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。
各种化合物在恒定的条件下,经层析后都有其一定的
值,即在层析图谱中有一定的位置。
借此可以达到分离和鉴定的目的。
决定
值的因素主要是分配系数,而分配系数受以下因素的影响:
1.物质极性的大小:
水的极性很强,一般极性强的物质容易进入水相,非极性的物质易进入有机溶剂中。
如侧链含极性基团的氨基酸易分配在水相中,
值较小,而侧链含非极性基团的氨基酸易分配在有机相中,
值较大。
2.滤纸的质地以及为水饱和的程度:
滤纸的质地必须均一,纯净,厚薄适当,具有一定的机械强度,层析前应为水和有机溶剂的蒸汽所饱和。
3.溶剂的纯度、pH值和含水量:
pH值和含水量的改变可使氨基酸和展层剂的极性改变,
值也随之改变。
4.层析的温度和时间:
温度改变,使溶剂中有机相含水量改变,
值也改变。
当所有条件相同时,层析时间短,则
值小。
因此,层析过程中对以上影响因素要严格控制。
(二)实验材料、仪器与试剂
1.实验材料:
绿豆芽。
2.仪器:
吹风机、层析缸、培养皿、毛细管、针线、尺子、曲别针、新华1号滤纸等。
3.试剂:
(1)标准氨基酸溶液:
0.1%的赖氨酸(Lys)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)及上述各种氨基酸溶液等体积的混合液。
(2)展层剂及显色剂:
按正丁醇:
95%乙醇:
冰乙酸:
水=4:
1:
2配成展层剂后,再以其配成0.1%的水合茚三酮试剂。
(三)操作步骤
1.点样:
取新华1号滤纸一张,于距一端2cm处用铅笔画一道直线,并均匀分出11个点,其中8个点分别点8种标准氨基酸(各点4~5次),1个点点混合氨基酸(7~8次),2个点点样品(7~8次)。
样品的点法是掰开绿豆芽下胚轴,挤出一些汁液,用毛细管吸一些点样即可。
2.层析:
取大小合适的层析缸一个,其底部放上直径为10cm左右的培养皿。
向培养皿中加入约1.5cm深的展层剂,盖严,平衡20min。
将点好样的滤纸卷成筒状,用曲别针或针线缝合固定两点(注意不要使滤纸的两边重叠)。
将滤纸点样端朝下,点样面向外放入培养皿中,盖严层析缸,开始层析。
待展层剂前沿到达距上端3cm左右时(约4~5h),层析停止,取出滤纸,用铅笔画下前沿线。
3.显色:
用吹风机热风将滤纸吹干,其上的氨基酸便与展层剂中的显色剂——茚三酮发生颜色反应,显出蓝紫色斑点,其中脯氨酸显黄色。
4.分析:
用铅笔描绘出色斑轮廓,计算各样点的
值,依据
值及颜色与标准氨基酸比较,鉴定出各样点的氨基酸名称,并得出绿豆芽中所含游离氨基酸的种类。
二、薄层层析法
(一)原理
薄层层析是将吸附剂或者支持剂(有时加入固化剂)均匀地铺在一块玻璃上,形成薄层。
把欲分离的样品点在薄层上,然后用适宜的溶剂展开,使混合物得以分离的方法。
由于层析在薄层上进行故而得名。
是一种微量、快速的层析方法。
它不仅可以用于纯物质的鉴定,也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。
还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。
薄层层析的作用机理主要包括吸附、分配、离子交换和凝胶过滤等作用。
当样品组分在薄板上进行分离时,这几种作用产生不同的影响,究竟哪种作用为主,须视情况而定。
在吸附薄层层析中,因样品组分极性有差异,故不同组分与吸附剂和展层剂的亲和力就有差别,从而导致各组分在薄板上的移动距离不同,组分与吸附剂亲和力强的留在接近原点的位置;
反之,组分与吸附剂亲和力弱的留在离原点较远的位置,即亲和力愈弱,移动愈远,于是样品中各组分就得到分离。
按照相似溶解相似规律,极性组分易溶于极性溶剂中;
非极性组分则易溶于非极性溶剂中,因此在同一薄板上,不同极性化合物的组分在同一溶剂中的溶解度不同,溶解度愈大,移动的速度愈快;
否则反之。
展层的过程即样品各组分得到分离的过程,它也是一个吸附,解析,再吸附,再解析的连续过程。
同一种物质具有相同的Rf值,不同物质有不同的Rf值,因而达到彼此被分离的目的。
然后用茚三酮显色,与标准氨基酸进行对比,就可以鉴定样品中各种氨基酸的种类,从显色斑点颜色的深浅和大小可以确定氨基酸的含量。
2.仪器:
薄层涂布器、研钵、试管、烘箱、真空干燥器、微量注射器、玻璃缸、喷雾器等。
(1)展开剂Ⅰ:
甲酸:
叔丁醇:
甲乙酮:
氨水:
水(5:
3:
1:
1,V/V)。
(2)展开剂Ⅱ:
异丙醇:
水(20:
5,V/V)。
注意:
以上两种展开剂临用时配。
(3)0.5%茚三酮丙酮溶液。
(4)羧甲基纤维素或微晶纤维素。
(5)标准氨基酸(2mg/mL)。
(1)薄层板制备:
称取10g微晶纤维素,加入20mL蒸馏水和2.5mL丙酮,研磨1min,用薄层涂布器涂布于干净的玻璃板上。
其厚度以300~500m为适(比一般薄板厚一些),凉干后即可使用。
(2)样品液制备:
称取样品5mg,放入小试管中,加入5.7N盐酸(恒沸点盐酸)0.6mL。
在火焰上熔融封口后,置于110℃烘箱中水解24h。
取出,打开封口于真空干燥器中减压抽干,以去掉过多的盐酸,以稀氨水调节至Ph7左右,加入10%异丙醇最后达0.5mL,置于冰箱中备用。
(3)点样:
用微量注射器取样液5lspl,滴加在距薄板下边2cm处,点样直径在2~3mm内为宜。
(4)展开:
将已点样的薄板,放入有展开剂Ⅰ的玻璃缸里,先进行碱向展开,当溶剂前沿到达10cm时(约60~80min),将薄板取出,冷风吹干。
再进行酸向展开,将薄板放入有展开剂Ⅱ的玻璃缸中,展开至距离原点10cm时,取出吹于。
(5)显色;
以0.5%茚三酮液喷雾于薄层板上,喷得薄板湿润并无液滴流下。
将薄板吹干,有氨基酸的地方显出蓝紫色斑点,只有脯氨酸为黄色斑点。
用笔将斑点圈出或用描图纸复绘保存。
(6)标准氨基酸按上述步骤进行点样,展开显色。
各种氨基酸层析图谱
【附注】
1.点样时样点不要过大,直径以不超过5mm为宜,最好掌握在2~3mm。
每点一次,要等其干后再点下一次(可用吹风机吹干),以防样点直径过大。
2.毛细管不要乱用,以防将标样弄混。
3.手要洗凈,并注意拿着滤纸的上端,以防将纸面污染。
4.吹干时时间不宜过长,以免将样点吹糊。
5.为了定量还可以点上不同浓度的氨基酸标准液,供比较和确定样品中氨基酸的含量。
计算:
氨基酸含量(mg/kg)=[定容体积(mL)/样品(g)]×
[相当标准氨基酸(g)/滴样(mL)]
实验二蛋白质含量的测定
蛋白质不仅是植物的结构物质(如生物膜),而且是植物的生理活性物质(如酶),同时也是植物的重要贮藏物质,是维持植物生命活动所必需的。
测定植物组织中及籽粒中蛋白质的含量,对于了解植物体中蛋白质代谢状况和农作物品种的品质有重要意义。
本实验目的是学习测定蛋白质含量的原理和方法。
一、改良双缩脲法
本法是延用已久的蛋白质含量快速测定法,常用于谷物蛋白质含量的测定。
双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中能与Cu2+产生紫红色的络合物,这一反应称为“双缩脲反应”。
蛋白质分子中的肽键也能与Cu2+发生双缩脲反应,即Cu2+与肽键中失去氢原子的氮原子相结合而生成紫红色络合物(在550nm处有一吸收峰),其颜色深浅在一定范围内与蛋白质含量成正相关,而与蛋白质的分子量及氨基酸组成无关,且络合物的颜色相当稳定。
谷物与豆类种子经风干、磨碎并过100目筛。
分光光度计、恒温箱、康氏振荡器、离心机、天平、移液管、具塞三角瓶等。
3.试剂:
(1)50mmol·
L-1KOH溶液
(2)双缩脲试剂:
量取蒸馏水920mL,加10mol·
L-1KOH溶液10mL和25%酒石酸钾钠20mL,摇匀后在剧烈搅拌下加4%CuSO4溶液50mL,密封保存。
如有沉淀析出,则需重新配制。
(3)蛋白质标准溶液:
精确称取70℃下恒重的纯酪蛋白或牛血清白蛋白1.0000g,溶于50mmol·
L-1KOH溶液中,定容至100mL,其浓度为10mg·
mL-1,保存在冰箱中。
1.标准曲线制作:
取6支干燥试管,编号后按下表添加试剂,摇匀后于25℃温箱中静置1h,使其充分显色。
然后在550nm波长下比色,读取消光值。
以消光值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标,绘制标准曲线。
试管编号
1
2
3
4
5
6
标准蛋白溶液(mL)
50mmol·
L-1KOH(mL)
蛋白质浓度(mg·
mL-1)
双缩脲试剂(mL)
消光值
1.0
0.2
0.8
0.4
0.6
8
10
2.样品测定:
(1)将磨碎过筛的样品在80℃下烘至恒重,取出置于干燥器中冷却待用。
(2)称取烘干样品0.5~1g,放入干燥的三角瓶中,加入50mmol·
L-1KOH溶液10mL,摇匀,相当于样品液10mL。
再加入双缩脲试剂40mL,加塞盖严,在振荡器上振荡10min,再于25℃温箱中保温显色1h,4000rpm离心10min,取上清液于550nm下比色,记录消光值。
(四)结果计算
式中:
为蛋白质含量(mg·
g-1);
为从标准曲线上查得蛋白质浓度(mg·
mL-1);
为样品液体积(mL)。
二、斐林(Folin)-酚法
本法是一种灵敏度极高的快速测定蛋白质含量的方法(测定范围为5~100μg),尤其适用于不溶性蛋白质含量的测定。
Folin-酚试剂由两部分组成:
试剂甲相当于双缩脲试剂,可与蛋白质中的肽键起显色反应;
试剂乙为磷钨酸和磷钼酸混合液,在碱性条件下极不稳定,易被酚类化合物还原,生成钨蓝和钼蓝的混合物而呈蓝色反应。
由于蛋白质中存在含酚基的氨基酸,故也有此反应,其颜色深浅与蛋白质含量成正相关。
在650nm时比色测定的灵敏度比双缩脲法高100倍。
由于肽键显色效果增强,从而减少了因蛋白质种类引起的偏差。
各种植物材料。
分光光度计、分析天平、离心机、冷凝回流装置、容量瓶、具塞刻度试管、移液管等。
(1)0.5MNaOH
(2)试剂甲:
称取10gNa2CO3、2gNaOH和0.25g酒石酸钾钠用蒸馏水溶解后定容至500mL,为A液;
称取0.5g硫酸铜(CuSO4·
5H2O)用蒸馏水溶解后定容至100mL,为B液。
每次使用前将A液50份与B液1份混合,即为试剂甲。
此混合液有效期1天。
(3)试剂乙:
在1.5L容积的磨口回流器中加入钨酸钠(Na2WO4·
2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4·
2H2O)25g及蒸馏水700mL,再加85%磷酸50mL、浓盐酸100mL充分混合,接上回流冷凝管,以小火回流10h。
回流结束后,加入硫酸锂150g、蒸馏水50mL及数滴液体溴,开口继续沸腾15min,驱除过量的溴,冷却后溶液呈黄色(倘若仍呈绿色,需再重复滴加液体溴数滴,继续沸腾15min),稀释至1000mL,过滤,滤液贮于棕色试剂瓶中。
使用时大约加水1倍,使最终浓度相当于1mol·
L-1酸度。
(4)标准牛血清白蛋白溶液:
精确称取牛血清白蛋白25mg,加少量蒸馏水溶解后定容至100mL,其浓度为250μg·
mL-1。
取6支试管,编号,按下表添加试剂,混合后于室温下放置10min,再各加0.5mL试剂乙,立即混合均匀(这一步速度要快,否则会使显色程度减弱),30min后于650nm波长下比色,记录消光值。
标准牛血清白蛋白(mL)
蒸馏水(mL)
蛋白质浓度(μg·
试剂甲(mL)
50
100
150
200
250
2.样品提取:
称取鲜样0.5~1.0g于研钵中,加蒸馏水2mL,研成匀浆,转入离心管,并用6mL蒸馏水分次洗涤研钵,一并转入离心管,4000rpm离心20min。
弃去沉淀,上清液定容至10mL,即为待测液。
3.样品测定:
取待测液1mL放入具塞试管中,加入试剂甲5mL,混匀后放置10min,然后加试剂乙0.5mL,迅速混匀,室温下放置30min,于650nm波长下比色,记录消光值。
为从标准曲线上查得蛋白质浓度(μg·
为提取液总体积(mL);
为样品重(g)。
1.因为酚试剂仅在酸性条件下稳定,但此实验的反应只在pH≠10的情况下发生,所以当加酚试剂时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应,否则会使显色程度减弱。
2.还原物质、其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。
三、考马斯亮蓝G-250染色法
考马斯亮蓝G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
该染料在游离状态下呈红色,当它与蛋白质结合后变为青色,前者吸收峰在465nm,后者在595nm。
在一定蛋白质范围内(0~1000μg·
mL-1),蛋白质色素结合物在595nm波长下的消光值与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合反应十分迅速,2min左右即达到平衡,其结合物在室温下1h内保持稳定。
该反应非常灵敏(比斐林-酚法还高4倍),可测微克级蛋白质含量,易于操作,干扰物质少,是一种比较好的蛋白质定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低,且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
小麦叶片及其他植物材料。
分光光度计、离心机、药物天平、容量瓶、移液管、试管等。
3.试剂
(1)100μg·
mL-1标准牛血清白蛋白溶液:
精确称取牛血清白蛋白10mg,溶于100mL蒸馏水中。
(2)考马斯亮蓝G-250试剂:
称取100mg考马斯亮蓝G-250,溶于50mL90%乙醇中,加入100mL85%磷酸(W/V),最后用蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中。
此溶液在常温下可放置一个月。
(3)其他试剂:
90%乙醇、85%磷酸。
取6支试管,按下表添加试剂。
摇匀,放置2min后在595nm波长下比色,记录消光值。
以消光值为纵坐标,牛血清白蛋白浓度为横坐标,绘制标准曲线。
考马斯亮蓝G-250(mL)
20
40
60
80
称取鲜样0.5~1.0g放入研钵中,加2mL蒸馏水研成匀浆,转移至50mL容量瓶中,再以蒸馏水分次洗涤研钵,收集于同一容量瓶中,用水定容至刻度,放置30min以充分提取,其间摇动几次。
然后过滤或离心,清液即为待测液。
吸取提取液1mL,放入试管中,加5mL考马斯亮蓝G-250试剂,充分摇匀,放置2min后于595nm处比色,记录消光值。
四、紫外吸收(UV)法
蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基在280nm波长下具有最大光吸收。
由于各种蛋白质中都含有酪氨酸,因此280nm的光吸收值是蛋白质的一种普遍性质。
在一定程度上,蛋白质溶液在280nm的吸光度与其浓度成正比,故可作定量测定。
核酸在紫外区(260nm)也有吸收,可通过校正加以消除。
1.实验材料:
2.仪器:
紫外分光光度计、离心机、天平、研钵、容量瓶、移液管、试管等。
3.试剂:
0.1mol·
L-1pH7.0磷酸缓冲液
1.样品提取:
称取鲜样0.5g,用5mL蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后,10000rpm离心10min,上清液为待测液。
2.测定:
取适量的样品提取液,根据蛋白质浓度,用0.1mol·
L-1pH7.0磷酸缓冲液适当稀释后,用紫外分光光度计分别在280nm和260nm波长下读取吸光度,以pH7.0磷酸缓冲液为空白调零。
为蛋白质浓度(mg·
1.45和0.74为校正值;
为蛋白质溶液在280nm处的吸光度;
为蛋白质溶液在260nm处的吸光度;
为稀释倍数;
实验三还原糖、总糖、可溶性糖含量的测定
还原糖和总糖含量测定:
一、目的意义
糖是植物组织中含量最丰富的化合物。
还原糖可以合成非还原性糖,非还原糖也可以分解成还原性糖。
测定植物组织中总糖及还原糖的含量,能帮助我们了解植物糖代谢状况。
本实验的目的是掌握还原糖和总糖定量测定的基本原理,学习3,5-二硝基水杨酸法测定糖含量的基本操作。
二、原理
各种单糖和麦芽糖是还原糖,蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用溶解度不同,可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来,再用酸水解法使无还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。
在碱性条件下,还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热,3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质),还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。
在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系,在540nm波长下测定棕红色物质的消光值,查标准曲线并计算,便可求出样品中还原糖的含量。
如果在测定前先用盐酸对样品进行水解,所测得的即为总糖含量。
多糖水解时,在单糖残基上加了一分子水,因而在计算总糖时须扣除已加入的水量,测定所得的总糖量乘以0.9即为实际的总糖量。
三、实验材料、仪器与试剂
面粉或其它植物材料。
分光光度计、离心机(过滤法不用此设备)、扭力天平、恒温水浴、具塞刻度试管、大离心管或玻璃漏斗、烧杯、三角瓶、容量瓶、移液管等。
(1)1mg·
mL-1葡萄糖标准液:
准确称取100mg分析纯葡萄糖(预先在80℃烘至恒重),置于小烧杯中,用少量蒸馏水溶解后,定量转移到100mL容量瓶中,以蒸馏水定容至刻度,摇匀,冰箱中保存备用。
(2)3,5-二硝基水杨酸试剂:
将6.3g3,5-二硝基水杨酸和262mL2MNaOH溶液加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中,再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠,搅拌溶解。
冷却后加蒸馏水定容至1000mL,贮于棕色瓶中备用。
(3)碘-碘化钾溶液:
称取5g碘和10g碘化钾,溶于100mL蒸馏水中。
(4)酚酞指示剂:
称取0.1g酚酞,溶于250mL70%乙醇中。
(5)6MHCl
(6)6MNaOH
四、操作步骤
(一)制作葡萄糖标准曲线
取7支25mL具塞刻度试管,按下表加入试剂。
摇匀,沸水浴加热5min,取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温,再以蒸馏水定容至25mL刻度,塞住管口,颠倒混匀(如用普通大试管,则向每管加入21.5mL蒸馏水,混匀)。
在540nm波长下,用1号管调零,分别读取各管的消光值。
以消光值为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标,绘制标准曲线。
7
葡萄糖标准液(mL)
葡萄糖浓度(mg·
3,5-二硝基水杨酸(mL)
2.0
1.5
1.8
0.1
1.6
1.4
0.3
1.2
0.5
(二)样品中还原糖和总糖含量的测定
1.样品中还原糖的提取:
准确称取3g食用面粉,放在100mL饶杯中,先以少量蒸馏水调成糊状,然后加50mL蒸馏水,搅匀,置于50℃恒温水浴中保温20min,使还原糖浸出。
离心或过滤,用20mL蒸馏水洗残渣,再离心或过滤,将两次离心的上清液或滤液全部收集在100mL容量瓶中,用蒸馏水定容至刻
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