发表的H9N2亚型AIV毒株序列,设计扩增HA和NA基因部分片段的特异性引物,并将扩增产物纯化测序分析。
本研究所得的HA基因片段序列,经BLAST在线分析,与其同源性由高到低的100个序列,均为H9亚型;
本研究所得的NA基因片段序列,经BLAST在线分析,与其同源性由高到低的100个序列,均为N2亚型。
研究结果表明,2个鸡场鸡均感染H9N2亚型AIV。
虽然2个鸡场常年发生类似症状疾病,但附近相似饲养管理、饲养技术、饲养环境和免疫标准条件下饲养的和田黑鸡,通过多次试验并未检出感染H9N2亚型AIV。
和田黑鸡是否具有H9N2亚型AIV抗性,需要进一步观察研究,如果研究证实,和田黑鸡可能会成为抗AIV研究的良好材料。
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