饲料添加剂 复合酶制剂Word格式文档下载.docx
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GB/T5917.1-2008饲料粉碎粒度测定法两层筛筛分法
GB/T6435-2006饲料中水分和其他挥发性物质含量的测定
GB10648饲料标签
GB/T13079-2006饲料中总砷的测定
GB/T13080-2004饲料中铅的测定原子吸收光度法
GB/T13082-1991饲料中镉的测定方法
GB/T13091-2002饲料中沙门氏菌的检测方法
GB/T14699.1-2005饲料采样
GB/T17480-2008饲料中黄曲霉毒素B1的测定酶联免疫吸附法
GB/T18869-2002饲料中大肠杆菌的测定
JJF10750-2005定量包装商品净含量计量检验规则
NY/T722-2003饲料用酶制剂通则
国家质量监督检验检疫总局令第75号(2005)《定量包装商品计量监督管理办法》
术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
酸性蛋白酶酶活力单位
在40℃,pH3.5条件下,每一分钟水解酪素(酪蛋白)产生1µ
g酪氨酸所需的酶量定义为一个酶活力单位,以U表示。
纤维素酶酶活力单位
在40℃,pH4.8条件下,每一分钟水解羟甲基纤维素钠产生相当于1µ
g葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位,以U表示。
果胶酶酶活力单位
在40℃,pH4.2条件下,每一分钟水解羟甲基纤维素钠产生1µ
g半乳糖醛所需的酶量定义为一个酶活力单位,以U表示。
淀粉酶酶活力单位
在50℃,pH4.8条件下,每一分钟水解可溶性淀粉产生1µ
要求
感官
本产品呈灰褐色到浅黑色,具有本品固有的发酵香味、无异味、异嗅,色泽一致,粒度均匀,无发霉变质。
水分
水分含量不得大于10%。
粉碎粒度
全部通过孔径为2.26mm(8目)的标准分样筛;
通过孔径为1.41mm(12目)的标准分样筛,筛上余物不得大于10%。
混合均匀度
混合应均匀。
经测试后其均匀度之变异系数(CV)应不大于7%。
酶活力
复合酶制剂的酶活力应符合表1规定。
酶活力指标
项目
指标
酸性蛋白酶酶活力,U/g≥
2000
淀粉酶酶活力,U/g≥
3000
纤维素酶酶活力,U/g≥
400
果胶酶酶活力,U/g≥
卫生指标
复合酶制剂的卫生指标应符合表2规定。
砷(以As计),mg/kg≤
3.0
铅(以Pb计),mg/kg≤
10.0
镉(以Cd计),mg/kg≤
0.5
沙门氏菌
不得检出
大肠杆菌,(个/100g)≤
黄曲霉毒素B1,(µ
g/㎏)≤
10
净含量
应符合《定量包装商品计量监督管理办法》的规定。
试验方法
将适量样品置于洁净的白色瓷盘内,在正常光线下,无异味的环境里,通过感官检验进行评定。
按GB/T6435-2006规定执行。
按GB/T5917.1-2008规定执行。
按NY/T722-2003规定执行。
酸性蛋白酶酶活力
按附录A(规范性附录)执行。
淀粉酶酶活力
按附录B(规范性附录)执行。
纤维素酶酶活力
按附录C(规范性附录)执行。
果胶酶酶活力
按附录D(规范性附录)执行。
砷
按GB/T13079-2006规定执行。
铅
按GB/T13079-2004规定执行。
镉
按GB/T13082-1991规定执行。
沙门氏菌
按GB/T13091-2002规定执行。
大肠杆菌
按GB/T18869-2002规定执行。
黄曲霉毒素B1
按GB/T17480-2008规定执行。
按JJF1070-2005规定执行。
检验规则
检验分为出厂检验和型式检验。
组批
以同一原料、同一配方、同一次投料所生产的产品为一个批次。
采样
按GB/T14699.1-2005规定执行。
出厂检验
每批产品需经公司质检部门检验合格,并附有产品合格证明方可出厂。
出厂检验项目为感官、粉碎粒度、水分、酶活力和净含量。
型式检验
6.4.1型式检验项目为本标准要求中的全部项目,型式检验样品在出厂检验合格的产品中抽取。
在保证产品质量的前提下正常生产时,每半年至少进行一次,如有以下情况之一时也应进行型式检验:
a)产品投产时;
b)原料、配方和工艺有较大变更,可能影响产品质量时;
c)停产三个月以上或主设备大修后恢复生产时;
d)出厂检验结果与最近一次型式检验结果有较大差异时。
6.4.2判定规则
检验结果卫生指标如有不合格项,则判定该批产品为不合格品;
其它项目如有不合格时,可重新在该批产品中加倍抽样或用试样留样对不合格项进行复检,复检结果如仍有不合格,则判该批产品为不合格。
标志、标签、包装、运输、贮存和保质期
标志、标签
应符合GB10648规定。
包装
本产品应使用无毒、无害、防潮、避光包装材料包装,包装封口应严密牢固。
运输
运输工具应清洁干燥,运输途中应防止日晒、雨淋,不得与有毒有害物品混运。
贮存
产品贮存在通风、阴凉、干燥的库房内。
产品堆码应离地不少于5cm。
不得与有毒有害物品混贮。
库房应有防虫、鼠害措施。
保质期
在符合本标准上述规定的贮运条件下,且包装完好的产品,保质期自生产之日起为12个月。
(规范性附录)
酸性蛋白酶酶活力测定<
福林(Folin)法>
原理
磷钨酸和磷钼酸的混合物,即福林试剂,在碱性溶液中极不稳定,易被酚类化合物还为蓝色化合物(钼蓝和钨蓝单纯合物)。
用蛋白酶分解酪蛋白(底物),生成含酚基的氨基酸与福林试剂显蓝色反应,可从蓝色的深浅判定酶活力的多少。
试剂和溶液
福林试剂
于2000mL磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·
2H2O)100g,钼酸钠(Na2MO2·
2H2O)25g,加水700mL,85%(V/V)磷酸50mL,浓硫酸100mL,文火回流10h。
取下回流冷凝器,加入硫酸锂50g,水50mL和浓溴水(99%)数滴。
再煮沸15min,以除去多余的溴(冷却后仍有绿色需再加溴水,再煮沸出去过量的溴)。
冷却,加水定容至1000mL。
混匀,过滤,制得到试剂应显金黄色,贮存于棕色瓶内。
或者也可以从专业试剂公司购买福林试剂成品。
使用溶液:
一份福林试剂与两份水混合,摇匀。
0.4mol/L三氯乙酸
取得三氯乙酸65.4g,定容于1000mL蒸馏水中。
0.4mol/L碳酸钠溶液
称取无水碳酸钠42.4g,用少量蒸馏水加热溶解后,定容至1000mL。
0.1mol/L的乳酸钠溶液(pH3.5)
A液(0.1mol/L乳酸溶液):
称取80%的乳酸10.6g溶解于少量蒸馏水中,再定容至1000mL;
B液(0.1mol/L乳酸钠溶液):
称取70%的乳酸钠16.0g溶于少量蒸馏水中,再定容至1000mL;
取两份A液,一份B液混匀,即得pH3.5的缓冲液。
20mg/mL酪素(酪蛋白)溶液
称取酪素2g(精确至0.0001g),先以少量0.1mol/L乳酸湿润,然后再加4mL~5mL浓乳酸液,再以0.1mol/LpH3.5乳酸缓冲液80mL稀释,在沸水中加热,并时时搅拌使之溶解,冷却后再用0.1mol/LpH3.5乳酸缓冲液定容至100mL。
100µ
g/mLL-酪氨酸标准溶液
a)称取预先于105℃干燥恒重的L-酪氨酸0.1g(精确至0.0001g),用0.2mol/L盐酸60mL溶解后至100mL,即为1mg/mL酪氨酸标准溶液;
b)吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL,用0.2mol/L盐酸定容至100mL,此溶液溶度为100µ
g/mL。
仪器和设备
可见光分光光度计;
恒温水浴锅(40℃±
0.2℃)。
分析步骤
标准曲线的绘制
不同浓度酪氨酸液的配制(按表A.1次序配制)。
A.1
100ug/mL的酪氨酸(mL)
0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00
水(mL)
109876543210
溶液浓度(g/mL)
0102030405060708090100
取不同浓度酪氨酸液各1mL,各加入5mL0.4mol/L碳酸钠溶液,1mL福林试剂,于40℃发色20min,用比色法测定其680nm吸光度(A值)。
所得A值为横坐标,酪氨酸µ
g数(即:
0µ
g/mL,10µ
g/mL,20µ
g/mL,30µ
g/mL,40µ
g/mL,50µ
g/mL,60µ
g/mL,70µ
g/mL,80µ
g/mL,90µ
g/mL,100µ
g/mL)为纵坐标,绘制标准曲线求出其回归方程。
空白的制作:
以蒸馏水代替1mL标准酪氨酸液,以下步骤同标准曲线制作。
待测酶液的制备
称取样品1g~2g(精确至0.0001g),先用少量pH3.5的乳酸缓冲液溶解,并用玻璃棒搅拌,将上清液倾入适当的容量瓶中,沉渣部分再用pH3.5的乳酸缓冲液溶解。
如此反复捣研3-4次,最后全部移入容量瓶中,用pH3.5的乳酸缓冲液定容至刻度,摇匀,用滤纸过滤,滤液供额定测定用。
测定
取上述稀释的酶液1mL(以测定时A值在0.2~0.4间为宜),在40℃水浴中预热2min,再加入同样预热的20mg/mL酪蛋白1mL,精确保温10.0min,使沉淀完全,过滤。
取滤液1mL,以下操作同标准曲线的绘制。
同时以先加氯乙酸灭活10.0min后,再加酪蛋白,沉淀过滤、发色,为空白作对照。
以下同标准曲线制作,测定吸光度(A值)。
计算
U=(4/10)K×
A×
N;
4/10——4为反应液总面积(mL),10为反应时间(min);
K——标准曲线斜度率常数;
A——680nm光密度;
N——稀释倍数;
注:
每个试样取两个平行样同时进行测定,取其算术平均值为结果,允许相对偏差≤10%。
淀粉酶酶活力的测定
淀粉酶具有催化淀粉水解的能力,从淀粉链的非还原性末端开始,分解a-1,4糖苷键,生成葡萄糖,葡萄糖与DNS试剂发生反应,产生一种黄橙混合色,可用分光光度计测定其色度,计算其酶活力。
0.2mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.8)
称取醋酸钠16.06g,醋酸(236%)4.92mL,用蒸馏水溶解定容至1000mL。
3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)
取酒石酸钾钠182g,溶于500mL蒸馏水中,加热,于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g,氢氧化钠21g,苯酚5g,亚酚5g,亚硫酸钠5g,搅拌至溶解,冷却后用蒸馏水定至1000mL,贮于棕色试剂瓶中,室温放置15d后使用,使用有效期为一个半月。
10mL/mL可溶性淀粉液
称取1g(精确至0.0001g)可溶性淀粉,先用少量缓冲液溶解后,徐徐倾入已煮沸的缓冲液中,继续煮沸透明冷却后用缓冲液定至100mL,冰箱保存备用。
10mg/mL葡萄糖标准液
称取1g(精确至0.0001g)分析纯葡萄糖(预先在105℃干燥至恒重),用少量蒸馏水溶解并定至100mL,冰箱保存备用。
仪器设备
恒温水浴锅(50℃±
0.5℃);
可见光分光光度计。
试验步骤
葡萄糖标准曲线的绘制
分别吸取10标准葡萄糖液1.00mL,2.00mL,3.00mL,4.00mL,5.00mL,6.00mL于50mL容量瓶中,蒸馏水制成每1mL分别含有葡萄糖200µ
g,400µ
g,600µ
g,800µ
g,1000µ
g,1200µ
g的标准液。
各取不同溶度标准液0.5于试管中,加蒸馏水1.5mL,DNS试剂3mL,沸水浴中沸腾7min(样品放入后重新沸腾时算起),取出后即加入蒸馏水10mL,混匀,冷却后,在分光光度计540nm处比色,以所得的吸光度(A值)为横坐标,以对应的标准葡萄糖液浓度的二分之一值(即100µ
g/mL,200µ
g/mL,300µ
g/mL,400µ
g/mL,500µ
g/mL,600µ
g/mL)为纵坐标,绘制标准曲线。
空白制作:
以0.5mL蒸馏水代替0.5mL标准葡萄糖液,以下操作步骤同标准曲线制作。
称取样品1~2g(精确至0.0001g),先用少量0.2mol/LpH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解,并用玻璃棒捣碎,将上层清夜倾入适应的容量瓶中,沉渣部分再用少量上述缓冲液溶解,如此反复捣研3~4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定至刻度,摇匀后用滤纸过滤,滤液供测定用。
取0.5mL适当稀释的酶液加1.5mL10mg/mL的可溶性淀粉液,50℃水浴保温30min,立即加入3mLDNS,在沸水中煮沸7min,冷却后加蒸馏水10mL混匀。
0.5mLpH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液加1.5mL10mg/mL的可溶性淀粉50℃反应30min做对照。
U=(K×
A/30)×
K——葡萄糖标准曲线斜率常数;
30——反应时间(30min);
A——540nm吸光度;
N——稀释倍数。
纤维素酶(CMCE)酶活力的测定
纤维素酶从纤维素中分解出还原糖。
还原糖又同2-羟基-3,5二硝基苯甲酸发生反应,产生一种黄-橙混合色。
可用分光光度法测定其色深。
仪器
可见光分光光度计
0.2℃)
试剂
磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液
溶解A(0.2mol/LNa2HPO4·
2H2O):
称取Na2HPO4·
2H2O35g或Na2HPO4·
12H2O71.62g,用蒸馏水溶解后定容至1000mL;
溶液B(0.1mol/L柠檬酸液):
称取一水柠檬酸(C6H8O7·
H2O)20.01g,用蒸馏水溶解后定容至1000mL;
取A液493mL,加入507mLB液混匀即为pH4.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
DNS试剂
称取酒石酸钾钠182g,溶于500mL蒸馏水中,加热,于热溶液中依次加入3,5—二硝基水杨酸6.3g,氢氧化钠21g,苯酚5g,亚硫酸钠5g,搅拌到溶解,冷却后用蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中备用,室温下放置15d后使用,有效期一个半月。
羟甲基纤维素钠(CMCNa)溶液
称取2g(精确至0.0001g)羧甲基纤维素钠(粘度300~600厘泊)溶于200mL蒸馏水中,水浴加热至溶解,用一层纱布过滤。
取滤液100mL,加入磷酸氢二钾-柠檬酸缓冲液20mL,蒸馏水40mL混匀,贮于冰箱备用(一周后应重新配制)。
10mg/mL标准葡萄糖液
称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖(AR)1g(精确至0.0001g),以蒸馏水溶解,定容于100mL容量瓶中,制成10mg/mL浓度的标准葡萄糖液。
标准曲线的制作
分别吸取10mg/mL标准葡萄糖液1.00mL,2.00mL,3.00mL,4.00mL,5.00mL,6.00mL于50mL容量瓶中,用蒸馏水制成每1mL分别含有葡萄糖200µ
g的标准溶液。
各取不同浓度标准溶液0.5mL于试管中,加pH4.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液1.5mL、DNS试剂3mL沸水浴中沸腾7min(样品加入后重新沸腾时算起),取出后立即加入蒸馏水10mL混匀,冷却后,在分光光度计540nm处比色,经测得的吸光度(A值)为横坐标,以对应的标准葡萄糖液浓度的二分之一的值(即:
测定步骤
待测酶液的制备:
称取一定量“四分法”采样取得的样品约2g(精确至0.0001g),用蒸馏水38mL浸泡,于40℃±
0.2℃浸泡45min,每15min搅拌一次。
浸泡液用滤纸过滤,所得滤液即为待测酶液。
待测酶液用pH4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释到一定倍数(控制测定A值在0.2~0.4之间),取经40℃预热的此稀释液0.5mL,加入经40℃预热的CMCNa液1.5mL(每个样品同时做2~3不同稀释液的梯度,每个梯度同时做两支平行试管),40℃恒温精确反应30.0min,立即加入DNS试剂3mL,立即于沸水浴中煮沸7min,终止反应,以上步骤同标准曲线制作。
取pH4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸0.5mL,加入DNS试剂3mL,再加入上述缓冲液1.5mL。
以上步骤同样品操作。
N
A——550nm吸光度;
30——反应时间30min;
果胶酶酶活力的测定
果胶酶主要是D-半乳糖醛酸、a-D-1,4糖苷键分子连接形成直链状聚合物。
果胶酶可使a-D-1,4糖苷键裂断,生成分子量较小的低聚物,甚至二半乳糖醛酸、半乳糖醛酸等还原性物质,根据还原性用DNS法测定。
主要仪器
恒温水浴锅40℃±
0.2℃。
磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH4.2)
溶液A(0.2mol/LNa2HPO4·
2H2O35.60g或Na2HPO4·
称取一水柠檬酸(C6H80·
2H2O)20.01g。
用蒸馏水溶解后定容至1000mL;
取A液414mL,加入B液586mL,混匀即为pH4.8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
称取酒石酸钾钠182g,溶于500mL蒸馏水中,加热,于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g,氢氧化钠21g,苯酚5g,亚硫酸钠5g,搅拌到溶解,冷却后用蒸馏水定容至1000mL。
贮于棕色瓶中备用,室温下放置15d后使用,有效期一个半月。
10mg/mL果胶酶溶液
称取试剂级果胶酶(美国Sigma公司产品,半乳糖醛酸含量84%,甲氧基含量9.3%),溶于50mL蒸馏水中,水浴加热至溶,再加热蒸馏水定容至100mL,用四层纱布过滤,贮冰箱备用。
7d后应重新配置。
10mg/mL标准DL-半乳糖醛酸溶液
称取DL-半乳糖醛酸0.5g(精确至0.0001g),以蒸馏水溶解,并定容至50mL,制成10mg/mL浓度的标准DL-半乳糖醛酸溶液。
分别吸取10mg/mL标准DL-半乳糖醛酸1.00mL,2.00mL,3.00mL,4.00mL,5.00mL,6.00mL于50mL于容量瓶中,加蒸馏水制成每1mL分别含有半乳糖醛酸200µ
g的标准溶液,分别取不同浓度的标准0.5mL于试管中,加入pH4.2磷酸氢二钠-柠檬酸溶液缓冲液1.5mL,再加入DNS试剂3.0mL。
立即加沸水浴沸腾7min(样品放入重新沸腾时算起),取出后立即加入蒸馏水10mL混匀,冷却后,在分光光度计540nm处比色,以测得的吸光度(A值)为横坐标,对应的标准DL-半乳糖醛酸溶液浓度的二分之一值(即100µ
以0.5mL蒸馏水代替0.5mL标准DL-半乳糖醛酸,以下操作同标准曲线制作。
称取一定量“四分法”采样取得的样品约2g(精确至0.0001g),用蒸馏水38mL浸泡,于40℃±
0.2℃浸泡45min,每15min搅拌一次,浸泡液用滤纸过滤,所得滤液即为待测酶液。
待测酶液用pH4.2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释到适当倍数(控制测定A值在0.2~0.4之间),精确吸取此稀释液0.5mL,加入pH4.2缓冲液1.0mL(每个样品作2~3个不同的梯度,每个梯度同时作两支平行试管),置40℃水浴锅预热,同时取适量10mg/mL果胶酶溶液进行预热。
吸取0.5mL10mg/mL果胶溶液,加入装有上述酶液的试管中,并立即计时,于40℃保温30.00min,取出后立即加入3mLDNS液,立即入沸水浴中煮沸7min,终止反应。
以后步骤同标准曲线操作。
1.5mLpH4.2缓冲液,加3mLDNS液,再加入0.5mg/mL果胶液,其它步骤同样品操作。
K——DL-半乳糖醛酸标准曲线斜率常数;
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