结核病诊断技术Word格式.docx
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第二节标本的采集、运送和保存
初诊患者应送3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰)。
如无夜间痰,在留取清晨痰后2~3h再留取1份痰标本,或在送检时,留取2份即时痰。
疗程中或复诊随访患者按期每次送检2份痰(清晨痰和夜间痰)。
一、痰标本的采集
1.即时痰为病人就诊时咳出的痰液;
清晨痰为就诊当天清晨深咳出的痰液;
夜间痰为就诊前夜咳出的痰液。
合格的痰标本应是脓样、干酪样或脓性黏液样痰液,痰量应为3~5ml。
2.痰标本应由检验人员或经培训合格的专人验收,痰液不合格者,要求重新送检。
难以获得合格标本时,也应进行细菌学检查,但应注明标本性状,以便分析结果时参考。
3.留取痰标本的容器应为广口、直径4cm、高2cm、有盖密闭的塑料盒或蜡纸盒,容器上应注明患者姓名、编号(门诊序号或患者登记号)及送检日期。
二、痰标本的保存和运送
留取痰标本后,应将容器密封,切勿倒置,严防痰液外溢。
需外送检查的标本应认真核对痰盒上的标注是否正确清晰,是否与检验单一致,痰容器应采用专用的冰盒,或以纸张和塑料袋封装、扎牢,顺序放置于包装袋内,注明盒盖向上的标示,严防运送途中倒置。
当天不能检查的痰标本须置4℃冰箱保存。
三、其他标本的采集、运送和保存
1.尿液及胸、腹水标本留全量夜尿或胸、腹水,静置4~5h后,弃上清液,取沉淀部分至少10ml送检。
2.大便、脓液、病灶组织或干酪块、脑脊液标本应至少留取或采集2~3ml(g),采集后立即送检。
3.标本运送和保存可参考本节痰标本的保存和运送。
第三节涂片检查法
一、玻片的准备
取经95%乙醇擦拭脱脂的干燥、清洁、无油污、无划痕的新玻片,于玻片背面的左端1/3处用玻璃笔编号。
一张玻片只能涂抹一份痰标本,每张玻片只能使用1次,不得清洗后再次用于抗酸染色检查。
二、直接涂片法
1.痰液及脓液用接种环或专用竹签挑取标本的脓样、干酪样部分0.05~0.1ml,于玻片正面的右侧2/3中央处均匀涂抹成2cm×
2.5cm椭圆形痰膜,自然干燥。
2.病灶组织或干酪块先用组织研磨器磨碎后再行涂片。
3.尿液及胸、腹水标本留全量夜尿或胸、腹水,静置4~5h后,弃上清液,取沉淀部分约10ml,经6000~8000r/min(6000~8000rpm)离心20min,取沉渣涂片。
4.脑脊液无菌操作收集脑脊液,放置冰箱或室温24h,薄膜形成后涂片。
也可将脑脊液经6000~8000r/min离心20min,弃上清液,取沉淀物涂片。
5.粪便标本与生理盐水混匀后,充分振荡使之成为混悬液;
定性滤纸过滤后,滤液经6000~8000r/min离心20min,取沉淀涂片检查。
6.咽喉棉拭子棉拭子放入无菌试管,加入适量生理盐水浸泡,并强烈振荡,取出棉拭子后,液体经6000~8000r/min离心20min后,取沉淀涂片检查。
三、集菌涂片法
1.漂浮集菌法取深咳痰或12~24h痰液经121℃高压灭菌15min,待冷却后,取5~10ml盛于容积为100ml的玻璃容器中(口径约2cm),加灭菌蒸馏水20~30ml,总体积勿超过容器的1/3,加二甲苯0.3ml,放振荡器振荡10min,取出,加蒸馏水至满瓶口,将已编号的载物玻片盖于瓶口上,静置20min,取下载玻片,自然干燥,火焰固定,染色镜检。
2.离心集茵法取深咳痰或12~24h痰液经121℃高压灭菌15min,待冷却后,取5~10ml盛于容积为500ml的离心管中,加水至50ml,经6000~8000r/min离心20min后,取沉淀涂片检查。
四、染色、镜检方法
(一)萋尔一尼尔逊抗酸染色法
萋尔一尼尔逊(Ziehl—Neelsen)抗酸染色法,简称萋一尼氏染色法。
1.染色液
染色剂——0.8%苯酚(石炭酸)复红溶液
脱色剂——5%盐酸乙醇液
复染剂——0.3‰亚甲蓝溶液
2.染色步骤
(1)涂片自然干燥后,火焰固定。
(2)滴加复红染色剂盖满痰膜,小心火焰加热,出现蒸汽后脱离火焰,保持染色3min。
染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖,必要时可续加染色液。
加温时勿使染色液沸腾。
(3)流水自玻片背面上端轻洗,洗去染色液。
(4)自痰膜上端外缘滴加脱色剂,流过痰膜,须脱至痰膜无可视红色为止。
脱色应单片进行。
(5)流水自玻片背面上端轻洗,洗去脱色液。
(6)滴加亚甲蓝复染剂,染色30s。
(7)流水自玻片背面上端轻洗,洗去复染液。
(8)待干后镜检。
3.镜检与报告
(1)用双目光学显微镜(目镜10×
,油镜100×
)镜检,在淡蓝色背景下,抗酸杆菌呈红色,其他细菌和细胞呈蓝色。
(2)按照下列标准报告镜检结果
①抗酸杆菌阴性
(一):
连续观察300个不同视野,未发现抗酸杆菌。
②报抗酸杆菌数:
1~8条抗酸杆菌/300视野。
③抗酸杆菌阳性(1+):
3~9条抗酸杆菌/100视野。
④抗酸杆菌阳性(2+):
1~9条抗酸杆菌/10视野。
⑤抗酸杆菌阳性(3+):
1~9条抗酸杆菌/每视野。
⑥抗酸杆菌阳性(4+):
≥10条抗酸杆菌/每视野。
(二)荧光染色法
(1)染色剂:
0.1%金胺“O”(AuramineO)溶液
(2)脱色剂:
3%盐酸乙醇液
(3)复染剂:
0.5%高锰酸钾水溶液
(1)涂片自然干燥,经火焰固定。
(2)加染色剂10~15min,水洗。
(3)加脱色剂1~2min至无黄色,水洗。
(4)加复染剂1~2min,水洗,待干镜检。
(1)在暗色背景下,抗酸杆菌呈黄绿色或橙色荧光。
必须用40×
物镜确认菌体形态,应具有萋一尼氏抗酸染色镜检经验后,方可应用荧光染色法,荧光法难以确认时,应进行萋一尼染色检查,以免错判或漏判。
荧光染色后涂片应在24h内检查,如须隔夜,置4℃保存,次日完成镜检。
(2)物镜20×
检查结果按下列标准报告
①荧光染色抗酸杆菌阴性
(一):
0条/50视野。
②报荧光染色抗酸杆菌数:
1~9条/50视野。
③荧光染色抗酸杆菌(1+):
10~99条/50视野。
④荧光染色抗酸杆菌(2+):
1~9条/每视野。
⑤荧光染色抗酸杆菌(3+):
10~99条/每视野。
⑥荧光染色抗酸杆菌(4+):
≥100条/每视野。
物镜40×
检查细菌细胞形态。
五、涂片检查法质量控制
应建立室内、室间痰片检验质量控制制度。
室内质控应包括痰标本收集、痰片染色和镜检结果复验。
室内质控应每季度进行1次,痰涂片应保存供上一级参比实验室(或质控机构)质量控制检查。
室间质控可定期进行,阳性痰涂片符合率应≥98%,阴性痰涂片符合率应≥96%,(1+)以上的阳性片不允许出现假阴性。
六、废弃标本和污染物的处理
痰盒和废弃标本等污染物,均须经高压蒸汽灭菌后才能丢弃或清洗,严禁不经灭菌随意处理。
痰盒等污染物如采用焚烧处理,须置于焚烧炉内彻底焚化。
焚烧不彻底或暴露焚烧是有害的。
痰检工作面的消毒:
可将痰标本置于一搪瓷盘中,在操作橱内进行痰涂片操作。
操作完毕后将盘与废弃物一并进行高压蒸汽灭菌,或与操作台面同时以3%苯酚(石炭酸)或其他可靠消毒液擦拭后,再以紫外线灭菌灯(距离≤1.2m)照射30min。
附录1:
萋-尼氏染色试剂的配制
1.8%苯酚复红染色剂碱性复红乙醇贮存液(碱性复红8g,溶于95%乙醇100m1中)10ml,加5%苯酚水溶液至100ml,混匀。
2.5%盐酸乙醇脱色剂浓盐酸5ml加95%乙醇至100ml,混匀。
3.0.3‰亚甲蓝复染剂亚甲蓝0.3g加95%乙醇50ml待溶解后,加蒸馏水至100ml,混匀,即为贮存母液,使用时10倍稀释。
附录2:
荧光染色试剂的配制
1.1%金胺“O”染色液金胺“O"
0.1g溶于95%乙醇10ml内,加5%苯酚至100ml,混匀。
2.3%盐酸乙醇脱色液浓盐酸3ml加95%乙醇至100ml,混匀。
3.0.5%高锰酸钾复染液0.5g高锰酸钾加蒸馏水至100ml,混匀。
第四节分枝杆菌分离培养检查法
分枝杆菌属(Mycobacterium)迄今报道有100多个种。
《伯杰系统细菌学手册》将分枝杆菌菌种划分为两大类:
缓慢生长分枝杆菌与快速生长分枝杆菌。
在营养丰富的培养基上,接种很稀的新鲜培养物,在适宜培养温度下。
7d以上肉眼可见单个菌落,称为缓慢生长分枝杆菌,其代表菌种是结核分枝杆菌(M.tuberculo—sis)。
在上述条件下,7d以内肉眼可见单个菌落,称为快速生长分枝杆菌。
分枝杆菌属,除结核分枝杆菌复合群(结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)及麻风分枝杆菌外,余者统称为非结核分枝杆菌(NontuberculosisMyco—bacteria,NTM)。
结核分枝杆菌是专性需氧菌,最适生长温度为37℃,最适pH为6.5~7.2。
对营养要求较高,专嗜甘油作为碳源,天门冬酰胺是最好氮源。
分枝杆菌分离培养检查法,是结核病确诊最可靠的方法。
是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生物学研究的基础。
一、培养基
分离培养基采用酸性改良罗氏培养基。
(一)成分
谷氨酸钠(纯度99%以上)
7.2g
磷酸二氢钾(KH2PO4)
14.0g
硫酸镁(MgSO4·
7H2O)
0.24g
柠檬酸镁
0.6g
丙三醇
12ml
马铃薯淀粉
30g
蒸馏水
600ml
新鲜全卵液
1000ml
2%孔雀绿水溶液
20ml
注1:
无机盐试剂应采用化学纯(CP)以上等级的试剂。
注2:
WHO在“结核病控制实验室工作手册(1998)”中建议分离培养使用无淀粉的改良罗氏培养基。
(二)制备方法
1.基础液制备量取蒸馏水600ml,加入各无机盐成分、谷氨酸钠和丙三醇,溶解后加马铃薯淀粉,混匀,沸水浴1h使呈糊状(不时摇动,防凝块),冷却。
2.新鲜鸡卵液制备洗净新鲜鸡卵表面,浸泡在70%乙醇或其他稀释消毒液中20~30min。
取出,拭干,开口,收集鸡卵液,搅匀。
通过消毒的纱布过滤成鸡卵液。
3.培养基制备将600ml基础液和1000ml新鲜鸡卵液混匀。
加入2%孔雀绿水溶液20ml,混匀,静置1h后,分装至标准螺旋盖培养管或灭菌中试管中,每管7ml。
双层放置于搁架中,经培养基蒸汽凝固灭菌器85℃凝固灭菌50min。
培养基斜面应占试管的2/3。
制成的培养基应斜面鲜艳,表面光滑,有一定韧性和酸碱缓冲能力。
4.培养基保存制成的培养基经37℃无菌试验24h,检查培养基污染情况后置4℃避光保存,1个月内使用。
二、去污染处理
(一)痰标本
视标本性状,加1~2倍体积4%氢氧化钠(NaOH)消化液于痰瓶中,拧紧螺旋盖,涡旋振荡器上振荡1min,使痰液充分匀化,室温放置。
自加入氢氧化钠消化液起,整个处理时间应在15~20min。
样本份数较多时,应分批处理。
(二)其他标本
1.脓液采用4%硫酸(H2SO4)处理。
标本与4%硫酸(H2SO4)以1:
3混匀后,静置25min(其间振荡数次),按无菌手续接种0.1ml经处理的标本至L—J培养基,每份标本接种2支培养基。
酸处理去污染时间不超过25min。
2.病理组织或干酪块标本切碎后置于无菌组织研磨器,加入适量(0.5~1容积)生理盐水后充分研磨成混悬液;
混悬液经3000r/min离心30min后,沉淀物进行碱处理[与2~4倍量2%氢氧化钠(NaOH)混合,处理15min]后接种。
3.尿液留全量夜尿,静置4~5h,取沉淀部分约10ml,3000r/min离心30min,取沉淀进行碱处理[与等倍量4%硫酸(H2SO4)混合,处理15min]后接种。
4.胸、腹水、支气管灌洗液标本参照痰标本处理方法。
5.脑脊液无菌操作收集的脑脊液,置冰箱或室温24h,待薄膜形成后将薄膜接种到L—J培养基;
或将脑脊液在无菌操作环境中3000r/min离心30min,取沉淀直接接种到L-J培养基。
非无菌操作采集的脑脊液标本,离心后的沉淀进行碱处理[与等倍量4%氢氧化钠(NaOH)混合,处理10~15min]后接种于酸性L-J培养基。
6.粪便标本与生理盐水混合后,充分振荡使之成为混悬液;
定性滤纸过滤后,滤液经3000r/min离心10min;
沉淀进行酸处理[与2~4倍量的4%硫酸(H2SO4)混合,处理15~20min)后接种L-J培养基。
7.咽喉棉拭子将棉拭子放入一无菌试管,加入适量生理盐水浸泡,加入等体积4%氢氧化钠(NaOH)后强烈振荡,静置15min后接种。
三、接种和培养
用吸管取去污染后的标本0.1ml,均匀接种在整个培养基斜面,每份标本接种2支酸性罗氏培养基。
接种后斜面向上于37℃环境中平放24h后,检查培养基污染情况,拧紧瓶盖,直立放置,37℃继续培养。
四、结果报告
1.接种后第3、7天各观察1次菌落生长情况。
发现菌落生长者,经抗酸染色证实后,可报告快速生长分枝杆菌阳性。
此后每周观察1次,记录菌落生长及污染情况。
阳性生长物经抗酸染色证实后,可报告分枝杆菌生长。
满8周后未见菌落生长者方可报告培养阴性结果。
2.观察时发现非分枝杆菌生长时,应报告污染。
培养污染率应在2%~5%范围内。
污染率过高,提示培养基灭菌不佳,标本前处理、接种等环节有误,应当分析原因,采取相应措施。
3.培养结果报告方式
(1)分枝杆菌培养阴性:
斜面无菌落生长,以“培养阴性”报告,不可以“一”表示。
(2)分枝杆菌培养阳性(1+):
菌落生长占斜面面积的1/4。
(3)分枝杆菌培养阳性(2+):
菌落生长占斜面面积的1/2。
(4)分枝杆菌培养阳性(3+):
菌落生长占斜面面积的3/4。
(5)分枝杆菌培养阳性(4+):
菌落生长布满整个斜面。
(6)报实际菌落数:
菌落生长不足斜面面积1/4。
第五节分枝杆菌快速培养检查
分枝杆菌快速培养检查是使用分枝杆菌快速培养仪,通过测定细菌生长代谢检测分枝杆菌生长情况的方法。
由于应用营养丰富的液体培养基,并且检测仪能连续监测,故提高了从标本中分离分枝杆菌的敏感性进而缩短报告结果的时间。
为保证检查方法的可靠性,目前分枝杆菌快速培养检查系统除提供相应仪器、试剂以外,均根据不同系统制定了相应的临床标本前处理、接种、检测和报告结果的规程,故在进行相应的检查时,结果的可重复性和可比性均能得到认可。
在进行分枝杆菌快速培养检查时,标本接种前的去污染处理,必须严格按照系统说明书中规定的方法进行。
孵育检测过程中系统报告阳性时,相应标本的培养液必须首先进行抗酸染色镜检,发现抗酸菌后方可发出阳性报告。
第六节分枝杆菌药物敏感性测定法
(一)基础培养基
无淀粉改良罗氏培养基:
7.2g
磷酸二氢钾(KH2PO4)
2.4g
0.24g
柠檬酸镁
丙三醇
蒸馏水
新鲜全卵液
2%孔雀绿水溶液
注:
无机盐试剂应达到化学纯(CP)以上等级。
(二)抗结核药物溶液的配制和稀释
1.药敏试验用抗结核药物应从厂家取得纯品,并确认纯度和效价,在有效期内使用。
2.异烟肼(INH)、利福平(RFP)、氨硫脲(TBl)、乙硫异烟胺(TH)、环丝氨酸(SC)的生物效价按其重量单位计算,计算用药量时只需考虑其纯度。
链霉素硫酸盐(SM—SO4)、乙胺丁醇盐酸盐(EMB—C1)、卡那霉素硫酸盐(KM—SO4)、卷曲霉素硫酸盐(CPM—SO4)、紫霉素硫酸盐(VM—SO4)、对氨水杨酸钠盐(PAS-Na)等在考虑其纯度的同时,应按生产厂家标定的毫克效价计算其盐型药用量。
3.加入培养基中实际药量的计算可参考下列公式:
上述公式中各变量的单位:
实际药量:
mg
效价:
%
培养基内药物终浓度:
μg/ml
纯度:
需制备培养基体积:
ml
4.绝对浓度法每种药物按表2-1制成高浓度药液,再按相应比例稀释成低浓度药液。
5.比例法按表2-2所述浓度制备药物储存液,分装至无菌试管,每管5~10ml,封口,一20℃保存,3个月内使用。
6.除RFP、TBl、TH用二甲基甲酰胺溶解,再用灭菌蒸馏水稀释外,其他药物可用灭菌蒸馏水溶解、稀释。
(三)含药培养基制备
1.每100ml基础培养基加入1ml配制、稀释好的抗结核药液,混匀,无菌分装每管7ml,85℃凝固50min。
2.制成的培养基37℃无菌试验24h,检查培养基污染情况后置4℃避光保存,1个月内使用。
二、药敏试验方法
(一)绝对浓度法间接法
1.菌悬液制备
(1)临床分离分枝杆菌的新鲜培养物(初生长2周)无须二次传代即可做药敏试验,初生长2周以后和贮存培养物须在改良罗氏培养基上二次传代,取2~3周的亚培养物进行试验。
(2)取上述培养物(须刮取斜面各个部分的培养物)置于玻璃磨菌器底部,插入磨菌棒捻动使呈乳酪样,以0.5%聚山梨醇-80(吐温-80)生理盐水磨菌稀释,与标准麦氏比浊管(MacFarlandNo.1)比浊,即配成1mg/ml的菌悬液。
2.接种将1mg/ml的菌悬液10倍稀释至0.01mg/ml(10^-2mg/ml),以灭菌吸管准确吸取菌液0.1m1分别接种于含药培养基和对照培养基斜面上,每管接种菌量为1O^-3mg。
置37℃培养,4周后观察结果。
3.结果报告按下列方式报告对照及含药培养基上菌落生长情况。
斜面无菌落生长。
(6)报告菌落数:
培养基斜面上菌落数少于20个时。
4.质量控制
每批试验应以结核分枝杆菌参考菌株(H37Rv敏感株)10^-3mg检测含药培养基质量。
接种10^-3mg要求对照培养基菌落数在200个以上且无融合,若菌落数低于50个时,要求重新做药敏试验。
(二
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