植物DNA和RNA提取方法Word格式.docx
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(10)60sec后,直立离心管,加入720μl的75%乙醇及80μl5M的醋酸钠,轻轻转动,用手指弹管尖,使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中;
(11)放置30min,使DNA块状物的不纯物溶解;
(12)10000rpm离心1min后,倒掉液体,再加入800μl75%的乙醇,将DNA再洗30min;
(13)10000rpm离心30sec后,立即倒掉液体,将离心管倒立于铺开的纸巾上;
数分钟后,直立离心管,干燥DNA(自然风干或用风筒吹干);
(14)加入50μl0.5×
TE(含RNase)缓冲液,使DNA溶解,置于37℃恒温箱约15h,使RNA消解;
(15)置于-20℃保存、备用。
2.DNA质量检测
琼脂糖电泳检测,原理和方法见实验二。
六、注意事项
(1)叶片磨得越细越好。
(2)移液器的使用。
(3)由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶,使DNA降解。
思考题:
1.本实验中所用到的各试剂的作用是什么?
CTAB,氯仿,异丙醇,75%乙醇,EDTA
2.提取基因组DNA的方法有哪些?
各有何优缺点?
实验二多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)基因扩增及琼脂糖凝胶电泳检测
一、实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理,掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。
二、实验原理
PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段,即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。
基本原理及过程如下:
PCR循环过程中有三种不同的事件发生:
(1)模板变性;
(2)引物退火;
(3)热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1.变性:
加热使模板DNA在高温下(94-95℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单链,即变性阶段。
2.退火:
在体系温度降至37-65℃,模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合,使引物与模板链3’端结合,形成部分双链DNA,即退火阶段。
3.延伸:
体系反应温度升至中温72℃,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板,在引物的引导下,利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按5’到3’方向复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
从理论上讲,每经过一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过25~30个循环后DNA可扩增106~109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成:
DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNATaq聚合酶。
琼脂糖凝胶电泳的原理:
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,沸水中溶解,45℃开始形成多孔性刚性滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。
不同DNA,其分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系。
溴化乙锭(EB)为扁平状分子,在紫外照射下发射荧光。
EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物,其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上,且荧光强度与DNA的含量成正比。
用肉眼观察,可检测到5ng以上的DNA。
三、实验材料及相关试剂
基因组DNA,基因特异性引物,PCR扩增相关试剂,等
四、实验步骤
1.模板DNA的抽提:
实验一所得的水稻基因组DNA。
2.PCR操作(在冰上操作):
(1)PCR反应混合液的配制:
反应体系25μL,在无菌的0.2mL离心管中按下列操作程序加样:
反应物
加样顺序
体积/μL
终浓度
ddH2O
1
17.3×
n
10xBuffer
2
2.5×
1x
25mmol/LMgCl2
3
1.5×
1.5mmol/L
10mmol/LdNTP
4
0.5×
200μmol/L
10μM上游引物
5
1×
0.4μmol/L
10μM下游引物
6
0.4μmol/L
DNATaq聚合酶
7
0.2×
1U
(2)将反应混合液混匀,然后每个PCR管中分装24μL反应混合液,再加1μL模板DNA,最后加1滴石蜡油,防止水分蒸发,然后稍离心。
(3)将PCR管放到PCR热循环仪中,按下列程序开始循环:
94℃4min(预变性)94℃30sec,60℃30sec,72℃2min72℃7min
35个循环
(4)注意事项
由于PCR灵敏度非常高,所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。
a.所有与PCR有关的试剂,只作PCR实验用,而不挪作它用。
b.操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。
c.每加一种反应物,应换新的枪头。
3.PCR产物的检测:
琼脂糖浓度(1.2%);
EB浓度(5μl/100mlTBE)
(1)制胶(以150mL为例)
a.称取1.8g琼脂糖,加入150ml的TBE缓冲液(pH8.0),摇匀,用电子天平称三角瓶的总重量。
b.电炉上加热,至琼脂糖完全溶解;
然后在天平上加蒸馏水至原重量;
c.用凝胶将制胶板两端封好,插入适当的梳子,将溶解的琼脂糖(约50℃),倒入其中,直至厚度为4~6mm(如有气泡要把气泡赶出),在室温下冷却凝固(约30~45min);
d.将制胶板置于电泳槽中,小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好。
(2)点样
a.将2.0μl溴酚蓝加入到PCR产物中,然后稍微离心;
b.每孔点样10.0μl,蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。
(3)电泳
打开电源开关,调节电压至3~5V/cm(约100V),可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动,约1小时后即可观察。
(4)染色
将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中,染色15-20分钟。
(5)观察
将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上,戴上防护观察罩,打开紫外灯,可见到橙红色核酸条带,根据条带粗细,可粗略估计该样品DNA的浓度。
如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳,则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。
(6)注意事项
a.煮胶时,胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3,否则易溢出。
b.煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒,以免制胶板变形,并减少漏胶的机会。
c.倒胶注意厚度(4-6mm),充分凝固后再拔出梳子,以保持齿孔形状完好。
也可待胶稍凝固后,放入4℃冰箱10多分钟,以加速胶的凝固。
d.加样前赶走点样孔中的气泡,点样时吸管头垂直,切勿碰坏凝胶孔壁,以免使带型不整齐。
e.一般情况下不必每点一个样品都换枪头,吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。
凝胶中含有EB,切勿直接用手接触胶,废弃胶应集中处理,勿乱丢。
1.PCR反应液中主要成分是哪些?
在PCR反应过程中各起什么作用?
2.为什么在PCR反应过程中,使用三个不同的温度变化?
3.用PCR扩增目的基因,要想得到特异性产物需注意哪些事项?
实验三植物总RNA的提取
通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法
RNA是一类极易降解的分子,要得到完整的RNA,必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。
高浓度强变性剂异硫氰酸胍,可溶解蛋白质,破坏细胞结构,使核蛋白与核酸分离,失活RNA酶,所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。
细胞裂解后,除了RNA,还有DNA、蛋白质和细胞碎片,通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。
三、仪器、药品与试剂配方
(一)仪器
1.低温离心机
2.分光光度计
3.琼脂糖胶电泳系统,用前先用1%NaOH溶液浸泡过夜,之后再用DEPC水浸泡冲洗。
4.高压灭菌锅
5.研钵、剪刀、一次性手套等
(二)药品
1.焦碳酸二乙酯(DEPC)
2.吗啉代丙烷磺酸(MOPS)
3.异硫氰酸胍
4.醋酸钠(NaAc)
5.氯仿
6.苯酚
7.甲醛
8.乙醇
9.乙二胺四乙酸(EDTA)
10.琼脂糖
11.异丙醇
(三)试剂配方
1.0.1%DEPC水
1.1mlDEPC加入100ml三蒸水中,振摇过夜,再湿热灭菌。
2.2mol/LNaAc、0.5mol/LEDTA、4mol/L异硫氰酸胍、4mol/LLiCl等均用DEPC水配制。
3.5ΧMOPS电泳缓冲液(pH7.0)
MOPS0.1mol/L
NaAc40mmol/L
EDTA5mmol/L
(一)总RNA的提取(方案一)
1.实验前10天左右播种水稻种子,在3-4叶期,剪取1.2g幼叶。
放入研钵,在液氮中研磨成粉末状,移入10mL离心管。
加入
4mol/L异硫氰酸胍4mL
苯酚3mL
2mol/LNaAc(pH4.8)0.3mL
氯仿0.6mL
混匀,冰浴放置30min。
2.4℃,8000r/min,离心13min。
3.弃沉淀,取上清至另一干净无菌离心管中。
4.加入2倍体积无水乙醇,-70℃,0.5h。
5.4℃,8000r/min,离心13min。
6.弃上清,在沉淀中加入1mL4mol/LLiCl,使其溶解。
7.移入1.5mL离心管中,冰浴2h。
8.4℃,13000r/min,离心15min。
9.弃上清,在沉淀中加入400uLDEPC水,再加入400uL氯仿,混匀。
10.4℃,13000r/min,离心6min。
11.取上清,并加入1/10体积3mol/LNaAc(pH5.0),2倍体积无水乙醇,-20℃放置30min。
12.4℃,13000r/min,离心20min。
13.将沉淀RNA用70%乙醇洗涤2次。
14.将沉淀RNA室温下稍干燥。
15.加30uLDEPC水溶解,-70℃保存。
(二)总RNA的提取(方案二)
利用TRIzol提取液抽提RNA,具体步骤如下:
1.取幼叶约250mg在液氮中研磨至细粉,转入预冷的1.5ml离心管;
2.加入1mlTRIZOL提取液震荡摇匀;
3.室温放置5min后,加入0.5ml的氯仿,剧烈摇动离心管5min;
4.在8℃条件下,12000rpm离心15min;
5.溶液分为两层,下层为酚-氯仿浅红色液层,将上层液体移入干净离心管,加入0.5ml异丙醇在15~30℃条件下,沉淀10min;
6.然后在,2~8℃条件下,12000rpm离心10min,RNA沉淀管壁和底部;
7.去掉液体部分,加入1ml75%酒精洗2次;
8.风干后,加入25μlDEPC处理过的水溶解RNA,储藏于-80℃冰箱备用。
(三)甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA
1.配制1.2%变性琼脂糖凝胶(40mL)
称取0.48g,加入DEPC水25.2mL,5X电泳缓冲液4mL,加热使溶解,稍冷却加入甲醛3.4mL,混匀,室温凝固0.5-1h.
2.RNA电泳检测样品制备
RNA
2μl
甲醛
2.5μl
甲酰胺
7.5μl
10×
MOPS
RNALoadingBuffer
灭菌的DEPC水
4μl
混合液轻轻混匀并离心,放于65℃下温育5min后,置于冰上。
3.电泳检测
将1.2%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中,加1×
MOPS电泳缓冲液,覆盖凝胶约1mm。
将RNA样品加到凝胶点样孔中,在5V/cm条件下电泳30min,然后在EB中染色15-20min,在紫外灯下观察提取的RNA的质量。
五、注意事项
1.在研磨过程中,利用液氮时刻使组织保持冰冻状态。
2.RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶类,除了细胞内源RNA酶外,外界环境中均存在RNA酶,所以操作时应戴手套,并注意时刻换新手套。
1.实验中所用到的各试剂的作用是什么?
焦碳酸二乙酯(DEPC),吗啉代丙烷磺酸(MOPS),异硫氰酸胍,醋酸钠(NaAc),氯仿,
苯酚,甲醛,乙醇,乙二胺四乙酸(EDTA),异丙醇
动植物组织mRNA提取实验方法
一、材料
水稻叶片或小鼠肝组织。
二、设备
研钵,冷冻台式高速离心机,低温冰箱,冷冻真空干燥器,紫外检测仪,电泳仪,电泳槽。
三、试剂
1、无RNA酶灭菌水:
用将高温烘烤的玻璃瓶(180℃2小时)装蒸馏水,然后加入0.01%的DEPC(体积/体积),处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇:
用DEPC处理水配制75%乙醇,(用高温灭菌器皿配制),然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱。
3、1×
层析柱加样缓冲液;
20mmol/LTris·
Cl(pH7.6),0.5mol/LNaCl,1mmol/LEDTA(pH8.0),0.1%SDS。
4、洗脱缓冲液:
10mmol/LTris·
Cl(pH7.6),1mmol/LEDTA(pH8.0),0.05%SDS。
四、操作步骤
(一)动植物总RNA提取-Trizol法
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。
用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。
RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交,Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
4、弃去上清液,按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶10分钟。
RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意]1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。
(二)mRNA提取
由于mRNA末端含有多poly(A)+,当总RNA流径oligo(dT)纤维素时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。
1、用0.1mol/LNaOH悬浮0.5-1.0goligo(dT)纤维素。
2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0。
4、将
(一)中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温,加入等体积2x柱层析缓冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后,加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。
5、测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时,加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液,以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
6、测定OD260,合并含有RNA的洗脱组分。
7、加入1/10体积的3MNaAc(pH5.2),2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30分钟。
8、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟。
9、小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟。
10、用少量水溶解RNA液,即可用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃)。
[注意]1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/lNaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠(NaN3)冰箱保存,重复使用。
每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。
RNA提取流程
RNA(totalRNA)和信使RNA(mRNA)的抽提
RNA的提取
RNA和无RNA酶的环境
原核生物能产生功能上截然不同的三种RNA,信使RNA(mRNA),核糖体RNA(rRNA),转运RNA(tRNA).而真核生物则能产生四种,还有一种为真核生物所持有的小RNA.mRNA是由基因转录而来的,它运送编码蛋白所需的信息.由于mRNA代表了基因表达的水平,因此mRNA的分离,定量和检测极为重要.
应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍.RNA存在于从简单的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中.由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA,因此,RNA的分离通常是决定实验结果质量的第一步,也是关键的一步.
提取RNA过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤
RNA分离的实用方法既有简单直接的方法(如分离rRNA和tRNA),也有困难和涉及复杂步骤的方法(如分离mRNA).在无细胞体系中克隆基因的体外转录非常有用,它可以产生足量的同源RNA分子用作探针或模板以识别和测定表达基因的量,或用于RNA的生化研究,处理RNA样品时必需仔细小心,其程度取决于样品的用途和来源.由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏,固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要.对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要.
方案:
工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离好,特别是那些用于细菌接种,培养基和试剂配制的区域,那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA的制备和操作.通常认为这些区域富含RNA酶.
如有可能,使用标有"
无RNA酶"
的商品试管,吸头,溶液和水.通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶,
3)双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦碳酸二乙酯)进行处理:
每100mL溶液或水中加入0.1mLDEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37℃下作用数小时.然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活.
4)用分子级的试剂和DEPC处理过的水配制的溶液通常没有RNA酶.
5)分离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300℃烘烤4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理.
从组织中提取RNA则要注意:
动物器官的解剖器械
存放组织块的玻璃器皿
冻存组织块所用的器皿
组织器官的冲洗液
人汗含有RNA酶,故在所有步骤中均应戴手套并经常更换.
记住我们的周围环境含有大量的微生物和气雾,它们来自吸液操作或来自我们自己的呼吸.这些可能造成RNA酶的污染
一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶.细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶.因此从这些细胞中制备RNA应采取更严格的预防措施.
分离后的RNA通过琼脂糖凝胶电泳再经溴化乙锭染色后便可检查其是否完整.rRNA(18s和28s)条带模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解.
一步法分离RNA
应用
从组织或细胞中分离细胞的总RNA
从液体样品中分离RNA
TRIREAGENT(Tripure)是一种用于RNA分离的商品溶液.该法源于chomc-zynski的RNA分离一步法.它更便于使用并且结果更加可靠.对于来源有限的样品,我们推荐使用这种试剂.这种试剂能从同一样品中同时分离RNA,DNA,蛋白质.
方案.
用lmLTripure/50-100mg(组织)匀浆组织样品.对于细胞,每10cm2面
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