植物愈伤组织诱导培养实验指导李老师Word格式文档下载.docx
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筒、移液抢、微波炉等。
3.2试剂
(1)95%乙醇、1mol/LNaOH、1mol/LHCl。
(2)MS培养基成分:
①大量元素(母液Ⅰ):
NH4NO3、KNO3、CaCl2.2H2O、MgSO4.7H2O、KH2PO4;
②微量元素(母液Ⅱ):
KI、H3BO3、MnSO4.4H2O、ZnSO4.7H2O、Na2MoO4.2H2O、
CuSO4.5H2O、CoCl2.6H2O;
③铁盐(母液Ⅲ):
FeSO4.7H2O、Na2.EDTA.2H2O;
④有机成分(母液,维生素和氨基酸):
肌醇、盐酸吡哆醇(维生素B6)、烟酸(Vpp)、盐酸硫胺素(维生素B1)、甘氨酸;
(3)植物生长调节物质:
2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。
4、操作步骤
(1)MS大量元素母液的配制
按照培养基配方的用量,把各种化合物扩大10倍,按照表1中的次序
分别准确称量后,分别用50ml烧杯,加入蒸馏水30ml溶解(可以加
热至60℃~70℃,促其溶解)。
溶解后,按顺序倒入一大烧杯中(烧杯中事先加入约50ml的蒸馏水,目的避免由于盐浓度过高使钙离子与磷酸根离子、硫酸根离子形成不溶于水的沉淀),注意最后加入氯化钙溶液,混匀,用250mL容量瓶定容。
将配制好的母液倒入试剂瓶中,贴好
标签,注明母液名称、配制日期、配制人姓名,置于4℃冰箱中保存备
用。
表1MS培养基大量元素母液(10倍)的配制剂量
培养基
1L培养基
化合物名
用量
扩大
称取量母液体积
母液
吸取母液
称
(mg/
倍数
(mg)(mL)
L)
量(mL)
KNO31,9004,750
NH4NO31,650
4,125
MgSO4·
7
370
9,25
大
量
元素
H2O
10
250
100
KH2PO4
70
425
CaCl2·
2H
4401,100
2O
(2)微量元素母液的配制
按照培养基配方的用量,将微量元素各种化合物(除去铁盐)扩大100
倍(表2),用万分之一天平分别准确称取,可以混合溶解,最后定容。
将配制好的母液倒入试剂瓶中,贴好标签,注明母液名称、配制日期、配制人姓名,置于4℃冰箱中保存备用。
表2MS培养基微量元素母液(100倍)的配制剂量
培养基用量
扩大倍
称取量母液体
1L培养基吸
化合物名称
取母液量
(mg/L)
数
(mg)
积(mL)
(mL)
微
MnSO4·
4H2O22.3
223
ZnSO4·
7H2O
8.6
86
元
H3BO3
6.2
62
素KI
0.83
8.3
Na2MoO4·
2H0.25
2.5
CuSO4·
5H2O
0.025
10ml*
CoCl2·
6H2O
*
*、**:
因天平均存在误差,为减少误差带来的影响,建议称取
0.25g,
溶解并定容至10ml容量瓶中,然后移取10ml,加入混合液中。
(3)铁盐母液的配制
常用的铁盐是FeSO4·
7H2O和Na2-EDTA的螯合物,必须单独配成母液。
配制时,按照扩大后的用量(表3),分别称取FeSO4·
7H2O和Na2-EDTA,
分别溶解后,将
FeSO溶液缓缓倒入Na
2-EDTA溶液(需加热溶解),搅拌
4
均匀使其充分螯合,定容后贮放于棕色玻璃瓶中,贴好标签,注明母液
名称、配制日期、配制人姓名,置于4℃冰箱中保存备用。
表3MS培养基铁盐母液(100倍)的配制剂量
培养基用扩大倍称取量母液体
母液化合物名称取母液量
量(mg/L)数(mg)积(mL)
(mL)
铁盐Na2-EDTA
37.3
373
FeSO4·
7H2O27.8
278
(4)有机物母液的配制
按照表4中各成分浓度扩大后的用量,用感量0.0001g天平分别称量各
有机物。
可以分别溶解定容,分别装入试剂瓶中,也可以混合溶解定容,装入同一试剂瓶中,写好标签,放入冰箱中保存。
一般有机物都溶于水,但叶酸(VBc)先用少量稀氨水或1mol/LNaOH溶液溶解;
VH(生物素)先用1mol/LNaOH溶液溶解;
VA、VD3、VB12应先用95%乙醇溶解,然后再用蒸馏水定容。
将配制好的母液倒入试剂瓶中,贴好标签,注明母
液名称、配制日期、配制人姓名,置于4℃冰箱中保存备用。
表4MS培养基有机物母液(100倍)的配制剂量
培养基用
1L
培养基吸
有机物名称量
扩大倍称取量母液体
(mg/L)
甘氨酸
2.0
20
有
VB1
0.4
机
VB6
0.5
5
物
烟酸
肌醇
1,000
(5)激素母液的配制
激素母液必须分别配制,浓度根据培养基配方的需要量灵活确定,一般
是0.1~2mg/ml,根据需要确定配制的浓度。
称量激素要用感量为万分之一天平。
本实验选用激素2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。
2,4-D母液的配制方法为:
准确称取10mg2,4-D,称量后先用少量(1-3ml)
95%乙醇完全溶解后,加蒸馏水定容至100ml,即得到0.1mg/ml的2,4-D
贮备液,转入细口试剂瓶中,贴上标签,注明母液名称、浓度、配制日期、配制人姓名,置于4℃冰箱中保存备用。
(6)在配制母液时注意事项:
①培养基各试剂应使用分析纯。
②在称量时应防止药品间的污染,药匙、称量纸不能混用,每种试剂使用一把药匙,多出的试剂原则上不能再倒回原试剂瓶。
③母液配制好后,贴上标签,写清母液名称、试剂浓度或扩大倍数、配制日期,并存放在4℃冰箱中。
使用前,要进行检查,若发现试剂中有絮状沉淀、或长菌、或铁盐母液的颜色变为棕褐色,都不应再使用。
5、结果记录与分析
(1)记录本小组配制的培养基母液种类、扩大倍数、母液配制体积、母
液中各成分的称取量。
(2)仔细观察在配制母液过程中的现象与遇到的问题,如是否产生浑浊或沉淀,并分析出现混浊的原因。
6、思考题
(1)配置大量元素母液、铁盐母液时,应注意些什么?
(2)配置激素母液时,应注意些什么?
实验1-2植物组织培养基MS的配制与灭菌
1、目的要求
学习植物组织固体培养基的配制,学习高压灭菌器的使用,为外植体的
接种与初代培养做准备。
在植物组织培养中,固体培养基是最常用的一种培养基类型。
由于培养
基中含有植物细胞生长所必需的各类营养物质,主要包括水、大量元素、
微量元素、铁盐、有机复合物、糖、凝固剂和植物生长调节物质,因此,
培养基也是微生物繁殖的极好场所。
所以,必需对培养基进行灭菌处理,
以确保无菌操作的顺利进行。
本实验以可用于胡萝卜等植物初代培养的培养基MS+1mg/L2-4D+3%蔗
糖+1%琼脂,pH5.8。
配制1L为例,学习培养基的配制方法。
3、实验仪器和试剂
(1)仪器、用具
高压灭菌锅,超净工作台、分析天平(0.0001g)、pH计(或pH试纸)、微
波炉、手术剪刀、解剖刀、镊子、药匙、玻棒、称量纸、洗瓶、记号笔、
烧杯(1000ml)、量杯、量筒(1000ml,100ml,50ml)、耐热皮筋(或棉
绳)、100ml三角瓶(每人按3-4瓶准备)、培养皿(每2人按1套准备)、封口膜、定性滤纸等。
(2)试剂
①95%乙醇、1mol/LNaOH、1mol/LHCl。
②MS培养基各母液、
2-4D母液、蔗糖、琼脂。
(1)器皿准备清洗三角瓶、烧杯、量筒、量杯、镊子、手术刀、培
养皿、打孔器等,烘干或自然晾干备用。
配制的培养基体积(mL)
母液取用量(mL)=
母液的扩大倍数
(2)计算母液使用量
根据下面公式量取母液:
培养基配制量(L)*激素使用浓度(mg/L)
激素母液用量(mL)=———————————————————
激素母液浓度(mg/ml)
—
配制1000ml培养基需要加入各母液的量分别为:
大量元素母液:
100ml微量元素母液:
10ml铁盐母液:
10ml
有机物母液:
10ml激素母液:
10ml
(3)配制
称取适量的琼脂(常用量10g/L)置于1000ml大烧杯中,加蒸馏水500ml左右,在微波炉中加热使之溶解,待琼脂完全溶化后,加入蔗糖(常用
量30g/L),溶后,加入上述各种母液,最后,加蒸馏水定容到需配培养基的终体积。
每组配制MS固体培养基1000ml,培养基组成为:
MS+1mg/L2,4-D+3%蔗糖+1%琼脂(pH5.8)。
(4)pH值调节
充分混合,待温度降至50℃~60℃时,用1mol/LNaOH溶液或1mol/LHCl溶液调pH值到5.8,注意用玻璃棒不断搅动。
(5)分装
搅匀培养基并迅速分装在100mL的三角瓶中(温度低于40℃以下琼脂就会凝固),每瓶25mL-30mL左右,1000mL培养基可以分装至30~40瓶,迅速盖上封口膜,用封口材料包上瓶口,扎口后,写上标记,注明配制
者姓名和配制日期,准备灭菌。
注意:
分装时不要把培养基弄到管壁上,以免日后污染。
(6)灭菌
培养基内含有丰富的营养物质,有利于细菌和真菌繁殖,所以培养基配好后要及时灭菌,同时将接种用具,如镊子、解剖刀、蒸馏水、培养皿(装有滤纸)等进行灭菌。
使用高压锅灭菌要注意以下几点:
①检查灭菌锅外层锅内水位,水量过少时应加蒸馏水。
把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。
盖上锅盖,上好螺栓后接通电源加热。
②排放冷空气,关闭放气阀,当灭菌锅盖上的压力表指针移至
0.1Mpa(121℃),控制压力表稳定在该压力下15分钟,即达到灭菌目的。
③灭菌后,先切断电源,让灭菌锅内温度自然下降,待灭菌锅压力表指
针降到0时,打开排气阀,旋松螺栓,开启锅盖,取出已灭菌的培养基,置于水平台子上,在室温下冷却,同时取出灭菌水、培养皿、镊子、解
剖刀、滤纸等。
④灭菌后的培养基应在室温下放置2—3天,观察有无微生物生长,以
确定培养基是否灭菌彻底。
经检查没有杂菌生长时方可使用。
要求:
每人准备培养基3-4瓶。
(1)仔细记录培养基制备中,各种母液、试剂称量的量。
(2)观察在配制培养基过程中的现象与遇到的问题,并加以解释。
(1)培养基表达式:
MS+1mg/L2-4D+2.5%蔗糖+1%琼脂,pH5.8,表达的
含义是什么?
实验1-3胡萝卜愈伤组织的诱导
1、实验目的
(1)学习植物材料表面灭菌的常规方法;
(2)了解接种的无菌操作技术;
(3)学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。
2、实验原理
植物组织培养是应用无菌操作的方法,培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。
如果组织培养使用的植物材料是带菌的,在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒,获得无菌材料进行组织培养,这是取得组织培养成功的前提和重要保证。
由于植物细胞具有全能性,外植体在合适的培养基上,可以通过脱分化,
形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。
仪器:
超净工作台、光照培养下、酒精灯、打火机、橡皮筋、记号笔、
脱脂棉1包、8把水果刀、8个1000ml烧杯(装废液用),8个500ml广口瓶,内装75%酒精及棉球、8个150ml锥形瓶,内装75%酒精100ml,8个250ml试剂瓶,内装HgCI2或次氯酸钠的消毒液。
无菌器材:
吸水纸(定性滤纸)、25套直径90mm的培养皿、8个250ml三角瓶(或烧杯),8瓶500ml无菌水、8把大号镊子、8把解剖刀。
植物材料:
直根胡萝卜。
试剂:
95%乙醇、0.1%氯化汞(或次氯酸钠)。
培养基:
MS+1mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.8
4、实验步骤
(1)接种前,用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面,将培养基及接种用具放入超净工作台台面,打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯,照射
约30min,然后关闭紫外灯,通风20min后,打开日光灯即可进行无菌操作。
(2)外植体预处理:
将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净,用小刀削
去其表皮1-2mm,切成大约15-20mm厚的块段,置于250ml三角瓶或大烧杯中。
(3)双手用肥皂洗净,以70%乙醇棉将手擦试一遍。
以下操作全部在无菌条件下进行。
(4)外植体消毒:
将胡萝卜片放人已灭菌的250ml三角瓶(或大烧杯)
中,先用70%酒精对胡萝卜消毒5min,然后将酒精倒掉,再用0.1%的
升汞消毒10min-12min(或用30%的次氯酸钠的消毒液将植物材料淹没
浸泡约30分钟),倒掉消毒液,然后用无菌水中漂洗3次,每次2分钟,
洗时不断摇动三角瓶以确保完全除去消毒液。
(5)将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中,一手用消毒好的镊子固定胡萝卜,一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分,
余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm,厚约1mm的小片。
在完成
切割后,将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下,在酒精灯焰上灼烧
灭菌之后,放回原处,待冷却后即可使用。
注意:
在每一次使用镊子、解剖刀后,都要对其消毒一次。
(6)接种:
在酒精灯焰附近处,取下三角瓶的封口膜,用火烧灼瓶口。
用无菌镊子夹取胡萝卜薄片并迅速半插入琼脂培养基上,每瓶放4-5片,注意将近根尖的一面接触培养基。
将培养瓶口在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒,立即用封口膜封好瓶口。
(7)培养:
将接种后的三角瓶放到光照培养箱中,在25℃下的黑暗中培养3-4周。
(1)接种1周-10天后,调查、计算污染率:
污染率(%)=污染的材料数/接种材料数×
100%
(2)每周观察并记录胡萝卜外植体产生愈伤组织的情况,包括出现愈伤组织前培养物的形态,愈伤组织出现的时间以及愈伤组织的形态特征(愈伤组织的颜色、质地等),4周后调查、计算愈伤组织诱导率:
诱导率(%)=形成愈伤组织的材料数/接种材料数×
(1)分析影响愈伤组织诱导的主要因素。
(2)以胡萝卜为材料为什么要强调要切取含有形成层部分,胡萝卜其它部分(如茎、叶、花)能否诱导出愈伤组织?
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