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酶切缓冲液1.5ml
无菌重蒸水8.5ml
总体积15ml
DNA琼脂糖凝胶电泳
1.用1×
TAE–buffer配制0.7%的琼脂糖凝胶,在微波炉中加热至琼脂糖溶解。
2.待溶液冷却至60℃左右,加入溴化乙锭(用水配1mg/ml贮存液)至最终浓度为0.5mg/ml,充分混匀。
3.用透明胶封固玻璃板两头,在距底板0.5-1.0mm的位置上放置梳子,将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中,凝胶厚度
在3-5mm之间。
4.在凝胶完全凝固后,撕去透明胶,小心地将玻璃板移至装有1×
TAE-buffer的电泳槽中,轻轻地拔去梳子,且使
缓冲液没过胶面约1mm。
5.DNA样品与溴酚蓝混合后,用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中。
6.盖上电泳槽并通电,使DNA向阳极(红线)移动。
采用100V电压进行电泳。
7.当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后(约半小时),切断电流,取出玻璃板,在紫外灯下观查凝胶。
50×
TAE-buffer
Tris242g/l
冰醋酸57.1ml/l
EDTA0.4g/l
DIG分子杂交
I.DNA转移和固定
1.大肠杆菌染色体DNA(各1-2mg)分别用BamHI、EcoRI、PstI、HindIII酶切,电泳。
2.电泳拍照(胶边摆放尺以用于杂交阳性条带的定位),搭建转移台,在盛有0.4NNaOH的容器中依次摆放支架、玻板、普通滤纸、塑料薄膜(剪掉比凝胶尺寸略小一号的一块)、凝胶、尼龙薄膜和卷筒纸及500克重物,放置过夜。
注:
在摆放过程中要防止气泡的产生
3.次日取出尼龙膜,在槽口处用圆珠笔标记后,在6×
SSC中洗涤30s,放于牛皮纸上,于80℃烘2h,放入保鲜膜内于–20℃存放或立即杂交。
II.oligonucleotidetailing
1.用无菌水溶解oligonucleotide至适当浓度。
2.在插入冰中的管中混合:
oligonucleotide100pmol
反应缓冲液(vial1)4ml
CoCl2溶液(vial2)4ml
DIG-dUTP溶液(vial3)1ml
dATP溶液(vial4)1ml
TdT(50units)(vial5)1ml
加无菌水至终体积20ml。
3.37℃保温15min,然后置于冰中,加入2ml糖原溶液(1mlvial9+200ml0.2MEDTA,pH8.0)。
4.终止标记反应后,加入2.5ml4MLiCl,75ml乙醇(-20℃预冷),沉淀oligonucleotide。
5.至少在-70℃放置30分钟或-20℃放置2h,15000转/分离心20min。
6.沉淀用50ml70%乙醇洗涤、晾干,用适当体积的无菌水溶解,保存于-20℃。
III.预杂交和杂交
1.把尼龙膜放入杂交管中,按20ml/100cm2加入预杂交液,于杂交炉中68℃保温至少1h。
2.将DIG标记的DNA探针(5~25ng/ml)煮沸10min,迅速插入盐冰中变性。
3.弃此预杂交液,按2.5ml/100cm2膜加入含5-25ng/ml标记探针的杂交液。
4.膜在杂交温度保温6-16hr。
5.在杂交温度洗涤:
a至少50ml/100cm22×
SSC,SDS,0.1%(w/v)5min2次
b0.1×
6.膜可立即检测或晾干后保存。
IV.免疫检测
1.杂交后严格洗涤,把膜直接浸入Washingbuffer中1-5min。
2.在100mlBlockingsolution(1×
conc)放置30min。
3.用BlockingSolution(1×
Conc把anti-DIG-APconjugate稀释至150mU/ml,50ml中有10mlanti-DIG-APconjugate)。
4.膜在50ml抗体溶液中放置30min。
5.100mlWashingbuffer洗膜15min×
2次。
6.膜在20mlDetectionbuffer中平衡2-5min。
7.膜在新配的10mlColor-substratesolution中放置5min(置于黑暗中),注意在显色过程中不要摇动。
8.几分钟后有色物质开始生成,反应一般在16h后达到完全。
9.颜色达到一定强度后,可用50mlH2O洗膜5min来终止反应。
10.结果拍照保留。
20×
SSC
NaCl3mol/l
Na-citrate0.3mol/lpH7.0
Buffer1
Maleicacid0.1mol/l
NaCl0.15mol/lpH7.5用固体NaOH调节
10×
Blocking
Blockingreagent10%溶于Buffer1,灭菌后存于4℃
杂交Buffer用于寡核苷酸探针的杂交
5×
Blockingreagent1%使用前加入polyA(vial11)
N-lauroylsarkosine0.1%终浓度为0.1mg/ml
SDS0.02%
2×
预杂交液用于DNA片段探针的杂交
12×
SSC使用时加入SDS,终浓度为0.5%
Denhardts试剂
鲑鱼精子DNA碎片200mg/ml
WashingBuffer
Tween200.3%加入Buffer1中
Detectionbuffer
Tris-HCl0.1mol/l显色中每10ml加入200µ
l
NaCl0.1mol/lNBT/BCIPstocksolution
MgCl250mmol/l
pH9.5
PCR法体外扩增phoA(碱性磷酸单脂酶基因)
1.按如下体积加入各反应物:
总体积50ml
ddH2O20.5ml
buffer5ml
Mg2+(2.5mM)5ml
dNTP(2.5mM)4ml
Primer1(10pmol/ml)10ml
Primer2(10pmol/ml)10ml
染色体DNA(约100ng/ml)5ml
Taq酶(5U/ml)0.5ml
2.充分混匀后按下列条件进行反应:
97℃ 5min
95℃ 30s
57℃ 1min30个循环
72℃ 2min
72℃ 10min
4℃ ∞
3.取50%采用琼脂糖凝胶电泳检查产物情况,扩增产物集中于1.5kb片段的位置附近,割下该位置的凝胶进行外源DNA的回收。
4.回收的PCR扩增产物直接与pMD18-T载体连接,连接反应如下:
SolutionIPMD18-TPCR产物∑
5ml1ml4ml10ml
5.16℃连接1h以上,用于转化。
DNA的琼脂糖凝胶回收
1.用手术刀在DNA紫外检测仪下切割下含有所要DNA片段的凝胶块置于Eppendorf管中,加入100ml重蒸水。
2.用牙签将凝胶块尽量捣碎,剪去管的上部,用烧红的针头在管底扎几个微孔,孔径越细越好。
3.将管套入另一个Eppendorf管中,常温下,15000rpm离心10分钟。
4.将上清液吸到收集管中,向沉淀中加入100ml重蒸水。
5.重复步骤
(2)、(3)、(4)各一次,见图。
6.收集的上清液加入0.1V的KAc(PH5.5,3M)和2.0-2.5V的无水乙醇,充分混匀后-20℃放置30min,取
出15000rpm,4℃离心30min。
7.弃上清,加入400ml70%的乙醇,15000rpm,4℃离心5min。
8.弃上清,沉淀凉干后用20mlddH2O溶解待用。
大肠杆菌感受态细胞的制备
1.用牙签挑取少许宿主菌保藏液稀释划线于LB固体培养基上,37℃下隔夜培养。
2.挑取单菌落接种于30mlLB液体培养基中,37℃下隔夜培养。
3.按1%的接种量将大肠杆菌菌液接种于30mlLB培养基中。
4.在37℃的水浴摇床中培养1.5小时,OD600接近0.5。
5.4℃,6000rpm离心10分钟收获菌体。
6.上述得到的菌体沉淀用10ml的10mmol/LCaCl2(冰冻)悬浮,4℃,6000rpm离心10分钟。
7.弃上清,将沉淀用1ml的75mmol/lCaCl2(冰冻)重新悬浮并转入无菌Eppendorf管中。
8.冰水浴中放置8h即可使用。
大肠杆菌的转化
1.取一管已制备好的大肠杆菌感受态细胞置于冰水浴中。
2.吸取90ml感受态细胞悬浮液至无菌Eppendorf管中,加入10mlDNA溶液,轻轻混匀,在冰水浴中放置30分钟。
3.42℃水浴中脉冲2分钟,快速转移至冰水浴中,加入900mlLB培养基,37℃水浴摇床培养1-1.5小时。
4.吸取100ml已转化的感受态细胞涂布于100mg/mlAp和40mg/mlX-gal的LB平板上。
5.37℃下倒置培养12-16小时,挑选单菌落划线扩增培养。
沸水浴法快抽大肠杆菌质粒DNA
1.在Eppendorf管中加入110ml的STET(使用前加入溶菌酶至终浓度为5mg/ml)溶液,挑入米粒大小的菌团,充
分悬浮并混匀。
2.上述菌体悬浮液沸水煮30秒。
3.迅速放置于常温下15000rpm离心15分钟。
4.用牙签挑去菌体碎片(白色沉淀),在上清液中加入100ml的异丙醇,充分混匀后4℃,15000rpm离心20分钟。
5.弃上清液,加入70%冰乙醇400ml,4℃,15000rpm离心5分钟。
6.沉淀凉干后用50ml无菌重蒸水溶解。
7.取5ml电泳检测。
STET:
蔗糖8%
TritonX-1005%
Tris-HCl(PH8.0)50mM
EDTA(PH8.0)50mM
碱溶法制备大肠杆菌质粒DNA
1.1.5ml培养物6000rpm,4℃离心10分钟,弃去上清液。
2.加入100ml溶液I悬浮菌体,室温放置5分钟。
3.加入200ml溶液II,立即轻轻混匀,室温放置至溶液几乎澄清。
4.加入150ml溶液III,轻轻混匀,冰浴30分钟。
5.4℃,15000rpm离心20分钟,收集上清液。
6.上清液中加入等体积的苯酚饱和溶液(400ml)氯仿,充分混匀,4℃,15000rpm离心20分钟,将上清液转移至另一离心管。
7.在上清液中加入400ml氯仿溶液,混匀,10000rpm离心10分钟,将上清液转移至另一离心管。
8.在上清液中加入400ml异丙醇,–20℃放置30分钟,4℃,15000rpm离心20分钟。
9.用400ml75%的冰乙醇洗涤一次,凉干。
10.加入50ml无菌重蒸水溶解质粒DNA。
11.取2ml作酶切电泳检查。
溶液I
D-Glucose50mmol/L
Tris-HCl(pH8.0)50mmol/L
EDTA(pH8.0)10mmol/L
121℃消毒20分钟,使用时加入溶菌酶,终浓为5mg/ml
溶液II
SDS1%
NaOH0.2mol/L
溶液III
KAc(pH5.5)3mol/L
工程菌发酵
1.挑取少量pET11a-phoA/BL21(DE3)菌体接种于含Ap(终浓度100mg/ml)的30mlLB液体培养基中,于37℃培养过夜;
以相同条件接种pET11a/BL21(DE3)为对照。
2.以1%的接种量将上述一级培养物接种于含Ap(终浓度100mg/ml)的100mlLB液体培养基中,恒温培养2h后(OD600约为0.5),加入诱导剂IPTG终浓度1mM,继续37℃培养。
3.诱导后培养3h后收集菌体,4℃,6000rpm离心10min,弃上清液,菌体沉淀置于-20℃保存待用。
细胞裂解
1.以5ml碳酸钠-碳酸氢钠重新悬浮菌体沉淀,冰浴超声裂解细胞。
2.超声波裂解液于4℃,15000rpm离心30min,取上清液待用。
碳酸钠-碳酸氢钠溶液(0.1M,PH10.0)
Na2CO31.06%
NaHCO30.84%
碱性磷酸单酯酶的活力测定
1.以下列体系进行酶活测定的反应:
反应体系NPPBuffer酶液NaOH(0.5M)
3.0ml0.6ml1.2-XX1.2
2.底物NPP加入Buffer(碳酸钠-碳酸氢钠溶液)后,底物与酶分别于37℃预热3-5min,然后混合37℃保温30min,加入NaOH终止反应。
3.参比管预热后先加入NaOH再加入酶保温。
4.上述测活反应液与405nm测定吸收值。
SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.安装玻璃板并确定所需凝胶溶液体积。
2.迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液约4.5ml,并于其上覆盖一层水。
3.分离胶聚合完全后(约20min),倾出覆盖液体。
4.在分离胶上层直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入梳子,避免产生气泡。
5.用LoadingBuffer处理样品菌体,在100℃加热5min左右,使蛋白质变性。
6.浓缩胶聚合后小心移出梳子,用无菌水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胶后,按顺序加样。
7.接通电泳装置,凝胶上所加电压为8V/cm,当染料前沿进入分离胶后,电压提高到15V/cm,继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。
8.卸下玻璃板,标记凝胶加样方位,用考马斯亮蓝染色液(StainingBuffer)对凝胶进行染色,至少1h以上。
9.移出凝胶,回收染色液,用DestainingBuffer进行脱色1-2小时,其间应更换脱色液三四次。
10.凝胶保存于水中,或把凝胶干燥成胶片保存。
5×
SDS-PAGEBufferSDS-PAGE电泳缓冲液,用时稀释5倍
Tris15.1g/l
甘氨酸94g/l
SDS(10%)50ml/l
SDS-PAGE分离胶(10ml)浓缩胶(5ml)
H2O3.7ml3.3ml
Acryl-bis(3.3c)3.6ml0.91ml
Tris-HCl2.5ml(1.5M,pH8.8)0.63ml(1.0M,pH6.8)
SDS(10%)0.1ml0.05ml
过硫酸铵(10%)0.1ml0.05ml
TEMED4ml5ml
2×
LoadingBuffer
Tris-HCl100mM
SDS4%
溴酚蓝0.2%
甘油20%
SDS-PAGEStainingBufferDestainingBuffer
乙醇30%30%
乙酸10%10%
水60%60%
考马斯亮蓝0.25-0.5%
碱性磷酸单酯酶提取
试剂:
50mmol/LTris-HCl(pH7.0)
pH7.60.5mol/LTris-HCl
实验步骤:
1.将诱导表达的碱性磷酸酶的菌液以5000rpm离心15min,收集菌体;
2.将收集的菌体以10mL/g湿菌体的比例,用50mmol/LTris-HCl(pH7.0)悬浮,再用超声波破膜;
3.菌裂解液于4℃,15000rpm离心20min,取上清液。
4.上清液加入NaCl至终浓度为0.8mol/L,70℃水浴30min,12000rpm离心10min,丢弃沉淀;
5.上清液于0℃边搅拌边加入固体硫酸铵至60%饱和度,静置2-4h,12000rpm离心20min,弃上清液。
沉淀用1/10体积的pH7.60.5mol/LTris-HCl缓冲液溶解,于4℃对相同缓冲液透折。
直至透析袋内外平衡。
透析好的样品进行离子交换柱层析。
包涵体中碱性磷酸单酯酶提取
50mmol/LTris-HClpH8.0
3mol/L脲(0.1mol/Tris-HClpH8.0)
TE缓冲液
0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽
4mmol/L还原型谷胱甘肽溶液
1.将诱导表达的碱性磷酸酶的菌液以5000rpm离心15min,收集菌体;
2.约每克湿菌加3ml的量悬浮于50mmol/LTris-HClpH8.0,含1mmol/LEDTA的缓冲液中进行超声破碎;
3.超声破菌后1200rpm,4℃离心30min进行固液分离,用TE缓冲液反复洗涤除去可溶性杂蛋白,核酸及外加溶质等;
4.用9倍量的变性剂3mol/L脲(0.1mol/Tris-HClpH8.0)和0.5%TrtonX-100的TE缓冲液分别洗涤;
5.将包涵体溶于变性液50mmol/LTris-HCl,1mmol/LLEDTA,8mmol/L脲(pH8.0),12000rpm离心30min;
6.取上清液,在0.25mmol/L氧化型谷胱甘肽和2mmol/L还原型谷胱甘肽溶液中,4℃透析过夜;
透析液浓缩备用。
临用前加相应缓冲液至一定体积。
离子交换柱层析纯化碱性磷酸单酯酶
试剂DEAE-纤维素32
0.02mol/L对硝基酚磷酸二钠
pH7.60.5MTris-HCl缓冲液
pH7.60.5MTris-HCl(内含0.3NNaCl)缓冲液
pH10.00.1MNa2CO3-NaHCO3的底物缓冲液
I.DEAE-纤维素预处理
1.称取5克DE-32,于小烧杯中,加入75毫升0.5mol/LHCl的烧杯中,于室温轻轻搅拌30分钟。
2.将糊状物移入布氏漏斗中,用蒸馏水淋洗并浸泡5分钟,不时轻轻搅拌,抽滤。
如此重复,每加一次去离子水,浸泡一段时间,再进行抽滤,至洗涤液pH等于4。
3.将糊状物移入烧杯中,加入75毫升0.5mol/LNaOH,于室温轻轻搅拌30分钟后,将交换剂移入布氏漏斗中,反复用去离子水淋洗、抽滤,直至洗涤液pH为8,抽干。
4.将DEAE-纤维素移入烧杯中,浸泡在150毫升去离子水中。
用0.5mol/LHCl把pH调至7.6左右(可在pH计上进行或用pH试纸调试),须使悬液最终pH在10分钟内无变化,然后抽滤。
5.将上述滤块置于100毫升烧杯中,加入75毫升pH7.60.5mol/LTris-HCl缓冲液轻轻搅拌之后,静置20分钟,用倾斜法除去上清液中细微粒子,如此重复若干次,最后上清液pH值与缓冲液几乎一致。
6.将含有1倍体积pH7.60.5mol/LTris-HCl缓冲液的DEAE-纤维素浆液含放在抽滤瓶中减压除尽气泡。
备用。
II.装柱
1.层析柱(1.0×
20cm)清洗后,用去离子水洗涤一遍。
柱的下端联接好流出液引导塑料管,塑料管末端接上小乳胶管,在乳胶管上装上螺旋夹。
2.关紧螺旋夹。
柱内装入适量的pH7.60.5MTris-HCl缓冲液,微开螺旋夹。
让缓冲液缓慢流出,赶走层析柱的流出液引导塑料管内的气泡,柱中仍保留少量缓冲液,关紧螺旋夹。
3.将减压除尽气泡的DE
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