affymetrix芯片实验手册Word格式文档下载.docx
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a.提取(用Invitrogen的TRIzol提取)
I.如果是TRIzol保存的细胞直接进行II步;
如果是组织,在液氮中研磨成粉末。
II.待液氮挥发干,立即加入TRIzol,每100mg组织加1mlTRIzol,融化后,用加样
枪反复吸吹,使样品充分裂解,移入1.5ml离心管中,室温静置3,5分钟。
III.在离心管中每1mlTRIzol起始量加200ul氯仿,振荡混匀。
IV.将离心管在4?
12000rcf,离心15分钟。
V.用移液器小心吸出上层水相,加入另一离心管中,每mlTRIzol起始量加入500ul
异丙醇。
VI.,20?
沉淀30min或过夜。
VII.4?
12000rcf,离心10分钟。
VIII.小心移出上清。
IX.沉淀中加入1mL75%乙醇,4?
X.重复用75%乙醇洗涤一次RNA沉淀。
XI.去上清,稍微晾干,RNA略显透明,加入适当体积(30ul)的RNase-free的水,
充分溶解。
2.定量和检测总RNA
a)紫外定量和检测
I.用紫外分光光度计检测RNA的产量,在260nm处的吸光度,1OD=40ug/ml。
II.根据在260nm和280nm处的吸光值,检测RNA的纯度,纯RNA的OD260/OD280
比值应接近2.0(比值最好在1.9,2.1之间)。
b)变性胶电泳质检
I.配制1.2%的电泳胶
10×
MOPSGelBuffer10ml
Agrose1.2g
RNase-FreeWater90ml
加热溶解Agrose,稍微冷却,加入
37%甲醛1.8ml
EB(10mg/ml)1ul
摇匀后倒胶,待胶冷凝后,置于电泳槽中,浸于1×
MOPSGelBuffer中平衡10分钟,待用。
II.样品变性
5×
LoadingBuffer2ul
RNA样品1ug
RNase-Freewater调节至10ul
在65?
,变性5分钟,立即置于冰上冷却。
III.电泳
将处理好的RNA样品,稍微离心,70V恒压电泳1小时。
在凝胶成像仪上观察结果。
2
3.纯化总RNA
QIAGEN的RNeasyMiniKit(总RNA量大于45ug)或MicroKit(总RNA量小于45ug)。
RNeasyMiniKit
I.将总RNA的体积用RNase-free的水调整到100ul,(因QIAGEN纯化柱的最大上样
量为100ugRNA,所以一般取RNA不大于100ug)。
II.加入350ulRLT工作液(1mlRLT中加10ul2-ME,混匀而成),充分混匀。
III.加入250ul无水乙醇,充分混匀(不要离心)。
IV.将混好的700ul样品加到QIAGEN纯化柱中,>
8000rpm,离心15秒。
V.弃滤液,加入500ulRPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成),>
8000rpm,
离心15秒。
VI.弃滤液,加入500ulRPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成),>
离心2分钟。
VII.将纯化柱放入一个新的收集管,最大转速,离心1分钟。
VIII.将纯化柱换入一个EP管中,在纯化柱膜中间加25ulRNase-free的水,室温放置1
分钟,最大转速,离心1分钟。
IX.将EP管中的样品移入一个新的EP管中。
RNeasyMicroKit
1将总RNA的体积用RNase-free的水调整到100ul。
2加入350ulRLT工作液(1mlRLT中加10ul2-ME,混匀而成),充分混匀。
3加入250ul无水乙醇,充分混匀(不要离心)。
4将混好的700ul样品加到QIAGEN纯化柱中,>
5弃滤液,加入500ulRPE工作液(一份RPE加入4份无水乙醇混匀而成),>
6弃滤液,加入500ul80%酒精,>
8000rpm,离心2分钟。
7将纯化柱放入一个新的收集管,打开盖子,最大转速离心5分钟。
8将纯化柱换入一个EP管中,在纯化柱膜中间加14ulRNase-free的水,室温放置
1分钟,最大转速,离心1分钟。
4.纯化总RNA的定量和检测
a紫外定量和检测:
总RNA的浓度和OD260/OD280。
b变性胶电泳质检:
3
二cDNA的合成和纯化
st1.1cDNA的合成(Affymetrixone-cyclecDNASynthesisKit)
a)Poly-ARNAcontrols的制备(用Poly-Acontroldilutionbuffer稀释Poly-A
controlstock),按照下面的比例稀释:
b)总RNA(1,8ug)
混匀,70?
温浴10分钟,置于冰上至少2分钟,离心片刻;
c)
混匀,42?
,温浴2分钟;
d)SuperScriptIIRT(200U/ul)2uL(8~16ug起始)
1uL(1~8ug起始)
e)混匀,42?
温浴1小时。
nd2.2cDNA的合成(Affymetrixone-cyclecDNASynthesisKit)
a)将1stcDNA合成产物置于冰上,加入下列试剂:
4
RNase-Freewater91ul
2ndStrandBuffer30ul
dNTP(10mM)3ul
E.coliDNALigase(10U/ul)1ul
E.coliDNAPolymerase(10U/ul)4ul
E.coliRNaseH(10U/ul)1ul
TotalVolume130ul
混匀,16?
,反应2小时;
b)加入2ulT4DNAPolymerase,混匀,16?
,5分钟;
c)加入10ulEDTA(0.5M),混匀,终止反应。
-20?
保存或进行下步纯化。
3.纯化cDNA(AffymetrixGeneChipSampleCleanupModule)
a)将600ulcDNABindingBuffer加入cDNA合成产物中,振荡混匀3秒。
b)将500ul液体移入cDNACleanupSpinColumn管中,不要振荡,>
=10000rpm,
室温离心1分钟,弃滤液。
c)将剩余液体移入cDNACleanupSpinColumn管中,不要振荡,>
=10000rpm,室
温离心1分钟,弃滤液。
d)换一个新收集管,加入750ulcDNAWashBuffer,最大转速离心1Min,弃滤液。
e)打开盖子,最大转速离心5Min,弃滤液。
f)将柱子转移至1.5mL的收集管中,加入14ul的cDNAElutionBuffer。
室温静
置1分钟,最大转速离心1分钟。
三cRNA的合成和纯化
1.IVT合成cRNA(GeneChipIVTLabelingKit)
TemplatecDNA12ul
RNase-Freewater8ul
IVTLabelingBuffer4ul
IVTLabelingNTPMix12ul
IVTLabelingEnzymeMix4ul
TotalVolume40ul
混匀,稍离心,37?
温浴16小时。
合成产物可保存在-20?
或直接进行下一步纯化。
2.纯化cRNA(GenechipSampleCleanupModule)
1加入60ulRNaseFree水,振荡混匀3’。
2加入350ulIVTcRNAbindingBuffer,振荡混匀3’。
5
3加入250ul无水乙醇,用加样枪混匀。
4将以上混合液加入cRNACleanupSpinColum,>
=10000rpm,离心15’,弃滤液。
5将柱子移至1.5mL的收集管,加入500ul的IVTcRNAWashBuffer,>
=10000rpm,
离心15’,弃滤液。
6加入500ul80%乙醇,>
7换一个收集管,打开盖子,>
=10000rpm,离心5min,弃滤液。
8将柱子转移至1.5mL的收集管,加入11ul的RnaseFree水,>
=10000rpm1min。
9加入10ul的RnaseFree水,>
cRNA的定量和检测
a.用紫外分光光度计测量cRNA的浓度和OD260/OD280:
b.变性胶检测cRNA:
取2ugcRNA在1.2%的变性胶上电泳,纯化的cRNA应该呈弥散状长条带。
6
a.校正cRNA浓度
根据公式:
[cRNA]×
V-M×
R[校正cRNA]=
V
[cRNA]:
cRNA的测量浓度;
V:
cRNA的洗脱体积;
M:
合成cRNA时所用总RNA的量;
R:
cRNA的回收得率;
[校正cRNA]:
cRNA校正后的浓度。
b.配制片段化反应体系
根据校正cRNA的浓度片段化(40ul):
cRNA15ug
FragmentationBuffer6ul
RNase-FreeWater补充至30ul
c.片段化
混匀,94?
温浴35分钟,之后置于冰上。
d.片段化cRNA的质检:
变性胶电泳质检,片段化cRNA约为35,200bp。
2.配制杂交液
根据芯片类型按下表配制适当量的杂交液:
配方300ul终浓度1片段化cRNA(0.5mg/ml)30ul0.05ug/ul2OligoB2对照(3nM)5ul50pM320×
Hybridizitioncontrol15ul1×
4鱼精DNA(9.3mg/ml)3.3ul0.1mg/ml5乙酰化BSA(20mg/ml)7.5ul0.5mg/ml62×
杂交Buffer150ul1×
7DMSO30ul8RNase-FreeWater59.2ul
7
五芯片杂交先进行测试芯片的杂交、洗染和分析,根据测试芯片的结果再杂交表达谱芯片。
1和2同时进行,直到第3步:
I.取出芯片,平衡至室温;
II.加入1×
杂交Buffer;
III.45?
,60rpm,预杂交10分钟。
I.杂交液混匀,离心片刻;
II.99?
,温浴5分钟;
III.将杂交液转至45?
IV.离心机最大转速离心5分钟。
I.吸出芯片中的1×
II.将杂交液加入到芯片中;
,60rpm,杂交16小时;
杂交结束后,吸出芯片中的杂交液,加入洗液A,进行后面的洗染过程。
六洗脱芯片在洗脱工作站上按照芯片类型,运行洗脱程序。
七扫描芯片扫描仪上扫描芯片。
八数据分析1(应用GCOS软件进行数据分析。
2(Normalization方法:
将芯片所有探针组的Signal从小到大排序,去掉最大的2,和
最小的2,后,将剩下探针组的平均信号值调整到500。
8
常用试剂配制
1电泳试剂
1)10xFAgelbuffer
MOPS41.9g
NaAc6.8g
EDTA(0.5M,pH8.0)20ml
NaOH调PH7.0,RNasefreeHO调至1000ml2
2)1XFAgelrunningbuffer(500ml)
10xFAgelbuffer50ml
37%甲醛(formaldehyde)10ml
RNasefreeHO440ml2
3)5Xloadingbuffer(10ml)
溴酚兰25mg
EDTA(0.5M,pH8.0)80ul
37%甲醛(12.5M)750ul
甘油2ml
甲酰氨(formamide)3.084ml
10xFAgelbuffer4ml
4)电泳槽冲洗液
NaOH2g
0.5MEDTA1ml
DIHO500ml2
5)Gel:
琼脂糖1.2g
10xFAgelbuffer10ml
DEPC水至100ml
凉后加入甲醛溶液1800ul
9
2杂交试剂
1)WashBufferA:
Non-StringentWashBuffer(6XSSPE,0.01%Tween-20)
For1,000mL:
300mLof20XSSPE
1.0mLof10%Tween-20
699mLofwater
Filterthrougha0.2µ
mfilter
2)WashBufferB:
StringentWashBuffer(100mMMES,0.1M[Na+],0.01%Tween-20)
83.3mLof12XMESStockBuffer(seeSection2,Chapter2forreagentpreparation)
5.2mLof5MNaCl
910.5mLofwater
Storeat2?
Cto8?
Candshieldfromlight
3)2XStainBuffer
(Final1Xconcentration:
100mMMES,1M[Na+],0.05%Tween-20)
For250mL:
41.7mLof12XMESStockBuffer
92.5mLof5MNaCl
2.5mLof10%Tween-20
113.3mLofwater
4)10mg/mLGoatIgGStock
Resuspend50mgin5mLof150mMNaClStoreat4?
C
Ifalargervolumeofthe10mg/mLIgGstockisprepared,aliquotandstoreat-20?
untiluse.Afterthesolutionhasbeenthaweditshouldbestoredat4?
C.Avoid
additionalfreezingandthawing.
5)12XMESStockBuffer(1.22MMES,0.89M[Na+])
64.61gofMEShydrate
193.3gofMESSodiumSalt
800mLofMolecularBiologyGradewaterMixandadjustvolumeto1,000mL.
ThepHshouldbebetween6.5and6.7.Filterthrougha0.2µ
mfilter.
10
6)SAPE溶液
ComponentVolumeFinalConcentration
2xMESstainbuffer600ul1x
20mg/mlAcetylatedBSA120ul2mg/ml
1mg/mlSAPE12ul10ug/ml
DIHO468ul---2
TotalVolume1200ul
分装两管备用
7)抗体溶液
2xMESstainbuffer300ul1x
20mg/mlAcetylatedBSA60ul2mg/ml
10mg/mlGoatIgGStock6ul0.1mg/ml
0.5mg/mlBiotinylatedantibody3.6ul3ug/ml
DIHO230.4ul---2
TotalVolume600ul
11
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