WB方法经验总结Word格式.docx

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常规煮样时间3-5min，样品过浓时就煮10min；

2.如果10min煮样后，仍然吸不起来，才适当增加SDSLB，继续煮；

也可以对样品进行超声。

煮样时间若过长，蛋白会凝固，此时以失去继续WB的意义，请丢弃（判断标准：

出现明显的蛋白沉淀和水分层）

此方法的缺点，SDSLB煮过的样品如果用来做IP，需要特殊方法，因此，这种制备方法制备的样品有使用局限。

非变性裂解法（不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了，其实类似）

裂解细胞请尽量冰上操作，减缓酶解作用。

俺前bossnature文章上的裂解液配方是：

20mMTris/HCl,pH7.6,100mMNaCl,20mMKCl,1.5mMMgCl2,0.5%NP-40andproteaseinhibitors（20μg/mlleupeptin,10μg/mlpepstatinAand10μg/mlaprotinin）（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵，其实用0.5mMPMSF替代这三种就好了；

如果还要做磷酸化蛋白，加1mMNa3VO4（现加现用），10mMNaF,1mMNa3VO4,50mMbeta-GP。

此方法的优点：

NaCl浓度略低于生理状态，保证裂解细胞的方式较为温和，便于随后的IP等试验。

其他Na盐浓度的细胞裂解液也很常见，诸如0.15M（生理盐浓度）、0.3M、0.6M（高盐系列，裂解细胞时染色体会析出，细胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；

0.3M及以下适合IP试验，0.6M及以上适合纯化蛋白，尤其相互作用较强的复合体，要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用极端的高盐裂解细胞。

用于核蛋白的裂解的原因是0.5%NP-40，用于破坏核膜结构；

可用到1%，但此时染色体会析出，沉淀粘稠。

组织块裂解：

组织块较大用匀浆的方法最合适，现在有不少转头很小的匀浆器。

当组织超微量的时候，比如50mg新鲜癌组织，我采用的方法是

1.低温（剪）搅碎，成肉糜状。

2.锡箔纸包裹好，放入少量液氮，快速敲击（控制力量，尽量避免弄破锡箔纸），进一步破碎；

反复多次。

3.用上述细胞裂解液回收。

分泌型蛋白富集：

用无血清培养基培养细胞，收集上清液用于WB检测；

如果含量过低，需要用TCA沉淀富集。

理论上，从普通培养基中收集分泌蛋白，此时对细胞生长条件的影响最小，是最佳的实验条件；

但是这存在隐忧。

因为含血清的培养基中含有非常丰富的BSA（牛血清白蛋白）之类的蛋白质，除非你进一步分离纯化，否则直接用这种样品去WB会有非常大的麻烦，尤其当你的蛋白在60-46kDa之间的时候；

用“任何”抗体去检测这一区间的蛋白，会有一片非常强的信号。

因为此区间蛋白（主要是BSA）浓度过于富***非特异性粘附“任意”抗体，从而最终被识别。

同理，采用SDSLB裂解细胞制备样品前，通常要用PBS洗涤，其目的之一是去除培养基中的BSA。

采用无血清培养基收集细胞上清除了改变细胞的生理状态外（可能激活未知信号途径，诸如AKT等），还会出现的问题是：

1.即使采用了无血清收集上清，仍然有大量杂蛋白，但相对好很多。

2.选用了上清，由于蛋白浓度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。

a.TCA沉淀对半定量操作要求非常高，因为很容易沉淀不充分或者离心操作丢失，尤其在离心过程，离心管的摆放非常讲究，要180度翻转离心两次。

b。

重新溶解时，由于蛋白需要在一定的盐离子条件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的条件，相对麻烦。

实际上，如果你不是非常强调蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建议检测上清，尤其半定量的WB实验检测不同样品间的差异。

这里面有实验操作细节的麻烦——经验之谈，我曾经参与的cancercell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的数据是celllysis；

偶尔用到上清，也只是作为富集纯化该蛋白的原料，为进一步分析做准备。

样品制备完，应立即低温保存（-20度短期（几天）；

-80度长期；

例外，IP用样品应直接进行IP，避免冻融破坏蛋白质间弱的相互作用）。

SDSLB煮沸过的样品冻融会存在另一个问题，SDS沉淀；

SDS4度就会沉淀，何况-80度。

上样前应加热充分溶解，否则从加样口向下拖带（SDSLB不够，样品未充分溶解也会出现类似拖尾；

上样过大也会）。

在样品制备过程中，另一个需要注意的问题是，从样品制备的起始阶段就要注意定量问题；

WB本身系统误差有20%，太细微的差别经常忽略不计。

细胞样品可以先计数再接种，短时间内即使细胞生长有差异也不会对WB结果影响太多。

组织样品，从肿瘤组织的大小（称重）开始，裂解液的体积都是精确定量的，操作过程也尽量避免蛋白损失。

有人会说可以电泳前蛋白定量，我将下一节讨论蛋白定量的不科学性，以及裂解液成分对定量的干扰。

【补充1】：

细胞有凋亡或生长速率差异时，

有一个最直接的办法针对这个问题，实际上将细胞收集下来以后，经过离心，去除PBS，这时候你可以拿出事先准备好的标准体积去比对，误差小于50ul的（因为标准品差值可以设定为50ul）,所以基本上肉眼偏差至多只有10ul（细胞体积），这种小差别在WB结果中可以忽略不计。

其实标准品有多种好处，平时可以用于离心时平衡；

可以废物利用一些用过的effendorf管。

最好不要用纯水做标准品，我喜欢稀释一些SDSLB做标准品，因为有蓝黑色对比下，可以更精确估计体积。

这相对比测标准曲线，再一一读值还是快很多；

蛋白电泳：

电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。

经验之谈，8%胶最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa。

8%胶可以跑300KDa-36KDa之间的任意蛋白，转膜效率对WB结果的的影响都问题不大。

12%，180KDa左右，转膜效率对WB结果的影响都问题不大（300KDa蛋白如何，没有尝试过）。

电泳一般采用恒流，45mA-55mA（应根据电泳仪器适当调整，要注意仪器最高限压；

此条件适合gibcomodelV16型，胶宽20cm）。

采用恒流的优点，保证最快速度完成电泳（电压会逐渐增大），省时且减少扩散；

但是由于电泳速度过快时会发热而溶胶，所以你必须想办法散热。

散热不好，条带出现波浪状。

注意事项：

1．聚丙烯酰胺的30%母液会降解，要4度避光保存。

2．APS会失效，10%APS一般保质期才一个月左右。

-20度分装长期保存。

3．注意Trisbuff的PH值，以及平时所用的水的PH值。

PH值改变会使带型非常怪异，所有蛋白和溴酚蓝压成一条细线（即便在分离胶中），如果溴酚蓝前有红色染料，那么此染料彗星式拖尾从溴酚蓝一直延伸到胶底部（溴酚蓝此时涌动极缓慢，位于胶中上部）

4．上下层式电泳装置若漏液，哪边漏液，电泳条带往哪边倾斜。

内外式电泳装置漏液，则装置处于短路状态，液体会过热。

SDS-PAGE胶可能局部自溶，条带扭曲、变形。

5．配胶用玻璃板和边条应及时洗净。

玻板未洗净的坏处很多。

尽管玻璃看似平滑，但是一些细微的凹陷处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒（摸上去疙疙瘩瘩），其坏处是，在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。

如果是RNA的超薄胶，胶板的颗粒会导致局部巨大气泡，非常难于清除；

蛋白胶也会导致一些小气泡的产生。

玻板没洗净的另一个坏处是，由中学物理知识可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗净的玻板会削弱和胶体间的粘附力，拔梳子或边条时会产生微小的错动，胶体下部出现大量气泡（夹在玻板和胶之间，这个关系不大）；

严重的错动会使上样时，样品从胶和玻璃之间的间隙漏光，或者甚至胶和玻板分开。

为避免拔梳子时的错动，可在电泳缓冲液中拔梳子（比水更好，有SDS润滑）。

判断玻板是否洗干净，用手摸一下有没有疙疙瘩瘩的；

最好用洗洁精之类，洗衣粉、肥皂都不好用。

6．上样时，不要把tip深入胶孔过深（或者采用细的尖端拉长的专用上样枪头），可能会错开胶和玻板，样品会泄露。

7．未加样的孔应添加高浓度SDSLB平衡，否则最外侧条带会拉宽变形。

通常20ul样品（含5ul4*SDSLB），可用8-8.5ul4*SDSLB平衡。

同理，点marker的lane也要加入同样体积的LB。

LB若在室温放置太久和新鲜的在比重上会有差异，在新旧LB靠近的地方，条带会拉宽或挤压变形。

因此，同一块胶上，煮样及填空白所用LB应一致。

LB应-20度保存。

8．增加上样量不一定会提高荧光信号强度。

增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连，所有的蛋白条带都扭曲变形。

因为增加上样量最多只能提高几倍，而WB灵敏度是以10的几次幂量级的，所有目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集（可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰）。

增加上样量的另一个坏处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样WB条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭（一晃而灭）或者条带中空。

仍以6孔板80%以上汇合度为例，细胞裂解液和SDSLB通常都是投入200ul（最少80ul，这样面积的培养板如果裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到一致），而这种浓度条件下制备的样品，电泳时上样量要控制在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ul时内参基本已经开始粘连成一条线，带型出现波浪纹；

当然并非不可以多上样，再多对WB结果影响不大（没有的仍然没有），且条带都很丑。

9.不同样品上样时，可考虑将样品体积调成一致或类似。

如果一组IP样品和一组细胞裂解液样品，前者通常洗脱体积为15ul，刚好+5ul4*SDSLB达到常规20ul上样体积；

后者第8点提到只上5ul，同样+5ulSDSLB（比重同，不会互相挤压），最好补加10ulDDW使总体积一致。

通常这样不同条件获得的样品，中间最好用“空白”泳道隔开（空白仅指无蛋白，仍应加入8-8.5ul4*SDSLB），这样才能确保每条带都很美观。

10.SDSPAGE胶配好暂时不用时，需用电泳缓冲液灌满空间（拔去梳子和底边边条后的间隙），用保鲜膜包裹防止液体蒸发，短期室温或稍长期4度保存。

个人习惯为，灌好分离胶用饱和的正丁醇灌满上层，保鲜膜包裹，次日再灌堆积胶。

两种方案都可以。

所以如果预计次日工作量较大，可以提前灌好SDSPAGE。

样品是否一定需要定量再上样？

——不是的，这是浪费时间的一个操作。

我们首先来讨论一下蛋白定量的科学性。

蛋白定量首先需要一个参照系（标准蛋白），参照蛋白通常选择BSA，也就是说你所谓的定量是对应于BSA的浓度的一个参照值。

这里面存在一个问题，即忽略了蛋白折叠和空间构象对光吸收、折射的影响；

不同的蛋白折叠和构象还会影响颜料分子的嵌入。

因此你其实默认将所有的蛋白等同于BSA在溶液中的折叠状态、光吸收情况下，然后做出的一个相对判断，这就存在一个“系统误差”——还不算上测量误差等等，就已经很不准确了。

其次，裂解组织或细胞的时候，那些裂解液中，某些溶剂本身会使CoomassieG250或者Bradford法（实际也是Coomassie染色）显色，尤其是去污剂之类；

例如NP40，就会使Coomassie显蓝色，可以完全覆盖掉蛋白与Coomassie作用产生的蓝色。

因此，如果你的裂解液里面含有这类物质，所谓的蛋白定量实际是NP40颜色和蛋白染色的叠加，根本不会符合标准蛋白曲线的线性规律，自然定不准。

【需要说明：

我目前只知道NP40会这样，因为我们从来不去定量，没有做过更深入的研究。

】

实际上保证你的内参一致，是从样品制备开始的，上节末尾有提到，不赘述。

如果你从制备样品时就注意过定量问题，实际上通常内参差别不会太大。

如果真的有差别，通常我们会先跑少量的样品，目的是让Actin或tubulin更清晰、不会粘连、不会过曝光。

从而在第二轮跑正式结果前，根据第一轮的内参的荧光信号做微调，大致能做到相当；

最多可能需要第三轮。

以上的试验可以精确到0.1ul差异（我很多体外生化试验之前的调整酶量就是这样进行，此时根本不可能有足够的蛋白让你去定量）。

当然凭曝光强弱调整上样量的前提是，你的WB技术很稳定，很可靠，这是需要相当多的经验积累，如果你一时掌握不了，可以让经验更丰富的师兄师姐或者导师帮忙。

顺便提到，有人问过用QuantityOne等定量软件对光密度定量后计算差别从而调整上样体积是否可以？

——不可以。

因为WB结果经过多重放大，精确计量只代表相对于对照组的相对比值，与实际比值还是有误差，所以按计算值更改上样量仍会出现偏差。

如果非要做定量的话，要注意你的裂解液配方，把每种溶剂都先加入到显色液中尝试一下，避免那些本身会显色的物质出现在你的裂解液中；

当然，某些物质的去除可能影响对组织蛋白的提取。

所以这是一个两难的问题。

转印——转印效率对WB结果的影响并不如书本和网络上宣扬的那么大！

首先必须澄清的是，很多时候新手会把WB结果无信号归咎于转膜不够充分，实际上转膜效率对最终结果的影响所占比重并不高，真正取决定性因素的是抗体识别能力的强弱，以及如何正确使用抗体，这个问题下节讨论。

有一个简单的例证，Biorad提供的3mm厚滤纸初次使用时，通常转膜效果不理想（从预染的marker深浅可知），但对多数一般丰度的蛋白的检测没有任何影响（建议少用这种新滤纸做那种含量特别稀少或者转膜非常困难的蛋白）。

没有很好的策略可以解决这个新滤纸的问题；

尝试过浸泡（会泡烂的）、预电泳（会稍微好点）等等，效果均不理想。

通常，最初一两次的使用就是用于转一般蛋白。

每次用完后清水稍微冲洗一下表面盐分（要控制水流；

水流太大，纸张会烂掉的），晾干再用；

只要没冲烂可以一直反复使用。

其次，尽管转膜效率不起决定性作用，但由于WB的流程相对较长，所以每个步骤的叠加作用会被级数放大，因此在试验的每个步骤我们仍会力求更好，因此以下仍会深入探讨如何提高转膜效率。

针对提高转膜的效率，个人认为最先应该考虑到的是仪器的选用。

这里不是歧视“madeinChina”，国内的厂家很少注重不断提高自己产品的品质，走低端策略，对于电泳仪这种技术含量不高的仪器倒可以凑合；

但说到转膜仪，能把一个简单的匀场电极做好的还真不多（就我道听途说的，国外厂家为了使电极之间场强更加均匀，那种大块金属板表面是镀过极薄的白金层）；

因此转膜效率和均匀方面孰优孰劣不言而喻。

目前，个人使用过的国产电转槽（湿转）唯Tanon仿Biorad的还可以（算替它们免费打个广告吧，Tanon仿bioradmini3型电泳仪，在某些方面（主要是操作）上还优于Biorad原装；

目前我认为“中国制造”的灵魂就是仿造并超越前者）；

半干转仪一律进口，用过Biorad、amersham和英国公司的scie－plas。

PS：

批评一下Biorad。

Biorad的半干转仪，其硬质塑料外壳会莫名其妙的碎裂（绝非摔裂、磕碰，因为底面一般放在桌上后除定期需要清洗去除残留盐渍，基本不会移动；

即便如此它自然就会碎裂），以致于其核心组件未坏的情况下，因外壳碎裂不得不报废该仪器（其外壳里包裹电源线，外壳碎裂，电源则无法接通，导致仪器报废——我们先后买过3台都是这样的毛病，其间间隔了3年，不能肯定近来Biorad有没有改进这个问题；

如果没有，我想市场迟早会被其他公司所取代）

对这三款产品，Biorad的外壳有明显的质量缺陷，容易过早报废；

amersham独特的蜂窝式设计确实对转膜效率有所提高，但蜂窝式使得与“三明治”的接触面减少，电转时散热不太好，做大蛋白（半干转仪也可以做大蛋白转膜，效率确实不如湿转，但抗体好、蛋白丰度一般时仍可采用）长时程（3hrs）转膜需要在4度冰柜或coldroom进行；

英国的产品，价格较高，公司不太出名国内不一定有代理，但质量和散热都非常好。

这里谈到了半干转和湿转。

这两种转印方法各有优劣。

湿转适合所有的蛋白，转膜效率最佳，但靡费试剂、溶液，对普通分子量大小的蛋白转染操作时间长于半干转（下文会具体给出条件）；

半干转适合分子量较小的蛋白，省时、省试剂。

蛋白分子大小如何界定呢？

习惯上认为150KDa以上为大蛋白，其他均属于小蛋白，当然这只是一个相对标准。

因此，通常对大蛋白的转印多数人会选择长时程的湿转，那么刚才提到的amersham半干转仪的缺陷实际上没太多实质意义，何况还可以外加条件弥补；

而且用半干转做大蛋白转印本来就是高手在悬崖上跳舞，此时转膜效率是否更高已经没有任何意义——我说过转印效率对WB结果不起决定因素。

湿转、半干转缓冲液配方请参考分子克隆，有必要指出的是，实际上用半干转缓冲液进行湿转效果也非常理想，通常这种缓冲液可以反复使用多次（30V，～35V附近的时候，保险会自动跳掉、切断电转仪电源。

至于UK的，即使整张大板胶室温电转3hr以后，最大电压仍为18V（因此足见其散热性能的优良）。

注明：

以上半干转仪时间的要求是针对PVDF膜的，这里面有一个很有趣的问题。

尽管厂家一再表明PVDF膜比NC膜对蛋白的截留更高（但NC带负电性，理论上它的吸附量应该更高，所以通常同样使用TBST这种低盐洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜对小分子的截留明显不如NC膜，因此交联在预染marker上的颜料小分子很容易穿过PVDF膜，造成转膜过度的假象（除可考虑提升甲醇浓度至25%外，也可以考虑增加marker的上样量）；

NC膜没有这种问题，所以通常它的转膜时间也是小蛋白1hr、大蛋白3hrs，电流控制在200-300mA（16cm*9cm大胶300mA，如果胶面积小很多可以考虑降低，实际上相当于2.5-3mA/cm2左右）。

NC膜唯一不如PVDF膜的地方，在我看来是它的强度：

干燥的膜易碎。

当然目前某些厂家为解决这个问题，将NC成分涂在另一种介质的表面，这种膜的支持强度和PVDF膜类似，但转膜效率稍差于纯NC膜，且有明显的正反面；

因此制作转印三明治的时候要特别注意正反面。

此外，20KDa以下的蛋白宜采用0.22uM孔径的转印膜，但也不是一定必须。

对于大蛋白转印，很多书本建议采用低浓度胶，如6%SDS-PAGE。

但实际操作发现，6%太软，制作转印三明治的操作非常麻烦；

且内参如Actin、tubulin都在45KDa附近，而6%胶底边溴酚蓝指示60KDa左右，除非采用坛子上有人提过的灌不同浓度的胶或者梯度胶，否则需要同时跑两块胶，因此也不是很推荐。

个人经验认为300KDa以下8%胶（底边36KDa）都可以胜任，可以适当调整选择7-8%胶可以兼顾内参和大蛋白。

转膜最好在低温进行（高温会局部溶胶或降低转膜效率），尽管很多半干转仪没有具体要求，但用预冷过的电转液湿滤纸比未预冷的转印效率更高。

因此，有条件建议湿转、半干转均在低温（4度）进行。

此外，湿转缓冲液可以考虑转印前-20度预冷，时间不能长于2hrs，否则电泳液冻结；

mini3型有内置冰槽的，冰槽置-80度预冷。

制作转膜三明治的过程中，书中强调过滤纸、胶、膜的大小最好一致，否则没有胶、膜隔开部分的滤纸会因为直接接触而产生局部短路，降低内阻增加电（压）流，造成升温过快。

但进口仪器随厂原包装附带的滤纸有限，如果每次都切割新滤纸，消耗过快、初次使用的膜转膜效率不高，且增加额外的操作。

因此，实际上滤纸大一些也不太要紧，但是我会选择已经切割好的和胶面积最接近的滤纸；

通常膜的大小会严格控制在与胶面积一致或略小一点点。

操作时在保证每一层均无气泡的前提下，叠好后再碾压几个来回，力道要均匀、恰好；

力量过大，胶会被拉伸，条带会扭曲、变形。

碾压的目的不是为了驱赶气泡（完全可以做到叠加的时候每一层都无任何气泡；

诸如采用多层薄滤纸时可以一张张的叠加），更重要的作用是让膜和胶贴得更紧密。

可以理解的是，对于蛋白分子的大小而言，胶和膜之间的间距是数十万倍计的，因此更紧密的接触无疑是转膜成败的关键。

胶和膜需不需要泡呢？

不少公司实验讲座时提出泡胶、泡膜，实际操作中没有发现泡和不泡的转膜效率有多大差别。

实际上，胶只需要在电转液中浸一下即可（可以减少与滤纸或者膜之间的气泡）；

而膜也只要湿掉沾上电转液即可，同样多沾些缓冲液会有利于减少气泡（PVDF要先用甲醇湿润再投入缓冲液；

NC直接进缓冲液）。

如何监控转膜的效率呢？

在早期，鄙人亦依据分子克隆的介绍，采用立春红染膜。

只是后来发现此操作不仅增加额外的操作时间，而且不能说明任何问题，于是抛弃之。

首先，立春红（也包括考染胶）的灵敏度和HRP-ECL体系的灵敏度相差太远，即使立春红染膜无颜色，也无法提示WB结果会不会失败（考染胶无颜色也不能说明转膜充分了，除非你银染），你仍然得继续后面的操作；

相反靶蛋白区域有颜色，亦无法提示靶蛋白就转膜完全了，也许只是另外一个分子量大小相近的蛋白。

因此，无论立春红染膜失败或成功，你都必须进行后续的操作。

而立春红染胶不仅增加额外的操作时间，而且增加一轮漂洗的操作，对膜和膜上的蛋白都不好。

那么为什么不采用更直观的预染marker做转膜监控的依据呢？

理论上，同时转膜、颜色是交联到蛋白上的，因此颜色有多深表明有多少蛋白转印到膜上，非常直观、不会增加任何额外的操作（固定marker的上样量非常必要）。

当然上面提到针对PVDF膜，由于对小分子截留的局限，颜料分子会在高强度的转印过程中从交联的蛋白上脱落并穿过膜（颜料与蛋白交联得过深会使整个lane糊掉；

太紧（多）可改变蛋白构象使迁移率改变。

所以多数情况下颜料和蛋白之间是一种不稳定的交联，这意味着在某些条件下，颜料会从交联的蛋白上脱落，又因为膜分子孔径以及膜对不同物质吸附能力的差异，颜料小分子会轻易穿过膜到滤纸背面，而蛋白则被牢固的截留在膜上），造成转膜过度的假象。

现在你知道有这种局限，要么更换NC膜；

要么采用上面提到的非常稳定的转膜条件、注意必要的细节，就可从根本上忽略掉其对转膜效率的指示，而把预染的marker仅仅作为一个分子量大小的指针，当然同时可确认之前的转膜操作无误（没有插反电极，放反膜），也可为后续抗体孵育操作时膜的正反面做必要的提示。

不同公司预染的marker效果不太相同，一般NE